CN114057858A - 对引起神经变性和神经退行性疾病的蛋白聚集具有解聚作用的多肽 - Google Patents

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Abstract

本文公开了一种对引起神经变性和神经退行性疾病的蛋白聚集具有解聚作用的的多肽，该多肽包含如下通式I的氨基酸序列：X1X1RQQX2PX1VVPDDSG，其中，X1为E，或D，或K，或R；X2选自任意氨基酸残基。本文所述的多肽对FUS蛋白、TDP‑43蛋白、TIA1蛋白以及C9orf72蛋白的聚集具有明显的解聚作用，其可应用于预防、缓解和治疗由蛋白聚集引起的神经变性、神经退行性病症。

Description

对引起神经变性和神经退行性疾病的蛋白聚集具有解聚作用 的多肽
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体而言，本发明涉及一种对引起神经变性和神经退行性疾病的蛋白聚集具有解聚作用的多肽，以及编码该多肽的多核苷酸、包含该多核苷酸的载体和宿主细胞，其中，所述蛋白选自FUS蛋白、TDP43蛋白、TIA1蛋白和C9orf72蛋白。本发明还涉及所述多肽在预防、缓解和治疗由蛋白聚集引起的神经变性、神经退行性病症方面的应用。
背景技术
蛋白质的错误组装和聚集往往会导致多种疾病，特别是神经变性疾病和神经退行性疾病，包括阿尔兹海默病(Alzheimer′s disease)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis，简称ALS，一种运动神经元疾病)、帕金森病(Parkinson′s disease)、动脉粥样硬化痴呆等疾病，其中大部分疾病目前没有治疗方法。虽然这些疾病由不同的病因引起，但都具有共同的病理特点，即特定区域的蛋白聚集形成神经元内包涵体，如阿尔茨海默病患者脑中出现的老年斑、神经缠结；帕金森病患者多巴胺能神经元中残存的嗜酸性Lewy小体；肌萎缩性脊髓侧索硬化症患者脊髓和脑干神经元内的Bunina小体等。目前研究认为，这些神经元的变性、死亡以及包涵体的形成与蛋白形成的聚集物密切相关。
细胞里的某些蛋白具有“相分离”特性，即在不同条件下细胞内的蛋白质可从液态转变为胶体状，甚至进而形成不可逆的纤维体的固态状。随着相分离的研究逐渐增多，研究人员发现相分离在无膜器官的形成、信号转导、细胞骨架、超分子组装、基因的激活等扮演着功能，相分离异常可能导致疾病，如神经退行性疾病、肿瘤、衰老等。相分离与神经退行性疾病的发生发展密切相关，比如：在肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)中观察到FUS蛋白(fused in sarcoma/translocated in liposarcoma，简称为FUS/TLS)和hnRNPA1在ALS中形成液滴，液滴粘性逐渐变强，最终形成纤维状的固体，在ALS中异常沉积。
错误折叠的TDP-43蛋白(TAR-DNA结合蛋白43)是ALS中运动神经元死亡的重要原因，也是ALS以及FTLD重要病理学标记。Fawzi等研究表明，在正常情况下，TDP-43分子会浓缩为小液滴，该过程被称为“液-液相分离 (liquid-liquid phase separation)”。在这些液滴中，它们可以加工和运输RNA，随着细胞衰老，这种细胞质中逐渐积累的异常的TDP-43的液滴会加速细胞核中 TDP-43的清除，这一过程并使TDP-43蛋白质失去适当相分离行为形成损害细胞的聚合物，最终引起神经退行性疾病的发生。
FUS蛋白是一种多功能的DNA/RNA结合蛋白，主要定位于细胞核，且可以在细胞核与细胞质间穿梭。FUS蛋白在RNA的转录、RNA的剪接和microRNA 的加工等过程中发挥重要作用。但在细胞受到不利因素威胁时，蛋白定位发生紊乱，导致聚集。FUS蛋白病是一组致命性、累及多种神经元的神经退行性疾病，包括FUS相关的额颞叶变性病/痴呆(frontotemporal lobar degeneration/dementia,FTLD-FUS)和运动神经元疾病，如肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS-FUS)等。FUS蛋白的突变和聚集与两种神经退行性疾病有关：肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)和额颞叶变性(FTLD)。
TDP-43蛋白是一种多功能的DNA/RNA结合蛋白。TDP-43蛋白的相变聚集可能导致肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)的发生。此外，在ALS-关岛复合型帕金森痴呆、路易体痴呆、亨廷顿病、运动神经元疾病、额颞叶痴呆、帕金森病性痴呆等神经疾病的神经细胞和胶质细胞中，都发现TDP-43积聚。这些疾病统称为TDP-43蛋白病。
C9orf72基因中外显子1a和1b之间的GGGGCC重复片段扩增被发现是肌萎缩侧索硬化(ALS)和额颞叶痴呆(FTD)的重要病因。C9orf72 GGGGCC重复扩增被认为与蛋白质异常聚集密切相关。GGGGCC重复转录及反转录的RNA通过异常的RAN翻译模式(重复序列相关非ATG模式)翻译出二肽重复蛋白 (DPR)GA、GR、GP、PA、GP、PR聚合物。这些蛋白在神经细胞内异常聚集产生神经毒性。DPR聚合物广泛存在于C9orf72阳性的大脑皮层、小脑及海马神经元细胞内。目前已经有多项实验证明DPR可引起神经退行性病变。有实验发现，在缺乏RNA灶的初级神经元细胞GA聚合物的表达可破坏蛋白酶体的活性诱发内质网氧化应激产生神经毒性。另外有研究认为GA聚合物可诱导毒性淀粉样蛋白在细胞内异常聚集并以类似朊病毒感染的方式在细胞间传播。PR、CR 聚集物也参与神经损伤过程。在中枢神经系统胶质细胞PR、GR聚集物重组可引起大量RNA加工改変产生神经毒性。
TIA1蛋白是一种3'UTR mRNA结合蛋白，可与5'TOP基因的5'TOP序列结合。它与程序性细胞死亡(细胞凋亡)相关，并调节编码Fas受体(一种促凋亡蛋白)的基因的选择性剪接。在应激条件下，TIA1定位于细胞RNA蛋白聚集物，称为应激颗粒。TIA1突变在ALS患者中频繁发生。当研究人员分析携带该突变的已故ALS患者的大脑组织时，发现一种被称为应激颗粒的含有TIA1的无膜细胞器在神经元中积累。当细胞经历高温、化学暴露和老化等压力刺激时，这些颗粒就会形成。相分离是一种蛋白质组装成被称为无膜细胞器的有序组合体的机制，是有序细胞功能所必需的。研究发现，这种ALS/FTD突变会产生TIA1 蛋白质的异常版本，TIA1蛋白质是此类无膜细胞器的构筑模块。因此，在ALS 中，这些蛋白质会聚合并杀死控制肌肉的神经元。在FTD中，则会积聚并杀死大脑中的神经元。研究人员指出，异常相分离也可能是阿尔茨海默病的基础。
因此，现有技术中亟需寻找和发现对病原性FUS蛋白和TDP43蛋白、 C9orf72蛋白和TIA1蛋白聚集具有解聚作用，但不影响这些蛋白质的生理功能的化合物，或者生物分子(包括多肽)，进而治疗上述多种神经变性或神经退行性疾病。
发明内容
一方面，本发明提供一种对引起神经变性和神经退行性疾病的蛋白聚集具有解聚作用的多肽，该多肽包含如下通式I的氨基酸序列：
X1X1RQQX2PX1VVPDDSG (I)
其中，X1为E，或D，或K，或R；X2选自任意氨基酸残基。
在一些实施方式中，所述蛋白选自FUS蛋白、TDP43蛋白、TIA1蛋白和 C9orf72蛋白。
在本发明的一些实施方式中，本发明的多肽的氨基酸序列为如下SEQ ID NO:17至SEQ ID NO:20中的任意一个序列或与SEQ ID NO:17至SEQ ID NO:20 中的任意一个序列具有至少90％，95％，或96％，或97％，或98％，或99％，或99.5％的序列一致性的序列：
EERQQTPEVVPDDSG(SEQ ID NO:17)，
DDRQQTPDVVPDDSG(SEQ ID NO:18)，
KKRQQTPKVVPDDSG(SEQ ID NO:19)，
RRRQQTPRVVPDDSG(SEQ ID NO:20)；
其中，在与SEQ ID NO:17至SEQ ID NO:20中的任意一个序列具有至少 90％，95％，或96％，或97％，或98％，或99％，或99.5％序列一致性的序列中，氨基酸残基Q不能被取代或缺失。
在本发明的一些实施方式中，在上述通式I的氨基酸序列的C端添加有如下通式II的氨基酸序列：
TFYDQTVSNDLX3 (II)
其中，X3为E，或D，或K，或R；或者/并且，在上述通式I的氨基酸序列的N端添加有如下通式III的氨基酸序列：
TX4PQX4X4SX4X4X4VX4X4P (III)
其中，X4为E，或D，或K，或R。
在本发明的一些示例性的实施方式中，所述对引起神经变性和神经退行性疾病的蛋白聚集具有解聚作用的多肽的氨基酸序列为如下SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4中的任意一个序列或与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4中的任意一个序列具有至少90％，95％，或96％，或97％，或98％，或99％，或99.5％序列一致性的序列：
TEPQEESEEEVEEPEERQQTPEVVPDDSGTFYDQTVSNDLE(SEQ ID NO:1)，或
TDPQDDSDDDVDDPDDRQQTPDVVPDDSGTFYDQTVSNDLD(SEQ ID NO:2)，或
TKPQKKSKKKVKKPKKRQQTPKVVPDDSGTFYDQTVSNDLK(SEQ ID NO:3)，或
TRPQRRSRRRVRRPRRRQQTPRVVPDDSGTFYDQTVSNDLR(SEQ ID NO:4)；
其中，在与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4中的任意一个序列具有至少90％， 95％，或96％，或97％，或98％，或99％，或99.5％序列一致性的序列中，氨基酸残基Q不能被取代或缺失。
在本发明的另一些实施方式中，上述通式I的氨基酸序列的N端可添加有具有如下通式IV的氨基酸序列：
(X1X1Q)n (IV)
其中，X1为E，或D，或K，或R；并且，n≥2。
在本发明的另一些示例性的实施方式中，所述对引起神经变性和神经退行性疾病的蛋白聚集具有解聚作用的多肽的氨基酸序列为如下SEQ ID NO:5至 SEQ ID NO:16中的任意一个序列或与SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:16中的任意一个序列具有至少90％，95％，或96％，或97％，或98％，或99％，或99.5％序列一致性的序列：
(EEQ)(EEQ)EERQQTPEVVPDDSG(SEQ ID NO:5)，
(EEQ)(EEQ)(EEQ)EERQQTPEVVPDDSG(SEQ ID NO:6)，
(EEQ)(EEQ)(EEQ)(EEQ)EERQQTPEVVPDDSG(SEQ ID NO:7)，
(DDQ)(DDQ)DDRQQTPDVVPDDSG(SEQ ID NO:8)，
(DDQ)(DDQ)(DDQ)DDRQQTPDVVPDDSG(SEQ ID NO:9)，
(DDQ)(DDQ)(DDQ)(DDQ)DDRQQTPDVVPDDSG(SEQ ID NO:10)，
(KKQ)(KKQ)KKRQQTPKVVPDDSG(SEQ ID NO:11)，
(KKQ)(KKQ)(KKQ)KKRQQTPKVVPDDSG(SEQ ID NO:12)，
(KKQ)(KKQ)(KKQ)(KKQ)KKRQQTPKVVPDDSG(SEQ ID NO:13)，
(RRQ)(RRQ)RRRQQTPRVVPDDSG(SEQ ID NO:14)，
(RRQ)(RRQ)(RRQ)RRRQQTPRVVPDDSG(SEQ ID NO:15)，
(RRQ)(RRQ)(RRQ)(RRQ)RRRQQTPRVVPDDSG(SEQ ID NO:16)；
其中，在与SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:16中的任意一个序列具有至少90％， 95％，或96％，或97％，或98％，或99％，或99.5％序列一致性的序列中，氨基酸残基Q不能被取代或缺失。
在本发明中，所述神经变性和神经退行性疾病包括下列病症中的一种或多种：额颞叶痴呆、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、皮质基底节变性、路易体痴呆、亨廷顿病、路易体病、运动神经元疾病、额颞叶变性、海马硬化、包涵体肌病、包涵体肌炎、帕金森病、嗜银颗粒病、阿尔茨海默病、纪伊半岛的帕金森-痴呆复合征、进行性核上性麻痹和匹克氏病。
另一方面，本发明还提供编码上文所述的对引起神经变性和神经退行性疾病的蛋白聚集具有解聚作用的多肽的多核苷酸；并且，本发明还提供包含所述多核苷酸的分离的表达载体以及宿主细胞。
又一方面，本发明还进一步提供用于预防、缓解或治疗由蛋白聚集引起的神经变性和神经退行性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的本文所述的多肽和药学上可接受的载体。所述蛋白选自：FUS蛋白、TDP-43蛋白、TIA1蛋白和C9orf72蛋白。所述神经变性和神经退行性疾病包括下列病症中的一种或多种：额颞叶痴呆、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、皮质基底节变性、路易体痴呆、亨廷顿病、路易体病、运动神经元疾病、额颞叶变性、海马硬化、包涵体肌病、包涵体肌炎、帕金森病、嗜银颗粒病、阿尔茨海默病、纪伊半岛的帕金森-痴呆复合征、进行性核上性麻痹和匹克氏病。
本文所述的治疗有效量是指足以改善由FUS蛋白聚集、TDP-43蛋白聚集、 TIA1蛋白聚集和/或C9orf72蛋白聚集引起的病症的活性成分多肽的量。这些药物的治疗功效可通过体外细胞培养或实验动物中的标准制药程序测定，例如， ED50(群体50％的治疗有效量)和LD50(群体50％的致死剂量)。治疗和毒性效应之间的剂量比是治疗指数，并且可以比率LD50/ED50表示。在本发明的一种实施方案中，在ALS和/或FTLD或其他FUS、TDP-43蛋白病的情况下，药物组合物中的治疗有效量为足以恢复或保持正常行为和/或认知特性的量。
在本文中，药学上可接受的载体指可用于本发明药物组合物中的任何稀释剂、赋形剂或载剂，包括离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白质(例如人类血清白蛋白)、缓冲物质(例如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐)、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯基吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段共聚物、聚乙二醇和羊毛脂等。可针对所打算施药的形式(例如，口服片剂、胶囊、酏剂、糖浆等)，与传统医药实践一致，来选择药学上可接受的载体。
本发明的药物组合物可通过本领域已知的方法来制备，例如传统的造粒、混合、溶解、囊封、冷冻干燥或乳化过程，将本发明的药物组合物制成各种合适的剂型，包括颗粒、微粒或粒子、粉末、注射液、乳液、悬浮液等。
此外，本发明的药物组合物还可根据需要与其他药物联合使用，例如安齐来、森福罗、息宁、盐酸罗匹尼罗片、泰舒达、善为、美多芭、咪多吡、金思平、达灵复、利培酮、奥氮平、石杉碱甲片等。
再一方面，本发明提供本文所述的多肽在制备用于预防、缓解或治疗由蛋白聚集引起的神经变性和神经退行性疾病的药物中的应用，所述蛋白选自：FUS 蛋白、TDP-43蛋白、TIA1蛋白和C9orf72蛋白。所述神经变性和神经退行性疾病包括下列病症中的一种或多种：额颞叶痴呆、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、皮质基底节变性、路易体痴呆、亨廷顿病、路易体病、运动神经元疾病、额颞叶变性、海马硬化、包涵体肌病、包涵体肌炎、帕金森病、嗜银颗粒病、阿尔茨海默病、纪伊半岛的帕金森-痴呆复合征、进行性核上性麻痹和匹克氏病。
再一方面，本发明还提供了本发明的多肽所制成的药物用于预防或治疗由 FUS蛋白聚集，或TDP-43蛋白聚集、TIA1蛋白聚集或C9orf72蛋白聚集引起的病症的方法，即根据常规程序给药治疗有效量的包含本发明多肽的药物来治疗人类和其它动物，以获得期望的药理学和/或生理学作用。所述神经变性和神经退行性疾病包括下列病症中的一种或多种：额颞叶痴呆、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、皮质基底节变性、路易体痴呆、亨廷顿病、路易体病、运动神经元疾病、额颞叶变性、海马硬化、包涵体肌病、包涵体肌炎、帕金森病、嗜银颗粒病、阿尔茨海默病、纪伊半岛的帕金森-痴呆复合征、进行性核上性麻痹和匹克氏病。
本发明的预防或治疗涵盖哺乳动物病症的任何预防或治疗，包括：(a)防止可能易患病症、但可能还未诊断出患有所述病症的个体患上所述病症；(b)抑制病症，终止病症的发展；或(c)减缓或改善病症。治疗还进一步包括全身性改善与病理学有关的症状和/或延迟症状的发作。
应理解，针对任一特定患者的具体剂量和治疗方案将由主治医师和临床因素确定。如医学领域所知的，任何一个患者的剂量取决于多种因素，包括患者的体型、身体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况以及同时施用的其他药物。通常的剂量可在，例如0.001至1000μg 的范围内(或用于在该范围内表达或抑制表达的核酸)；然而，可预见低于或高于该示例性范围的剂量，尤其是考虑到前述因素时。一般来讲，剂量可在例如约0.0001至100mg/kg、并且更通常地0.01至5mg/kg(例如，0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等)宿主体重的范围内。例如，剂量可为1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1至10mg/kg的范围内或至少 1mg/kg。上述范围中的剂量中值也预期处于本发明的范围内。受试者可每日、隔日、每周施用这样的剂量或根据由经验分析确定的任何其他计划表。示例性的治疗需要在长期例如至少六个月内施用多个剂量。附加的示例性治疗方案需要每两周一次或每月一次或每3至6个月一次施用。示例性的剂量计划表包括连续日的1-10mg/kg或15mg/kg、隔日30mg/kg或每周60mg/kg。进展可通过周期性评估监测。
在本文中，“蛋白”、“蛋白质”、“多肽”和“肽段”可互换使用。“氨基酸”可以以如下单个字母和三个字母的缩写进行表示。
Figure RE-GDA0002706708890000081
Figure RE-GDA0002706708890000091
附图说明
以下结合附图对本发明进行具体描述。
图1显示原核表达且纯化后的FUS-GFP蛋白、TDP43-GFP蛋白、 C9orf72-GFP蛋白以及TIA1-GFP蛋白的凝胶电泳图(考马斯亮蓝染色)。
图2A至图2C显示原核表达且纯化后的多肽TD-1至TD-20以及对照样品 TD-21至TD-24的凝胶电泳图(考马斯亮蓝染色)。
图3A显示原核表达且纯化后的FUS-GFP蛋白在体外被诱导形成的相分离液滴，通过共聚焦激光显微镜(Confocal)分别进行观察(其中，左图为荧光显微图像，中图为白光显微图像，右图为融合显微图像)，体外原核表达的FUS 蛋白在37℃、pH7.5、浓度10μM的条件下，具备形成典型的相分离液滴(发生聚集)的特性。
图3B显示原核表达且纯化后的TDP43-GFP蛋白在体外被诱导形成的相分离液滴，通过共聚焦激光显微镜(Confocal)分别进行观察(其中，左图为荧光显微图像，中图为白光显微图像，右图为融合显微图像)，体外原核表达的 TDP43-GFP蛋白在37℃、pH7.5、浓度2μM的条件下，具备形成典型的相分离液滴(发生聚集)的特性。
图3C和图3D分别显示原核表达且纯化后的C9orf72-GFP蛋白和TIA1-GFP 蛋白在体外被诱导形成的相分离液滴，体外原核表达的C9orf72-GFP蛋白和 TIA1-GFP蛋白在37℃、pH7.5、浓度10μM的条件下，具备形成典型的相分离液滴(发生聚集)的特性。
图4显示在发生蛋白聚集的FUS蛋白溶液(37℃、pH7.5、10μM FUS)中分别加入10μM多肽TD-1～TD-4和对照TD-21多肽之后，TD-1～TD-4、TD-21 多肽对FUS蛋白的聚集的影响。通过共聚焦激光显微镜(Confocal)分别进行观察，其中，左图为刚加入(0min)时的显微图像，中图为加入0.5min时的显微图像，右图为加入1min时的显微图像。
图5显示在发生蛋白聚集的TDP-43蛋白溶液(37℃、pH7.5、2μM TDP-43、 10％PEG)中分别加入10μM多肽TD-1～TD-4和对照TD-21多肽之后， TD-1～TD-4、对照TD21多肽对TDP-43蛋白的聚集的影响。通过共聚焦激光显微镜(Confocal)分别进行观察，其中，左图为刚加入(0min)时的显微图像，中图为加入0.5min时的显微图像，右图为加入1min时的显微图像。
图6显示在发生蛋白聚集的TIA1蛋白溶液(37℃、pH7.5、浓度10μM的条件下)中分别加入10μM TD-1～TD-4多肽以及对照TD-21多肽之后， TD-1～TD-4多肽和对照TD-21多肽对TIA1蛋白的聚集的影响。通过共聚焦激光显微镜(Confocal)分别进行观察，其中，左图为刚加入(0min)时的显微图像，中图为加入0.5min时的显微图像，右图为加入1min时的显微图像。
图7显示在发生蛋白聚集的C9orf72蛋白溶液(37℃、pH7.5、浓度10μM 的条件下)中分别加入10μM TD-1～TD-4多肽和对照TD-21多肽之后， TD-1～TD-4多肽和对照TD-21多肽对C9orf72蛋白的聚集的影响。通过共聚焦激光显微镜(Confocal)分别进行观察，其中，左图为刚加入(0min)时的显微图像，中图为加入0.5min时的显微图像，右图为加入1min时的显微图像。
图8显示在发生蛋白聚集的FUS蛋白溶液(37℃、pH7.5、10μM FUS)中分别加入10μMTD-5～TD-16以及对照TD-22～TD-24多肽之后，TD-5～TD-16以及对照TD-22～TD-24多肽对FUS蛋白聚集的影响。通过共聚焦激光显微镜 (Confocal)分别进行观察，其中，左图为未加入多肽时的显微图像，右图为加入1min时的显微图像。
图9显示在发生蛋白聚集的TDP-43蛋白溶液(37℃、pH7.5、2μM TDP-43、 10％PEG)中分别加入10μM TD-5～TD-16以及对照TD-22～TD-24多肽之后， TD-5～TD-16以及对照TD-22～TD-24多肽对TDP-43蛋白聚集的影响。通过共聚焦激光显微镜(Confocal)分别进行观察，其中，左图为未加入多肽时的显微图像，右图为加入1min时的显微图像。
图10显示在发生蛋白聚集的TIA1蛋白溶液(37℃、pH7.5、浓度10μM的条件下)中分别加入10μM TD-5～TD-16多肽以及对照TD-22～TD-24多肽之后， TD-5～TD-16多肽以及对照TD-22～TD-24多肽对TIA1蛋白聚集的影响。通过共聚焦激光显微镜(Confocal)分别进行观察，其中，左图为未加入多肽时的显微图像，右图为加入1min时的显微图像。
图11显示在发生蛋白聚集的C9orf72蛋白溶液(37℃、pH7.5、浓度10μM 的条件下)中分别加入10μM TD-5～TD-16以及对照TD-22～TD-24多肽之后， TD-5～TD-16多肽以及以及对照TD-22～TD-24多肽对C9orf72蛋白聚集的影响。通过共聚焦激光显微镜(Confocal)分别进行观察，其中，左图为未加入多肽时的显微图像，右图为加入1min时的显微图像。
图12A至图12D分别显示在发生蛋白聚集的FUS蛋白溶液、TDP-43蛋白溶液、TIA1蛋白溶液和C9orf72蛋白溶液中分别加入10μM TD-17～TD-20多肽之后，TD17至TD20多肽对FUS蛋白、TDP-43蛋白、TIA1蛋白和C9orf72蛋白聚集的影响。通过共聚焦激光显微镜(Confocal)分别进行观察，其中，左图为未加入多肽时的显微图像，右图为加入1min时的显微图像。
图13A和图13B显示了在进行热激处理的过表达FUS的SH-SY5Y细胞模型中分别加入TD-1多肽之后，TD-1多肽对SH-SY5Y细胞模型中的FUS蛋白聚集的影响。图13A中，上图为融合显微图像，中图为SH-SY5Y细胞标志物酪氨酸羟化酶(Tyrosine Hydroxylase)免疫荧光染色GFP荧光通道显微图像，下图为FUS蛋白mCherry荧光通道显微图像。
图13C和图13D显示了在进行热激处理的过表达TDP-43的SH-SY5Y细胞模型中分别加入TD-1多肽之后，TD-1多肽对SH-SY5Y细胞模型中的TDP-43 蛋白的相分离聚集的影响。图13C中，上图为融合显微图像，中图为SH-SY5Y 细胞标志物酪氨酸羟化酶(TyrosineHydroxylase)免疫荧光染色GFP荧光通道显微图像，下图为TDP-43蛋白mCherry荧光通道显微图像。
图14显示了合成本发明的多肽TD-1至TD-20(SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:20)以及对照多肽TD-21至TD-24(SEQ ID NO:21至SEQ ID NO:24)过程中所使用的密码子表。
具体实施方式
以下将结合示例性实施例对本发明进行进一步具体说明，但所述示例性实施例仅用于举例说明，对本发明的保护范围不构成任何限定，换言之，本发明并不限于所描述的特定实施方案的范围。在不脱离本发明实质的前提下，本领域技术人员可以对本发明的各个方面进行修改和变化，这些修改和变化均落入本发明的保护范围。
实施例1.制备FUS蛋白、TDP-43蛋白、TIA1蛋白和C9orf72蛋白并诱导其发生相分离进而聚集
细胞里的FUS蛋白和TDP-43蛋白均具有“相分离”特性，其在不同条件下可以从液态转变为胶体状，甚至进而形成不可逆的固态纤维体。而这些蛋白的异常相分离而引起的聚集可能导致疾病，如神经退行性疾病(FUS蛋白病、 TDP-43蛋白病等)、肿瘤、衰老等。
在本实施例中，制备FUS蛋白、TDP-43蛋白、TIA1蛋白和C9orf72蛋白并诱导其发生相分离进而聚集。
FUS蛋白和TDP-43蛋白根据如下参考文献进行制备：Shovamayee Maharana 等人，“RNA buffers the phase separation behavior of prion-like RNA-bindingproteins”，Science，2018，360(6391)：918-921。
TIA1蛋白根据如下参考文献进行制备：Ian R.Mackenzie等人，“TIA1 Mutationsin Amyotrophic Lateral Sclerosis and Frontotemporal Dementia Promote PhaseSeparation and Alter Stress Granule Dynamics”,Neuron,95,808-816。
C9orf72蛋白根据如下参考文献进行制备：Steven Boeynaems等人，“PhaseSeparation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics”,Molecular Cell,65,1044-1055；Michael R.White等人，“C9orf72 Poly(PR) DipeptideRepeats Disturb Biomolecular Phase Separation and Disrupt NucleolarFunction”,Molecular Cell,74,713-728。
本实施例中制备得到的FUS蛋白、TDP-43蛋白、TIA1蛋白和C9orf72蛋白通过SDS-PAGE检测，以验证所制得的蛋白为FUS蛋白、TDP-43蛋白、TIA1 蛋白和C9orf72蛋白。结果如图1所示。
随后，通过如下步骤确认所制得的FUS蛋白、TDP-43蛋白、TIA1蛋白和 C9orf72蛋白发生聚集的条件：
(i)将根据实施例1制备得到的FUS蛋白、TDP-43蛋白、TIA1蛋白和 C9orf72蛋白分别浓缩至5mg/ml；
(ii)将上述蛋白放置于4℃孵育10min，同时将载波片放入冷室预冷；
(iii)取出蛋白，取10μL滴入载波片上，在荧光显微镜下观察。
通过共聚焦激光显微镜(Confocal)分别观察FUS蛋白、TDP-43蛋白、TIA1 蛋白和C9orf72蛋白的聚集特征。
FUS蛋白的相分离条件为：pH7.5、37℃、浓度10μΜ；
TDP-43蛋白的相分离条件为：pH7.5、37℃、浓度2μΜ；
TIA1蛋白的相分离条件为：37℃、pH7.5、浓度10μM；
C9orf72的相分离条件为：37℃、pH7.5、浓度10μM。
FUS蛋白和TDP-43的聚集特征分别如图3A和图3B所示。如图所示，FUS 蛋白在荧光显微图像、白光显微图像中均可观察到典型的聚集现象(出现相分离液滴)，证明FUS蛋白在37℃、pH7.5、浓度10μM的条件下会发生聚集(出现相分离液滴)；TDP-43蛋白在37℃、pH7.5、浓度2μM的条件下会发生聚集 (出现相分离液滴)。
TIA1蛋白和C9orf72蛋白的聚集特征分别如图3C和图3D所示。如图所示， TIA1蛋白和C9orf72蛋白在37℃、pH7.5、浓度10μM条件下会发生聚集(出现相分离液滴)。
实施例2.制备氨基酸序列为SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4的多肽(编号： TD-1，TD-2，TD-3，TD-4)
在本实施例中，制备对引起神经变性和神经退行性疾病的蛋白(FUS蛋白、 TDP-43蛋白、TIA1蛋白和C9orf72蛋白)聚集具有解聚作用的多肽TD-1至 TD-4。以TD-1为例，具体说明其制备步骤如下(合成氨基酸过程中使用的密码子表如图14所示)：
I.人工合成pET28-TD1：
1、人工合成TD-1的表达序列(即编码TD-1的多核苷酸序列)：
2、将TD-1表达序列整合构建pET28a载体。
3、将构建好的原核表达载体pET28a-TD1转化至BL21(DE3)菌株中，转化条件与DH5alpha所用条件相同；
4、37℃过夜培养；
5、挑取单菌落，在加入了抗生素的培养基中摇菌过夜；
6、将过夜培养的菌液1：100转接于加入了抗生素的新鲜LB培养基中，37℃、230rpm摇菌培养4hr；
7、对于pET28载体表达菌，在培养基中加入终浓度为0.5mM的IPTG，37℃诱导表达4hr；
8、取诱导表达的菌液1mL，离心，弃去上清，加入十分之一体积的bugbaster Mix裂解液冰上裂解菌体二十分中，加入蛋白上样缓冲液，95℃加热10min，SDS PAGE电泳检测表达情况。
9、取诱导表达菌液1mL，用500mM的氯化钠溶液重悬菌体。将样品放入超声破碎仪中，50％功率，10秒间隔超声15min。14000转离心10min，收集上清，加入蛋白电泳缓冲液，95℃加热10min。沉淀用缓冲液重悬，加入蛋白电泳缓冲液，95℃加热10min。得到的样品沉淀和上清分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测表达结果。
II.纯化pET28-TD1：
1、将诱导表达的细菌离心收集菌体，加入50mM PH＝8.0tris-HCl，500mM 氯化钠的液体重悬菌体，高压破碎菌体；
2、14000rpm离心，20min，收集上清；
3、将收集得到的上清用0.22μM滤膜过滤，将去离子水和裂解缓冲液超声除气；
4、将管路中充满去离子水，将色谱柱连接至管路系统中；
5、1ml/min的流速下，用5倍体积的裂解缓冲液平衡色谱柱；
6、用漂洗缓冲液平衡色谱柱，直到紫外吸收峰达到一个平稳的基线。
7、用洗脱缓冲液进行梯度洗脱，直到紫外吸收峰达到一个平稳的基线，收集洗脱蛋白；
8、用3倍体积的裂解缓冲液和5倍体积的去离子水清洗柱子；
9、将纯化过程中得到的蛋白样品进行SDS-PAGE检测。
分子筛纯化：
1、IMAC亲和层析得到的蛋白在超滤管中4000rpm浓缩，直到体积小于2ml 为止；
2、在上样之前，使用3～5个柱体积的tris-HCl缓冲液平衡分子筛；
3、将样品在4℃12000rpm离心5min，去除杂质，防止堵塞分子筛，用5mL 注射器将蛋白样品注射进入进样阀；
4、流速设置为0.2ml/min，上样过程中切忌让柱子干燥脱水；
5、上样完成后，用上述柱平衡缓冲液洗脱，用自动收样器将样品收集到96 孔板中；
6、根据层析谱上的洗脱峰，将96孔板上的样品混合浓缩，取样进行 SDS-PAGE检测，以验证所制得的为TD-1。
多肽TD-2至TD-4均根据上述步骤进行制备，TD-1至TD-4的凝胶电泳图 (考马斯亮蓝染色)如图2A所示。
TD-1的氨基酸序列为：
TEPQEESEEEVEEPEERQQTPEVVPDDSGTFYDQTVSNDLE(SEQ ID NO:1)。
TD-2的氨基酸序列为：
TDPQDDSDDDVDDPDDRQQTPDVVPDDSGTFYDQTVSNDLD(SEQ ID NO:2)。
TD-3的氨基酸序列为：
TKPQKKSKKKVKKPKKRQQTPKVVPDDSGTFYDQTVSNDLK(SEQ ID NO:3)。
TD-4的氨基酸序列为：
TRPQRRSRRRVRRPRRRQQTPRVVPDDSGTFYDQTVSNDLR(SEQ ID NO:4)。
实施例3.制备SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:20的多肽(编号：TD-5至TD-20)
根据上述实施例2的制备纯化方法制备得到多肽TD-5至TD-20(SEQ ID NO:5至SEQID NO:20)，并进行SDS-PAGE检测，凝胶电泳图分别如图2B和图2C(考马斯亮蓝染色)所示。
TD-5的氨基酸序列：
(EEQ)(EEQ)EERQQTPEVVPDDSG(SEQ ID NO:5)，
TD-6的氨基酸序列：
(EEQ)(EEQ)(EEQ)EERQQTPEVVPDDSG(SEQ ID NO:6)，
TD-7的氨基酸序列：
(EEQ)(EEQ)(EEQ)(EEQ)EERQQTPEVVPDDSG(SEQ ID NO:7)，
TD-8的氨基酸序列：
(DDQ)(DDQ)DDRQQTPDVVPDDSG(SEQ ID NO:8)，
TD-9的氨基酸序列：
(DDQ)(DDQ)(DDQ)DDRQQTPDVVPDDSG(SEQ ID NO:9)，
TD-10的氨基酸序列：
(DDQ)(DDQ)(DDQ)(DDQ)DDRQQTPDVVPDDSG(SEQ ID NO:10)，
TD-11的氨基酸序列：
(KKQ)(KKQ)KKRQQTPKVVPDDSG(SEQ ID NO:11)，
TD-12的氨基酸序列：
(KKQ)(KKQ)(KKQ)KKRQQTPKVVPDDSG(SEQ ID NO:12)，
TD-13的氨基酸序列：
(KKQ)(KKQ)(KKQ)(KKQ)KKRQQTPKVVPDDSG(SEQ ID NO:13)，
TD-14的氨基酸序列：
(RRQ)(RRQ)RRRQQTPRVVPDDSG(SEQ ID NO:14)，
TD-15的氨基酸序列：
(RRQ)(RRQ)(RRQ)RRRQQTPRVVPDDSG(SEQ ID NO:15)，
TD-16的氨基酸序列：
(RRQ)(RRQ)(RRQ)(RRQ)RRRQQTPRVVPDDSG(SEQ ID NO:16)，
TD-17的氨基酸序列：
EERQQTPEVVPDDSG(SEQ ID NO:17)，
TD-18的氨基酸序列：
DDRQQTPDVVPDDSG(SEQ ID NO:18)，
TD-19的氨基酸序列：
KKRQQTPKVVPDDSG(SEQ ID NO:19)，
TD-20的氨基酸序列：
RRRQQTPRVVPDDSG(SEQ ID NO:20)。
实施例4：对照样品多肽TD-21至TD-24的制备
根据上述实施例2所述的方法，制备了四个对照多肽样品TD-21至TD-24，其中，TD-21与SEQ ID NO:1相比，其中的Q均突变为E，TD-21的氨基酸序列为：TEPEEESEEEVEEPEEREETPEVVPDDSGTFYDETVSNDLE(SEQ ID NO:21)。TD-22至TD-24与TD-5至TD-7相比，其中的Q均突变为E，TD-22 的氨基酸序列为：(EEE)(EEE)EEREETPEVVPDDSG(SEQ ID NO:22)；TD-23 的氨基酸序列为：(EEE)(EEE)(EEE)EEREETPEVVPDDSG(SEQ ID NO:23)；TD-24的氨基酸序列为：(EEE)(EEE)(EEE)(EEE)EEREETPEVVPDDSG(SEQ ID NO:24)。对这些对照样品进行SDS-PAGE检测，凝胶电泳图分别如图2C(考马斯亮蓝染色)所示。
实施例5.多肽TD-1至TD-4以及对照多肽TD-21对FUS蛋白、TDP-43蛋白、 TIA1蛋白和C9orf72蛋白聚集的解聚作用
提供5个平行的实施例1中形成的FUS蛋白(浓度10μM)、TDP-43蛋白 (浓度2μM，10％PEG)、TIA1蛋白(浓度10μM)和C9orf72蛋白(浓度10μM) 在体外聚集的体系，在37℃、pH7.5的条件下，向其中分别加入10μM多肽TD-1 至TD-4以及对照样品TD-21。使用激光共聚焦显微镜观察多肽TD-1至TD-4 以及TD-21对FUS蛋白、TDP-43蛋白、TIA1蛋白和C9orf72蛋白聚集的影响，结果如图4至图7所示。
图4分别显示在发生了聚集的5个平行的FUS蛋白溶液(37℃、pH7.5、10μM FUS)中分别加入10μM多肽TD-1至TD-4以及TD-21之后，多肽TD-1至TD-4 以及TD-21对FUS蛋白的聚集的影响，其中，左图均为刚加入(0min)时的显微图像，中图均为加入0.5min之后的显微图像，右图均为加入1min之后的显微图像。从图中可以清楚地观察到：刚加入(0min)多肽TD-1至TD-4时FUS蛋白溶液中表现出典型的聚集现象(出现相分离液滴)；加入多肽TD-1至TD-40.5min之后，FUS蛋白的聚集均明显减少(相分离液滴明显减少)；加入多肽 TD-1至TD-41min之后，FUS蛋白的聚集几乎消失(几乎没有相分离液滴)，由此可见，多肽TD-1至TD-4均能够使FUS蛋白的聚集发生明显解聚。然而，加入多肽TD-21 0.5min和1min之后，FUS蛋白溶液中仍然表现出典型的聚集现象(出现相分离液滴)，由此可见，多肽TD-21难以使FUS蛋白的聚集发生明显解聚。
图5分别显示在发生了聚集的5个平行的TDP-43蛋白溶液(37℃、pH7.5、 2μM TDP-43、10％PEG)中分别加入10μM多肽TD-1至TD-4以及TD-21之后，多肽TD-1至TD-4以及TD-21对TDP-43蛋白的聚集的影响，其中，左图均为刚加入(0min)时的显微图像，中图均为加入1min之后的显微图像，右图均为加入3min之后的显微图像。从图中可以清楚观察到：刚加入(0min)多肽 TD-1至TD-4时，TDP-43蛋白均具有典型的聚集现象(出现相分离液滴)；加入多肽TD-1至TD-4 0.5min之后，TDP-43蛋白的聚集明显减少(相分离液滴明显减少)；加入多肽TD-1至TD-4 1min之后，TDP-43蛋白的聚集几乎消失(几乎没有相分离液滴)。由此可见，多肽TD-1至TD-4均能够使TDP-43蛋白的聚集发生明显解聚。然而，加入多肽TD-21 0.5min和1min之后，TDP-43蛋白溶液中仍然表现出典型的聚集现象(出现相分离液滴)，由此可见，多肽TD-21 难以使TDP-43蛋白的聚集发生明显解聚。
图6分别显示在发生了聚集的5个平行的TIA1蛋白溶液(37℃、pH7.5、 10μM浓度)中分别加入10μM多肽TD-1至TD-4以及TD-21之后，多肽TD-1 至TD-4以及TD-21对TIA1蛋白聚集的影响，其中，左图均为刚加入(0min) 时的显微图像，中图均为加入0.5min之后的显微图像，右图均为加入1min之后的显微图像。从图中可以清楚地观察到：刚加入(0min)多肽TD-1至TD-4时 TIA1蛋白溶液中表现出典型的聚集现象(出现相分离液滴)；加入多肽TD-1至TD-4 0.5min之后，TIA1蛋白的聚集均得到减少(相分离液滴减少)；加入多肽TD-1至TD-41min之后，TIA1蛋白的聚集几乎消失(几乎没有相分离液滴)，由此可见，多肽TD-1至TD-4均能够使TIA1蛋白聚集发生明显解聚。然而，在TIA1蛋白溶液中加入多肽TD-21 0.5min和1min之后，并未出现明显的解聚现象(相分离液滴并未减少)，由此可见，多肽TD-21难以使TIA1蛋白聚集发生明显解聚。
图7分别显示在发生了聚集的5个平行的C9orf72蛋白溶液(37℃、pH7.5、 10μM浓度)中分别加入10μM多肽TD-1至TD-4以及TD-21之后，多肽TD-1 至TD-4以及TD-21对C9orf72蛋白聚集的影响，其中，左图均为刚加入(0min) 时的显微图像，中图均为加入0.5min之后的显微图像，右图均为加入1min之后的显微图像。从图中可以清楚地观察到：刚加入(0min)多肽TD-1至TD-4时 C9orf72蛋白溶液中表现出典型的聚集现象(出现相分离液滴)；加入多肽TD-1 至TD-4 0.5min之后，C9orf72蛋白的聚集均明显减少(相分离液滴明显减少)；加入多肽TD-1至TD-4 1min之后，C9orf72蛋白的聚集几乎消失(几乎没有相分离液滴)，由此可见，多肽TD-1至TD-4均能够使C9orf72蛋白聚集发生明显解聚。然而，在C9orf72蛋白溶液中加入多肽TD-21 0.5min和1min之后，并未出现明显的解聚现象(相分离液滴并未减少)，由此可见，多肽TD-21难以使C9orf72蛋白聚集发生明显解聚。
因此，根据上述观察结果可知，多肽TD-1至TD-4对FUS蛋白、TDP-43 蛋白、TIA1蛋白和C9orf72蛋白的体外聚集具有明显的解聚作用，而Q突变为 E之后所形成的TD-21则不具有解聚作用。
实施例6.多肽TD-5至TD-16以及对照多肽TD-22至TD-24对FUS蛋白、 TDP-43蛋白、TIA1蛋白和C9orf72蛋白聚集的解聚作用
提供15个平行的实施例1中形成的FUS蛋白(浓度10μM)、TDP-43蛋白(浓度2μM，10％PEG)、TIA1蛋白(浓度10μM)和C9orf72蛋白(浓度 10μM)在体外聚集的体系，在37℃、pH7.5的条件下，向其中分别加入10μM多肽TD-5至TD-16以及对照样品TD-22至TD-24。使用激光共聚焦显微镜观察多肽TD-5至TD-16以及对照TD-22至TD-24对FUS蛋白、TDP-43蛋白、TIA1 蛋白和C9orf72蛋白聚集的影响，结果如图8至图11所示。
图8显示在发生了聚集的15个平行的FUS蛋白溶液(37℃、pH7.5、10μM FUS)中分别加入10μM多肽TD-5至TD-16以及对照TD-22至TD-24之后，多肽TD-5至TD-16以及TD-22至TD-24对FUS蛋白的聚集的影响，其中，左图均为未加入多肽时的显微图像，右图均为加入1min之后的显微图像。从图中可以清楚地观察到：未加入多肽时FUS蛋白溶液中表现出典型的聚集现象(出现相分离液滴)；加入多肽TD-5至TD-16 1min之后，FUS蛋白的聚集均明显减少(相分离液滴明显减少)；而对照样品TD-22至TD-24加入1min之后， FUS蛋白溶液中仍然表现出典型的聚集现象(出现相分离液滴)。由此可见，多肽TD-5至TD-16均能够使FUS蛋白的聚集发生明显解聚，而对照多肽TD-22 至TD-24难以使FUS蛋白的聚集发生明显解聚。
图9显示在发生了聚集的15个平行的TDP-43蛋白溶液(37℃、pH7.5、2μM TDP-43、10％PEG)中分别加入10μM多肽TD-5至TD-16以及对照TD-22至 TD-24之后，多肽TD-5至TD-16以及对照TD-22至TD-24对TDP-43蛋白的聚集的影响，其中，左图均为未加入多肽时的显微图像，右图均为加入1min之后的显微图像。从图中可以清楚观察到：未加入多肽时，TDP-43蛋白均具有典型的聚集现象(出现相分离液滴)；加入多肽TD-5至TD-16 1min之后，TDP-43 蛋白的聚集明显减少(相分离液滴明显减少)；而加入多肽TD-22至TD-24 1min 之后，TDP-43蛋白溶液中仍然表现出典型的聚集现象(出现相分离液滴)。由此可见，多肽TD-5至TD-16均能够使TDP-43蛋白的聚集发生明显解聚，而多肽TD-22至TD-24难以使TDP-43蛋白的聚集发生明显解聚。
图10显示在发生了聚集的15个平行的TIA1蛋白溶液(37℃、pH7.5、10μM 浓度)中分别加入10μM多肽TD-5至TD-16以及对照TD-22至TD-24之后，多肽TD-5至TD-16以及TD-22至TD-24对TIA1蛋白的聚集的影响，其中，左图均为未加入多肽时的显微图像，右图均为加入1min之后的显微图像。从图中可以清楚地观察到：未加入多肽时TIA1蛋白溶液中表现出典型的聚集现象(出现相分离液滴)；加入多肽TD-5至TD-16 1min之后，TIA1蛋白聚集均明显减少(相分离液滴明显减少)；而在TIA1蛋白溶液中分别加入对照TD-22至TD-24 多肽之后1min，并未出现明显的解聚现象(相分离液滴并未减少)。由此可见，多肽TD-5至TD-16均能够使TIA1蛋白聚集发生明显解聚，而对照多肽TD-22 至TD-24难以使TIA1蛋白聚集发生明显解聚。
图11显示在发生了聚集的15个平行的C9orf72蛋白溶液(37℃、pH7.5、 10μM浓度)中分别加入10μM多肽TD-5至TD-16以及对照TD-22至TD-24 之后，多肽TD-5至TD-16以及TD-22至TD-24对C9orf72蛋白的聚集的影响，其中，左图均为未加入多肽时的显微图像，右图均为加入1min之后的显微图像。从图中可以清楚地观察到：未加入多肽时C9orf72蛋白溶液中表现出典型的聚集现象(出现相分离液滴)；加入多肽TD-5至TD-16 1min之后，C9orf72蛋白聚集均明显减少(相分离液滴明显减少)；而在C9orf72蛋白溶液中分别加入对照 TD-22至TD-24多肽之后1min，并未出现明显的解聚现象(相分离液滴并未减少)。由此可见，多肽TD-5至TD-16均能够使C9orf72蛋白聚集发生明显解聚，而对照多肽TD-22至TD-24难以使C9orf72蛋白聚集发生明显解聚。
因此，根据上述观察结果可知，多肽TD-5至TD-16对FUS蛋白、TDP-43 蛋白、TIA1蛋白和C9orf72蛋白的体外聚集具有明显的解聚作用，而Q突变为 E之后所形成的TD-22至TD-24则不具有解聚作用。
实施例7.多肽TD-17至TD-20对FUS蛋白、TDP-43蛋白、TIA1蛋白和C9orf72 蛋白的聚集的解聚作用
分别提供4个平行的实施例1中形成的FUS蛋白(浓度10μM)、TDP-43 蛋白(浓度2μM，10％PEG)、TIA1蛋白(浓度10μM)和C9orf72蛋白(浓度10μM)在体外聚集的体系，在37℃、pH7.5的条件下，向其中分别加入10μM 多肽TD-17至TD-20。使用激光共聚焦显微镜观察多肽TD-17至TD-20对FUS 蛋白、TDP-43蛋白、TIA1蛋白和C9orf72蛋白的聚集的影响，结果如图12A 至图12D所示。
图12A至图12D分别显示在发生了聚集的4个平行的FUS蛋白溶液(37℃、 pH7.5、10μM FUS)、TDP-43蛋白溶液(浓度2μM，10％PEG)、TIA1蛋白溶液(浓度10μM)和C9orf72蛋白溶液(浓度10μM)中分别加入10μM多肽 TD-17至TD-20之后，多肽TD-17至TD-20对FUS蛋白的聚集的影响，其中，左图均为未加入多肽时的显微图像，右图均为加入1min之后的显微图像。从图中可以清楚地观察到：未加入多肽时FUS蛋白溶液(图12A)、TDP-43蛋白溶液(图12B)、TIA1蛋白溶液(图12C)和C9orf72蛋白溶液(图12D)中表现出典型的聚集现象(出现相分离液滴)；加入多肽TD-17至TD-20 1min之后，蛋白的聚集均明显减少(相分离液滴明显减少)。由此可见，多肽TD-17至TD-20 均能够使FUS蛋白、TDP-43蛋白、TIA1蛋白和C9orf72蛋白的聚集发生明显解聚。
因此，根据上述观察结果可知，多肽TD-17至TD-20对FUS蛋白、TDP-43 蛋白、TIA1蛋白和C9orf72蛋白的体外聚集具有明显的解聚作用。
实施例8.制备SH-SY5Y细胞模型
在本实施例中，制备能够用于过表达FUS蛋白和TDP-43蛋白的SH-SY5Y 细胞模型，具体包括如下步骤：
一、SH-SY5Y细胞的培养与传代：
1、SH-SY5Y细胞用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养；
2、细胞汇合度达80％后，用真空负压泵或者移液枪吸掉培养基；
3、将细胞用PBS清洗一次；
4、在培养皿中加入胰蛋白酶-EDTA(0.05％)，放入37℃细胞培养箱中孵育1min；
5、加入二倍体积的培养液终止消化，并轻轻吹打细胞，使细胞悬浮为均匀的细胞悬液；
6、将细胞悬液加入15mL离心管中，1200转离心3min；
7、弃去上清，用新鲜的完全培养基重悬细胞；
8、将细胞重新加入到培养皿中，传代时以1:6～1:4传代。
二、SH-SY5Y细胞的转染：
1、将3ug pCMV7.1-FUS-mCherry质粒和6ug脂质体分别用100ul NaCl溶解，将脂质体溶液加入DNA中，混匀，室温放置15～30min。
pCMV7.1-TDP43-mCherry质粒的转染操作同上。
2、将上述液体加入培养的细胞中，混匀。24hr后观察。
由此，分别制得FUS和TDP-43质粒转染后的SH-SY5Y细胞模型。
实施例9：TD-1多肽对FUS蛋白和TDP-43蛋白聚集的解聚作用的体外细胞实验
将实施例8中制得的FUS质粒转染后的SH-SY5Y细胞模型(初始温度37℃) 置于42℃培养箱中1hr进行热激处理，以引起FUS蛋白聚集。其中，一组在细胞型中加入1μM TD-1多肽，作为TD-1实验组；一组不加TD-1多肽，作为对照组。1hr后取出细胞，固定破膜，按照常规免疫荧光染色步骤对SH-SY5Y标记蛋白酪氨酸羟化酶(Tyrosine Hydroxylase)进行免疫荧光染色。利用激光共聚焦荧光显微镜成像观察过表达FUS在SH-SY5Y细胞中的聚集情况。
图13A为显示单个细胞的显微镜成像，其中上图为融合显微图像，中图为单个细胞的蛋白酪氨酸羟化酶(Tyrosine Hydroxylase)免疫荧光染色GFP荧光通道显微图像，下图为FUS-mCherry荧光通道显微图像。如图13A所示，在37℃时，实验组和对照组中均可以观察到少量的FUS蛋白的相分离液滴，热激处理 1hr后，在42℃时，实验组中FUS蛋白的相分离液滴数量明显少于对照组中的数量。
图13B显示了FUS蛋白的聚集颗粒阳性细胞的百分比。可以清楚看到，在 37℃时，实验组和对照组中的FUS蛋白的聚集颗粒百分比均不高，热激处理1hr 后，在42℃时，实验组中的FUS蛋白的聚集颗粒百分比明显低于对照组。
将实施例8中制得的TDP-43质粒转染后的SH-SY5Y细胞模型(初始温度 37℃)置于42℃培养箱中1hr进行热激处理，以引起TDP43蛋白相分离聚集。其中，一组在细胞模型中加入1μM TD-1多肽，作为TD1实验组；一组不加TD-1 多肽，作为对照组。1hr后取出细胞，固定破膜，按照常规免疫荧光染色步骤对 SH-SY5Y标记蛋白酪氨酸羟化酶(TyrosineHydroxylase)进行免疫荧光染色。利用激光共聚焦荧光显微镜成像观察过表达TDP-43在SH-SY5Y细胞中的聚集情况。
图13C为显示单个细胞的显微镜成像，其中上图为融合显微图像，中图为单个细胞的蛋白酪氨酸羟化酶(Tyrosine Hydroxylase)免疫荧光染色GFP荧光通道显微图像，下图为TDP43-mCherry荧光通道显微图像。如图13C所示，在 37℃时，实验组和对照组中均可以观察到少量的TDP-43蛋白的相分离液滴，热激处理1hr后，在42℃时，实验组中TDP-43蛋白的相分离液滴数量明显少于对照组中的数量。
图13D显示了TDP-43蛋白的聚集颗粒阳性细胞的百分比。可以清楚看到，在37℃时，实验组和对照组中的TDP-43蛋白的聚集颗粒百分比均不高，热激处理1hr后，在42℃时，实验组中的TDP-43蛋白的聚集颗粒百分比明显低于对照组。
因此，根据上述观察结果可知，在SH-SY5Y细胞模型中，TD-1多肽对FUS 蛋白的聚集、TDP-43蛋白的聚集具有明显的解聚作用。
以上结合具体实施例对本发明进行了具体说明，这些具体实施例仅仅是示例性的，不能以此限定本发明的保护范围，本领域技术人员在不背离本发明的实质和范围的前提下可对本发明进行各种修改、变化或替换。因此，依照本发明所作的各种等同变化仍属于本发明所涵盖的范围。
序列表
<110> 北京太东生物科技有限公司
<120> 对引起神经变性和神经退行性疾病的蛋白聚集具有解聚作用的多肽
<130> T10-2P-KSYQ
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> PRT
<213> TD-1
<400> 1
Thr Glu Pro Gln Glu Glu Ser Glu Glu Glu Val Glu Glu Pro Glu Glu
1 5 10 15
Arg Gln Gln Thr Pro Glu Val Val Pro Asp Asp Ser Gly Thr Phe Tyr
20 25 30
Asp Gln Thr Val Ser Asn Asp Leu Glu
35 40
<210> 2
<211> 41
<212> PRT
<213> TD-2
<400> 2
Thr Asp Pro Gln Asp Asp Ser Asp Asp Asp Val Asp Asp Pro Asp Asp
1 5 10 15
Arg Gln Gln Thr Pro Asp Val Val Pro Asp Asp Ser Gly Thr Phe Tyr
20 25 30
Asp Gln Thr Val Ser Asn Asp Leu Asp
35 40
<210> 3
<211> 41
<212> PRT
<213> TD-3
<400> 3
Thr Lys Pro Gln Lys Lys Ser Lys Lys Lys Val Lys Lys Pro Lys Lys
1 5 10 15
Arg Gln Gln Thr Pro Lys Val Val Pro Asp Asp Ser Gly Thr Phe Tyr
20 25 30
Asp Gln Thr Val Ser Asn Asp Leu Lys
35 40
<210> 4
<211> 41
<212> PRT
<213> TD-4
<400> 4
Thr Arg Pro Gln Arg Arg Ser Arg Arg Arg Val Arg Arg Pro Arg Arg
1 5 10 15
Arg Gln Gln Thr Pro Arg Val Val Pro Asp Asp Ser Gly Thr Phe Tyr
20 25 30
Asp Gln Thr Val Ser Asn Asp Leu Arg
35 40
<210> 5
<211> 21
<212> PRT
<213> TD-5
<400> 5
Glu Glu Gln Glu Glu Gln Glu Glu Arg Gln Gln Thr Pro Glu Val Val
1 5 10 15
Pro Asp Asp Ser Gly
20
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> TD-6
<400> 6
Glu Glu Gln Glu Glu Gln Glu Glu Gln Glu Glu Arg Gln Gln Thr Pro
1 5 10 15
Glu Val Val Pro Asp Asp Ser Gly
20
<210> 7
<211> 27
<212> PRT
<213> TD-7
<400> 7
Glu Glu Gln Glu Glu Gln Glu Glu Gln Glu Glu Gln Glu Glu Arg Gln
1 5 10 15
Gln Thr Pro Glu Val Val Pro Asp Asp Ser Gly
20 25
<210> 8
<211> 21
<212> PRT
<213> TD-8
<400> 8
Asp Asp Gln Asp Asp Gln Asp Asp Arg Gln Gln Thr Pro Asp Val Val
1 5 10 15
Pro Asp Asp Ser Gly
20
<210> 9
<211> 24
<212> PRT
<213> TD-9
<400> 9
Asp Asp Gln Asp Asp Gln Asp Asp Gln Asp Asp Arg Gln Gln Thr Pro
1 5 10 15
Asp Val Val Pro Asp Asp Ser Gly
20
<210> 10
<211> 27
<212> PRT
<213> TD-10
<400> 10
Asp Asp Gln Asp Asp Gln Asp Asp Gln Asp Asp Gln Asp Asp Arg Gln
1 5 10 15
Gln Thr Pro Asp Val Val Pro Asp Asp Ser Gly
20 25
<210> 11
<211> 21
<212> PRT
<213> TD-11
<400> 11
Lys Lys Gln Lys Lys Gln Lys Lys Arg Gln Gln Thr Pro Lys Val Val
1 5 10 15
Pro Asp Asp Ser Gly
20
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<211> 24
<212> PRT
<213> TD-12
<400> 12
Lys Lys Gln Lys Lys Gln Lys Lys Gln Lys Lys Arg Gln Gln Thr Pro
1 5 10 15
Lys Val Val Pro Asp Asp Ser Gly
20
<210> 13
<211> 27
<212> PRT
<213> TD-13
<400> 13
Lys Lys Gln Lys Lys Gln Lys Lys Gln Lys Lys Gln Lys Lys Arg Gln
1 5 10 15
Gln Thr Pro Lys Val Val Pro Asp Asp Ser Gly
20 25
<210> 14
<211> 21
<212> PRT
<213> TD-14
<400> 14
Arg Arg Gln Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gln Gln Thr Pro Arg Val Val
1 5 10 15
Pro Asp Asp Ser Gly
20
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<211> 24
<212> PRT
<213> TD-15
<400> 15
Arg Arg Gln Arg Arg Gln Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gln Gln Thr Pro
1 5 10 15
Arg Val Val Pro Asp Asp Ser Gly
20
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<212> PRT
<213> TD-16
<400> 16
Arg Arg Gln Arg Arg Gln Arg Arg Gln Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gln
1 5 10 15
Gln Thr Pro Arg Val Val Pro Asp Asp Ser Gly
20 25
<210> 17
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<213> TD-17
<400> 17
Glu Glu Arg Gln Gln Thr Pro Glu Val Val Pro Asp Asp Ser Gly
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<211> 15
<212> PRT
<213> TD-18
<400> 18
Asp Asp Arg Gln Gln Thr Pro Asp Val Val Pro Asp Asp Ser Gly
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<212> PRT
<213> TD-19
<400> 19
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<211> 15
<212> PRT
<213> TD-20
<400> 20
Arg Arg Arg Gln Gln Thr Pro Arg Val Val Pro Asp Asp Ser Gly
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<211> 41
<212> PRT
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Thr Glu Pro Glu Glu Glu Ser Glu Glu Glu Val Glu Glu Pro Glu Glu
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Arg Glu Glu Thr Pro Glu Val Val Pro Asp Asp Ser Gly Thr Phe Tyr
20 25 30
Asp Glu Thr Val Ser Asn Asp Leu Glu
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<211> 21
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<213> TD-22
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1 5 10 15
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<211> 24
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<213> TD-23
<400> 23
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Arg Glu Glu Thr Pro
1 5 10 15
Glu Val Val Pro Asp Asp Ser Gly
20
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<211> 27
<212> PRT
<213> TD-24
<400> 24
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Arg Glu
1 5 10 15
Glu Thr Pro Glu Val Val Pro Asp Asp Ser Gly
20 25

Claims (17)

1.一种对引起神经变性和神经退行性疾病的蛋白聚集具有解聚作用的多肽，该多肽包含如下通式I的氨基酸序列：
X1X1RQQX2PX1VVPDDSG (I)
其中，
X1为E，或D，或K，或R；
X2选自任意氨基酸残基。
2.如权利要求1所述的多肽，其中，所述蛋白选自：FUS蛋白、TDP-43蛋白、TIA1蛋白和C9orf72蛋白。
3.如权利要求1所述的多肽，其中，该多肽的氨基酸序列为如下SEQ ID NO:17至SEQ IDNO:20中的任意一个序列或与SEQ ID NO:17至SEQ ID NO:20中的任意一个序列具有至少90％序列一致性的序列：
EERQQTPEVVPDDSG(SEQ ID NO:17)，
DDRQQTPDVVPDDSG(SEQ ID NO:18)，
KKRQQTPKVVPDDSG(SEQ ID NO:19)，
RRRQQTPRVVPDDSG(SEQ ID NO:20)；
其中，在与SEQ ID NO:17至SEQ ID NO:20中的任意一个序列具有至少90％序列一致性的序列中，氨基酸残基Q不能被取代或缺失。
4.如权利要求3所述的多肽，该多肽的氨基酸序列为与SEQ ID NO:17至SEQ ID NO:20中的任意一个序列具有至少95％，或96％，或97％，或98％，或99％，或99.5％的序列一致性的序列。
5.如权利要求1所述的多肽，其中，在所述通式I的氨基酸序列的C端添加有如下通式II的氨基酸序列：
TFYDQTVSNDLX3 (II)
其中，X3为E，或D，或K，或R。
6.如权利要求1或5所述的多肽，其中，在所述通式I的氨基酸序列的N端添加有如下通式III的氨基酸序列：
TX4PQX4X4SX4X4X4VX4X4P (III)
其中，X4为E，或D，或K，或R。
7.如权利要求6所述的多肽，该多肽的氨基酸序列为如下SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4中的任意一个序列或与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4中的任意一个序列具有至少90％序列一致性的序列：
TEPQEESEEEVEEPEERQQTPEVVPDDSGTFYDQTVSNDLE(SEQ ID NO:1)，或
TDPQDDSDDDVDDPDDRQQTPDVVPDDSGTFYDQTVSNDLD(SEQ ID NO:2)，或
TKPQKKSKKKVKKPKKRQQTPKVVPDDSGTFYDQTVSNDLK(SEQ ID NO:3)，或
TRPQRRSRRRVRRPRRRQQTPRVVPDDSGTFYDQTVSNDLR(SEQ ID NO:4)；
其中，在与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4中的任意一个序列具有至少90％序列一致性的序列中，氨基酸残基Q不能被取代或缺失。
8.如权利要求7所述的多肽，该多肽的氨基酸序列为与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4中的任意一个序列具有至少95％，或96％，或97％，或98％，或99％，或99.5％的序列一致性的序列。
9.如权利要求1所述的多肽，其中，在所述通式I的氨基酸序列的N端添加有具有如下通式IV的氨基酸序列：
(X1X1Q)n(IV)
其中，X1为E，或D，或K，或R；并且，n≥2。
10.如权利要求9所述的多肽，该多肽的氨基酸序列为如下SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:16中的任意一个序列或与SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:16中的任意一个序列具有至少90％序列一致性的序列：
(EEQ)(EEQ)EERQQTPEVVPDDSG(SEQ ID NO:5)，
(EEQ)(EEQ)(EEQ)EERQQTPEVVPDDSG(SEQ ID NO:6)，
(EEQ)(EEQ)(EEQ)(EEQ)EERQQTPEVVPDDSG(SEQ ID NO:7)，
(DDQ)(DDQ)DDRQQTPDVVPDDSG(SEQ ID NO:8)，
(DDQ)(DDQ)(DDQ)DDRQQTPDVVPDDSG(SEQ ID NO:9)，
(DDQ)(DDQ)(DDQ)(DDQ)DDRQQTPDVVPDDSG(SEQ ID NO:10)，
(KKQ)(KKQ)KKRQQTPKVVPDDSG(SEQ ID NO:11)，
(KKQ)(KKQ)(KKQ)KKRQQTPKVVPDDSG(SEQ ID NO:12)，
(KKQ)(KKQ)(KKQ)(KKQ)KKRQQTPKVVPDDSG(SEQ ID NO:13)，
(RRQ)(RRQ)RRRQQTPRVVPDDSG(SEQ ID NO:14)，
(RRQ)(RRQ)(RRQ)RRRQQTPRVVPDDSG(SEQ ID NO:15)，
(RRQ)(RRQ)(RRQ)(RRQ)RRRQQTPRVVPDDSG(SEQ ID NO:16)；
其中，在与SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:16中的任意一个序列具有至少90％序列一致性的序列中，氨基酸残基Q不能被取代或缺失。
11.如权利要求10所述的多肽，该多肽的氨基酸序列为与SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:16中的任意一个序列具有至少95％，或96％，或97％，或98％，或99％，或99.5％的序列一致性的序列。
12.如权利要求1至11中任一项所述的多肽，其中，所述神经变性和神经退行性疾病包括下列病症中的至少一种：额颞叶痴呆、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、皮质基底节变性、路易体痴呆、亨廷顿病、路易体病、运动神经元疾病、额颞叶变性、海马硬化、包涵体肌病、包涵体肌炎、帕金森病、嗜银颗粒病、阿尔茨海默病、纪伊半岛的帕金森-痴呆复合征、进行性核上性麻痹和匹克氏病。
13.一种多核苷酸，其编码权利要求1至12中任一项所述的多肽。
14.一种分离的表达载体，其包含权利要求13所述的多核苷酸。
15.一种宿主细胞，其包含权利要求13所述的多核苷酸。
16.一种用于预防、缓解或治疗由蛋白聚集引起的神经变性和神经退行性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的权利要求1至12中任一项所述的多肽和药学上可接受的载体。
17.权利要求1至12中任一项所述多肽的在制备用于预防、缓解或治疗由蛋白聚集引起的神经变性和神经退行性疾病的药物中的应用。
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