CN114058629B

CN114058629B - Zm00001d042263基因在调控玉米气孔发育中的应用

Info

Publication number: CN114058629B
Application number: CN202111353930.1A
Authority: CN
Inventors: 郭思义; 乔鑫; 宋纯鹏; 周玉森; 李莹; 孟博伦
Original assignee: Sanya Research Institute Of Henan University; Henan University
Current assignee: Sanya Research Institute Of Henan University; Henan University
Priority date: 2021-11-11
Filing date: 2021-11-11
Publication date: 2022-12-30
Anticipated expiration: 2041-11-11
Also published as: CN114058629A

Abstract

本发明涉及玉米基因工程技术领域，具体涉及Zm00001d042263基因在调控玉米气孔发育中的应用。所述的调控是指使玉米气孔密度和导度降低。所述应用包括：1)抑制玉米Zm00001d042263基因的活性；2)降低玉米表达Zm00001d042263基因编码的蛋白。通过抑制所述Zm00001d042263基因活性来可以制备耐旱、耐病玉米转基因玉米，对于探索玉米气孔的发育机制、改良玉米的抗病抗逆性、提高玉米水分利用效率等方面具有重要的理论意义和实际应用价值。

Description

Zm00001d042263基因在调控玉米气孔发育中的应用

技术领域

本发明涉及玉米基因工程技术领域，具体涉及Zm00001d042263基因在调控玉米气孔发育中的应用。

背景技术

气孔是植物与外界环境进行气体交换的重要孔径，由两个保卫细胞和临近两个副卫细胞控制张开或关闭的过程决定了气孔动力学的能力。气孔运动导致植物与外界环境能够进行水分和CO₂的交换，由此气孔复合体的正确形成对植物生长发育至关重要。

玉米属于禾本科单子叶植物，与以拟南芥为主的双子叶植物的气孔复合体相比较具有较大的不同，拟南芥气孔复合体由一对肾形的保卫细胞组成，而玉米气孔复合体由一对哑铃形的保卫细胞和其临近两侧倒三角状的副卫细胞组成。而这种结构上的不同也导致单双子叶植物在气孔发育过程和气孔动力学能力上存在较大的差异，因此对气孔复合体发育相关基因的研究具有十分重要的意义。

气孔复合体发育过程中受到多种外部因素和内在因子的影响。外部因素主要包括光照、温度、湿度、CO₂浓度等，内在因子主要是体内的各类激素和其他分子，包括分泌肽、受体、激酶、转录因子等。研究气孔发育过程的调控机制，能够使我们更好的理解气孔对于玉米抗逆性、适应性方面的重要作用，可为植物新品种培育及植物抗逆适应与改良提供新的途径和思路。

发明内容

本发明的目的之一在于提供Zm00001d042263基因(https://www.maizegdb.org/)在调控玉米气孔发育中的应用。该基因编码一个bHLH型转录因子，参与调控了气孔发育过程中保卫细胞母细胞纵向对称分裂后保卫细胞的形态建成，最终形成哑铃形的保卫细胞，从而形成完整的气孔复合体。具体而言，该基因参与调控了保卫细胞后期的形态建成，使其能够形成正常的哑铃形同时具有生物学功能的保卫细胞。

进一步的，所述的调控是指使玉米气孔密度和导度降低。所述应用包括：

1)抑制玉米Zm00001d042263基因的活性；或

2)降低玉米表达Zm00001d042263基因编码的蛋白。

Zm00001d042263突变(通过EMS诱变、转座子插入或基因编辑等技术手段)失活后，即玉米Zm00001d042263基因无法表达或蛋白翻译错误后，突变体(玉米Zm00001d042263基因突变体，即缺失玉米Zm00001d042263基因，本申请中命名为bzu5(bizui5)植株中保卫细胞绝大部分异常和副卫细胞部分异常的表型，保卫细胞形态建成出现异常，绝大部分不能形成哑铃形保卫细胞，只能形成不规则棒状保卫细胞，丧失正常生物学功能，从而减弱气孔动力学能力，导致玉米气孔密度和导度降低。

本发明的目的之三在于提供通过抑制所述Zm00001d042263基因活性来制备耐旱、耐病玉米转基因玉米的方法，通过基因沉默、基因抑制、基因敲除或定向基因突变技术使玉米中的Zm00001d042263基因失活，Zm00001d042263基因编码的蛋白水平降低，使玉米气孔密度降低。气孔密度和导度的降低，有利于减少水分的散失，从而提高玉米的水分利用效率，而在不显著影响CO₂吸收的前提下能够大大提高植物的碳同化能力。另一方面在面对外界生物胁迫的时候多是利用气孔的关闭进行防御，气孔密度和导度的降低间接的阻止病原菌通过气孔进入玉米体内造成更大的伤害，从而使玉米能够更好的抵御外界生物胁迫，提高植物的耐病性，最终获得植物抗性改良提升的植物新品种。

本发明的目的之四是提供由上述方法获得的生物材料在玉米改良育种、制种中的应用，进一步是通过上述方法获得的Zm00001d042263基因失活的玉米，与同种具有优良农艺性状的玉米进行杂交。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次发现Zm00001d042263突变可造成玉米气孔密度和导度降低，对于探索玉米气孔的发育机制、改良玉米的抗病抗逆性、提高玉米水分利用效率等方面具有重要的理论意义和实际应用价值。

附图说明

图1为玉米WT和bzu5-1突变体苗期表型观察；(A)在正常生长条件下，播种后约7天的玉米野生型和bzu5-1的植株表型，Scale bar＝1cm。(B-E)野生型和bzu5-1叶片观察，Scale bar＝1cm。(F)野生型和bzu5-1保卫细胞异常率统计(野生型n＝400，bzu5-1 n＝385)。(G)野生型和bzu5-1副卫细胞异常率统计(野生型n＝500，bzu5-1 n＝392)。(H)野生型和bzu5-1气孔导度测量(实验三次重复，每次材料数量n＝5)。

图2为bzu5-1突变体气孔发育过程观察；bzu5-1气孔发育过程不同时期细胞形态观察，发育异常主要发生在保卫细胞后期形态建成方面。生长两周三叶期的幼苗用于实验观察，细胞轮廓采用碘化丙啶(PI)染色，Scale bar＝10μm。

图3为bzu5-1(A)和bzu5-2(B)的PCR鉴定结果。

图4为Zm00001d042263等位突变体遗传验证；成熟叶片气孔表型观察，材料从左至右为，野生型B73、bzu5-1、野生型W22、bzu5-2和bzu5-1对应杂合体与bzu5-2对应杂合体杂交后代F1，Scale bar＝10μm。

图5为Zm00001d042263系统进化树和亚细胞定位分析；(A)Zm00001d042263系统进化树。(B)通过烟草瞬时转化观察Zm00001d042263亚细胞定位情况，激光激发光波长514nm，发射光波长620nm,Scale bar＝10μm。

图6为Zm00001d042263基因表达模式；玉米稳定转基因材料BZU5pro::BZU5-YFP荧光表达模式。激光激发光波长514nm，发射光波长620nm，细胞轮廓采用碘化丙啶(PI)染色，Scale bar＝10μm。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

生物材料：

突变体bzu5-1来自于由EMS(Ethyl methylsulfone)诱变玉米自交系B73创建的突变体库MEMD(http://www.elabcaas.cn/memd/)。本申请之前对于bzu5-1突变体基因并未确认，即bzu5-1突变体中具体为哪个基因发生突变是未知的。突变体bzu5-2来自于玉米MaizeGenetics Cooperation Stock Center(http://maizecoop.cropsci.uiuc.edu/)，实验证明为bzu5-1等位突变体。

实施例

由于本申请相关技术方案与相关突变体表型观察及相关基因鉴定、确认高度相关，因而就玉米Zm00001d042263基因突变体的表型异常发现及其突变基因Zm00001d042263基因的确认过程简要介绍如下。

将野生型和bzu5-1同时种在培养室塑料培养盒中，28℃条件下16h/8h光暗周期生长，待幼苗出土后进行观察，野生型幼苗生长正常，bzu5-1幼苗叶片出现黄化水化现象，到三叶期后停止生长，最终植株死亡(如图1A-1E)。对突变体bzu5-1叶片进行显微观察并统计分析，结果发现其气孔发育异常，具体表现为绝大部分保卫细胞异常和部分副卫细胞异常(如图1F和1G)。发明人通过测定野生型与突变体bzu5-1材料的气孔导度，发现突变体bzu5-1相较于野生型WT气孔导度极显著降低(如图1H)，这说明bzu5-1突变体明显降低了植株的气孔动力学方面的性能。

比较成熟叶片中气孔形态，发现突变体bzu5-1相较于野生型保卫细胞绝大部分异常，为棒状结构非哑铃形结构；进一步对突变体bzu5-1气孔发育过程不同时期进行观察，发现BZU5主要调控气孔复合体后期保卫细胞形态建成，与野生型比较，突变体中保卫细胞未能形成哑铃形形态，使其不具有正常气孔功能(如图2)。同时bzu5-1也存在部分副卫细胞异常表型。

综合以上结果可以看出，玉米基因BZU5对气孔复合体的发育至关重要。

(二)对玉米BZU5基因的定位及等位突变体遗传验证

利用DNA测序技术对bzu5-1突变体基因进行测序，结果表明：Zm00001d042263基因发生了突变，由于第二个外显子前内含子识别位点发生突变，导致基因转录发生可变剪切，从而使蛋白发生移码翻译，形成了错误无功能蛋白。

与此同时，通过Maize Genetics Cooperation Stock Center(http://maizecoop.cropsci.uiuc.edu/)订购了Zm00001d042263基因转座子插入突变体。通过转座子突变体鉴定发现Zm00001d042263基因转座子插入纯合突变体表现出与bzu5-1类似的气孔发育表型，故命名为bzu5-2。对bzu5-1和bzu5-2 PCR鉴定，结果如图3所示，bzu5-1测序结果显示碱基A突变为A/C套峰，植株为Zm00001d042263基因杂合突变体，bzu5-2鉴定PCR结果显示样品1、2、3为Zm00001d042263基因杂合突变体，样品4为野生型，样品5为Zm00001d042263基因纯合突变体。

突变体bzu5-1鉴定引物：

bzu5-1-PCR-F：CGGTCACATCCTAAGAACAC，如SEQ ID NO.1所示；

bzu5-1-PCR-R：TTCTTCAGGCACCATTCCAG，如SEQ ID NO.2所示；

突变体bzu5-2鉴定引物：

bzu5-2-PCR-F：TCCGCCTTCCACGACTTCAG，如SEQ ID NO.3所示；

bzu5-2-PCR-R：GAAATGACAAATCCCATAGC，如SEQ ID NO.4所示；

TIR6：TCCCCCCGGGTGTAACATCAGAGATTTTGAGACAC，如SEQ ID NO.5所示；

将鉴定得到的bzu5-1与bzu5-2对应的杂合突变体进行杂交，杂交后代F1中出现性状分离(卡方检验符合3:1，表1)，即分离出Zm00001d042263基因纯合突变体相同表型，故bzu5-1与bzu5-2为同基因等位突变体(如图4)。这一结果表明：bzu5-1与bzu5-2突变体的相关表型是由Zm00001d042263基因突变造成的。

卡方检验：

表1 bzu5-1与bzu5-2对应杂合体杂交后代分离群体拟合度检验

x² _0.95,1＝0.0039；x² _0.50,1＝0.15；^a实得数与预期数之间没有差别。

查x²值表，当n＝1时，x² _0.95,1＝0.0039；x² _0.50,1＝0.15，现计算所得x²＝0.0065，0.9<P<0.95。实得数与预期数之间没有显著差异，符合单基因3:1分离比。确定分离后代bzu5为单基因阴性遗传突变体。

(三)对Zm00001d042263基因的系统进化树构建、亚细胞定位和表达模式分析

发明人对Zm00001d042263基因进行系统进化树同源比对分析发现，Zm00001d042263基因是拟南芥AT3G26744和AT1G12860在玉米中的同源基因(如图5A)。

发明人进一步构建了pCM3300(中国农业大学郭岩教授赠送)骨架的含自身启动子的荧光表达载体BZU5pro::BZU5-YFP，构建步骤如下：(1)用BamH I和Sac I酶切处理载体pCM3300，回收线性载体备用。(2)设计引物pCM3300-BamH1-BZU5p2K-F和BZU5-R-YFP以玉米gDNA为模板扩增含Zm00001d042263基因启动子和基因组DNA的片段，并随引物在扩增片段上携带上游pCM3300和下游YFP序列同源接头。(3)用引物BZU5-YFP-F和YFP-R-Sac I-pCM3300扩增含YFP的片段，并随引物在扩增片段上携带上游BZU5和下游pCM3300载体同源接头。(4)利用商业化的

MultiS One Step Cloning Kit(C113-02，http://www.vazyme.com/)将pCM3300线性载体、启动子基因组片段和YFP片段同源重组，获得pCM3300的重组载体BZU5pro::BZU5-YFP。

pCM3300-BamH1-BZU5p2K-F：tcacgtgggcgcgccggatccCGGGGAGCGTCCGAGAGG，如SEQID NO.6所示；

BZU5-R-YFP：tggatcccatCATTGCGTTGTGGAGGCC，如SEQ ID NO.7所示；

BZU5-YFP-F：caacgcaatgATGGGATCCACCATGGTGAGC，如SEQ ID NO.8所示；

YFP-R-Sac I-pCM3300：cgatcggggaaattcgagctcTTAGTACAGCTCGTCCATGCCG，如SEQID NO.9所示。

通过烟草瞬时转化，得到Zm00001d042263蛋白的亚细胞定位(如图5B)，观察结果显示Zm00001d042263蛋白定位于细胞核，这与转录因子的蛋白身份相一致。

另外通过转入玉米受体自交系B104中获得玉米稳定转基因材料，通过碘化丙啶(PI)着色细胞轮廓后，观察融合蛋白的荧光信号以确认BZU5蛋白的表达模式(如图6)，结果显示BZU5蛋白主要是气孔发育过程的气孔系细胞表达，在保卫细胞母细胞纵向对称分裂后，保卫细胞后期形态建成时期表达量最高，这在时空上也与自身调控气孔发育的事实相吻合。玉米遗传转化(BZU5pro::BZU5-YFP)由北京博美兴奥科技有限公司完成。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 河南大学

<120> Zm00001d042263基因在调控玉米气孔发育中的应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cggtcacatc ctaagaacac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttcttcaggc accattccag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tccgccttcc acgacttcag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaaatgacaa atcccatagc 20

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tccccccggg tgtaacatca gagattttga gacac 35

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcacgtgggc gcgccggatc ccggggagcg tccgagagg 39

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tggatcccat cattgcgttg tggaggcc 28

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caacgcaatg atgggatcca ccatggtgag c 31

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgatcgggga aattcgagct cttagtacag ctcgtccatg ccg 43

Claims

1.Zm00001d042263基因在调控玉米气孔发育中的应用，其特征在于，所述应用包括：抑制玉米Zm00001d042263基因的活性使保卫细胞形态建成出现异常，部分保卫细胞不能形成哑铃形保卫细胞，只能形成不规则棒状保卫细胞，丧失正常生物学功能，从而减弱气孔动力学能力，导致玉米正常气孔密度和导度降低。

2.通过抑制权利要求1中所述Zm00001d042263基因活性来制备耐旱、耐病玉米转基因玉米的方法，其特征在于，通过基因沉默、基因抑制、基因敲除或定向基因突变技术使玉米中的Zm00001d042263基因失活，使玉米气孔密度和导度降低，减少水分散失和阻止病原菌通过气孔进入。