KR102279919B1

KR102279919B1 - 신경계 퇴행성 질환 치료 물질의 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR102279919B1
Application number: KR1020180137293A
Authority: KR
Inventors: 김기영; 최현준; 도현아
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2018-11-09
Filing date: 2018-11-09
Publication date: 2021-07-21
Also published as: KR20200053864A

Abstract

본 발명은 신경세포의 Slimb 또는 β-TrCP 유전자의 발현 또는 활성의 측정을 통한 신경계 퇴행성 질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 초파리 눈 조직에서 Shaggy가 불활성화 되거나 감소하면 FUS의 양이 감소하는 것을 실험적으로 확인하고, 상기의 FUS의 감소에 Slimb가 관여함을 규명하였는바, 신경세포에서 Slimb 또는 β-TrCP 유전자의 발현 또는 활성수준을 증가시키는 신경계 퇴행성 질환 치료와 관련된 물질을 발굴할 수 있으며, 상기의 물질은 의약품, 식품 등의 관련 개발 분야에서 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

신경계 퇴행성 질환 치료 물질의 스크리닝 방법{Screening method of therapeutic agents for neurodegenerative diseases}

본 발명은 신경계 퇴행성 질환 치료 물질의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 신경세포에서 Slimb 또는 β-TrCP 유전자의 발현 또는 활성의 측정을 통해 상기 발현 또는 활성 수준을 증가시키는 신경계 퇴행성 질환 치료 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

근위축성 측색 경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS)은 대뇌 피질(brain cortex), 뇌간(brain stem) 및 척수(spinal cord)에서 상부 및 하부 운동 뉴런의 진행형 손실(progressive loss)을 보이는 파괴적인 퇴행성 신경계 질환으로 마비 및 사망에 이르게 된다. 대부분의 근위축성 측색 경화증은 특발성이지만, 약 10%는 유전에 의한 것이다. SOD1, TARDBP, FUS/TLS, VAPB, OPTN, VCP, UBQLN2 및 C9ORF72 등의 돌연변이가 근위축성 측색 경화증과 연관되어 있다고 알려져 있다.

FUS(fused in sarcoma, FUS/TLS)는 DNA 수선(repair), 유전자 전사 및 RNA 스플라이싱(splicing)에 관여하는 DNA 또는 RNA 결합 단백질로서, FUS의 N-말단은 전사 활성과 연관되어 있고, C-말단은 단백질 및 RNA 결합에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한, FUS는 전사 인자(transcription factor)인 AP2, GCF, Sp1에 대한 인식 부위를 가지는 것으로 확인된 바 있다.

Slimb는 F-박스(F-box)단백질로 초파리에서 발현되며, 포유류의 상동 단백질은 β-TrCP이다. 상기 Slimb는 SCF(Skp1-Cul1-F-box Protein) 유비퀴틴 리가아제(ubiquitin ligase)로서, 표적단백질에 유비퀴틴을 붙여 상기 표적단백질을 프로테아좀(proteasome)에서 분해되도록 하는 역할을 한다.

β-TrCP(Beta-Transducin Repeat Containing E3 Ubiquitin Protein Ligase)는 약 40개의 아미노산 모티프인 F-박스를 포함하는 F-박스 단백질이다. F-박스 단백질은 SCF라고 불리는 유비퀴틴 단백질 리가아제 복합체의 4개의 서브 유닛 중 하나를 구성한다. F-box 단백질은 3가지로 분류 되는데, WD40 도메인(WD-40 domains)을 포함하는 Fbxws, 류신이 풍부한 반복서열(leucine-rich repeats)을 포함하는 Fbxls 및 서로 다른 단백질간 상호작용에 필요한 모듈을 포함하거나 인식 모티프를 포함하지 않는 Fbxos가 있다.

FUS(fused in sarcoma) 돌연변이의 스트레스 과립(stress granule) 축적을 감소시키는 퇴행성 신경계 질환 치료제의 스크리닝 방법은 알려져 있으나(한국등록특허공보 제 10-1591265호), 아직까지 신경세포의 Slimb 또는 β-TrCP 유전자의 발현 또는 활성 측정을 통한 신경계 퇴행성 질환 치료 물질의 스크리닝 방법은 알려진 바가 없다.

본 발명자들은 신경세포 내 FUS와 Shaggy의 상호간 영향을 규명하기 위해 초파리 눈 조직 등을 이용해 연구한 결과, Shaggy가 Slimb를 통해 신경세포 내 FUS의 양을 감소시키는 것을 실험적으로 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 신경세포의 Slimb 또는 β-TrCP 유전자의 발현 또는 활성 측정을 통한 신경계 퇴행성 질환 치료 물질의 스크리닝 방법 제공을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

하기의 단계를 포함하는, 신경계 퇴행성 질환 치료 물질 스크리닝 방법을 제공한다.

(a) 후보물질을 신경세포에 처리하는 단계; (b) 상기 후보물질이 처리된 신경세포에서 Slimb 또는 β-TrCP 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 후보물질 비처리군에 비해 상기 발현 또는 활성 수준이 증가하는 경우 신경계 퇴행성 질환 치료 물질로 선정하는 단계.

본 발명의 일 구현예로, 상기 신경계 퇴행성 질환은 근위축성 측색 경화증일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 후보물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 Slimb 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 Slimb는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 β-TrCP 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 β-TrCP는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 발현 또는 활성의 측정은 중합효소연쇄반응(PCR), 마이크로어레이(microarray), 노던 블롯팅(northern blotting), 웨스턴 블롯팅(western blotting), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 면역화학염색법(immunohistochemistry) 및 면역형광염색법(immunofluorescence)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 이용하여 측정할 수 있다.

본 발명자들은 Shaggy의 불활성화 또는 발현량의 감소가 있는 경우 신경세포 내 FUS의 양이 감소한다는 것을 실험적으로 확인하고, 상기의 FUS의 감소에 Slimb가 관여함을 규명하였는바, 신경세포에서 Slimb 또는 β-TrCP 유전자의 발현 또는 활성을 측정함으로써 신경계 퇴행성 질환 치료와 관련된 물질을 발굴할 수 있으며, 상기의 물질은 의약품, 식품 등의 관련 개발 분야에서 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

도 1은 Shaggy의 불활성화 또는 발현량의 감소가 있는 경우 세포사멸이 유도된 초파리 눈 조직이 정상 눈 모양으로 회복하는 것을 보여주는 결과이다.
도 2는 신경세포 내 FUS의 발현이 증가하면 9번 아미노산 세린이 인산화된 Shaggy의 양이 감소한다는 것을 보여주는 결과이다.
도 3은 Shaggy의 불활성화 또는 발현량의 감소가 있는 경우 신경세포 내 FUS의 양이 감소하고, 야생형 Shaggy가 증가하는 경우 신경세포 내 FUS의 양이 증가한다는 것을 보여주는 결과이다.
도 4는 Shaggy의 불활성화 또는 발현량의 감소가 있는 경우, 초파리 유충(larvae)의 운동능력의 변화를 보여주는 결과이다.
도 5는 신경세포 내 FUS의 양이 증가하면 초파리 유충(larvae)의 운동능력이 감소하나, Shaggy의 불활성화 또는 발현량의 감소가 있는 경우 상기 운동능력의 감소가 회복되며, 야생형 Shaggy의 양이 증가하는 경우 초파리 유충의 운동능력의 감소가 커진다는 것을 보여주는 결과이다.
도 6은 신경세포 내 FUS의 양이 증가하면 초파리 성충의 운동능력이 감소하나, Shaggy의 불활성화 또는 발현량의 감소가 있는 경우 상기 운동능력의 감소가 회복되며, 야생형 Shaggy의 양이 증가하는 경우 초파리 성충의 운동능력의 감소가 커진다는 것을 보여주는 결과이다.
도 7은 신경세포 내 Shaggy의 불활성화가 있는 경우 신경세포 내 미토콘드리아의 크기감소가 회복된다는 것을 보여주는 결과이다.
도 8은 야생형 Slimb의 발현량이 증가하는 경우 FUS로 인한 초파리 눈 조직의 손상이 회복되나, Slimb의 활성이 감소하는 경우(Slimb DN 형태, SlimbΔN 발현 증가) 눈 조직 손상이 회복되지 않는다는 것을 보여주는 결과이다.
도 9는 신경세포 내 야생형 Slimb의 발현량이 증가하는 경우 FUS의 양이 감소하고, Slimb의 활성이 감소하는 경우(Slimb DN 형태, SlimbΔN 발현 증가) 신경세포 내 FUS의 양이 증가한다는 것을 보여주는 결과이다.
도 10은 신경세포 내 Shaggy의 불활성화가 있는 경우 FUS의 양이 감소하나, Slimb의 활성이 감소하는 경우에는 Shaggy의 불활성화가 있더라도 FUS의 양이 감소하지 않는다는 것을 보여주는 결과이다.
도 11은 신경세포 내 Shaggy의 불활성화가 있는 경우 초파리 유충의 운동능력의 감소가 회복되나, Slimb의 활성이 감소하는 경우 Shaggy의 불활성화가 있더라도 대조군과 비교하여 운동능력의 감소가 유의하게 회복되지 않는다는 것을 보여주는 결과이다.
도 12는 리튬을 투여한 후 초파리 유충(larvae)의 운동능력의 변화를 보여주는 결과이다.
도 13은 리튬을 투여하면 FUS로 인한 초파리 유충의 운동능력의 감소가 회복된다는 것을 보여주는 결과이다.
도 14는 리튬을 투여하면 신경세포 내 FUS의 양이 감소한다는 것을 보여주는 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 신경세포 내 FUS와 Shaggy(GSK3β)의 상호작용을 연구하여, Shaggy(GSK3β)가 Slimb(β-TrCP)를 통해 FUS의 감소를 유발한다는 것을 규명하였다. 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 (a) 후보물질을 신경세포에 처리하는 단계, (b) 상기 후보물질이 처리된 신경세포에서 Slimb 또는 β-TrCP 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 단계 및 (c) 후보물질 비처리군에 비해 상기 발현 또는 활성 수준이 증가하는 경우, 신경계 퇴행성 질환 치료 물질로 선정하는 단계를 포함하는, 신경계 퇴행성 질환 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, “FUS”는 RNA/DNA결합 단백질로서, FUS의 N-말단은 전사 활성과 연관되어 있고 C-말단은 단백질 및 RNA 결합에 관여하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에 있어서, “Shaggy”는 다핵의 배반엽(syncytial blastoderm) 형성 및 배아 분할(embryonic segmentation) 등의 생체 발달 및 전사 조절에 관여한다. 또한 시냅스 전 운동뉴런의 신경근 접합부(neuromuscular junction)의 성장을 제어(negative control)하고 배아 발생동안의 액틴 세포골격(actin cytoskeleton)과 미세소관 역학(microtubule dynamics)을 조절하는데 있어 중요한 역할을 한다.

본 발명에 있어서, “GSK3β(Glycogen synthase kinase 3β)”는 초파리 Shaggy의 포유류 상동단백질이다. 뉴런은 키네신-1(kinesin-1)과 다이네인(dynein)과 같은 미세소관(microtubule, MT) 모터 단백질에 의존하여 세포체와 축삭의 말단 사이에서 물질 수송에 관여한다. GSK3β는 상기의 키네신-1(kinesin-1)에 의한 축삭에서의 수송을 조절하며, 알츠하이머 병에서 중심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에 있어서, “Slimb”는 F-박스 단백질로 초파리 단백질로 알려져 있으며, 포유류의 상동단백질은 β-TrCP이다. 상기 Slimb는 SCF(Skp1-Cul1-F-box Protein) 유비퀴틴 리가아제(ubiquitin ligase)이며 표적단백질에 유비퀴틴을 붙여 프로테아좀(proteasome)에서 분해되도록 하는 단백질이다.

본 발명에 따른 Slimb 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열(Drosophila Slimb NCBI Accession: AF032878.1)로 이루어질 수 있으며, 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열(Drosophila Slimb NCBI Accession: AAC38852.1)로 이루어진 것일 수 있다. 이 때, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, “β-TrCP(Beta-Transducin Repeat Containing E3 Ubiquitin Protein Ligase)”는 약 40개의 아미노산 모티프인 F-박스를 포함하는 F-박스 단백질이다. F-박스 단백질은 SCF라고 불리는 유비퀴틴 단백질 리가아제 복합체의 4개의 서브 유닛 중 하나를 구성한다.

본 발명에 따른 β-TrCP 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열(Human β-TrCP NCBI Accession: AF101784.1)로 이루어질 수 있으며, 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열(Human β-TrCP NCBI Accession: AAD08702.1)로 이루어진 것일 수 있다. 이 때, 상기 서열번호 3으로 표시되는 염기서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 후보물질은 신경계 퇴행성 질환의 치료 활성을 테스트할 물질을 의미하며, 예컨대 추출물, 단백질, 올리고펩티드, 소형 유기 분자, 다당류, 폴리뉴클레오티드 및 광범위한 화합물 등의 임의 분자를 포함할 수 있다. 이러한 후보물질은 또한 천연물질뿐 아니라, 합성물질도 포함한다.

본 발명에 있어서, 대상으로 하는 질환인 “신경계 퇴행성 질환”은 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 발생하는 모든 뇌질환을 포함하는 광의의 개념을 의미하며, 퇴행성 뇌질환은 대부분 발병 원인이 알려져 있지 않지만, 연관 신경계를 선택적으로 침범하며, 질병의 발병이 천천히 시작해서 지속적인 진행을 보이는 것이 특징이다. 바람직하게는 알츠하이머병, 경도인지장애, 뇌졸중 및 혈관성 치매, 전두측두엽 치매, 루이소체 치매, 크로이츠펠트-야콥병, 외상성 두부 손상, 매독, 후천성 면역 결핍 증후군 및 기타 바이러스 감염, 뇌농양, 뇌종양, 다발성경화증, 대사성 질환에 의한 치매, 저산소증, 파킨슨병, 헌팅턴병, 픽병, 근위축성 측색 경화증, 간질, 허혈, 중풍, 주의력결핍-과잉행동장애, 정신분열증, 우울증, 조울증, 외상 후 스트레스 장애, 척수손상, 척수염 등을 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 근위축성 측색 경화증일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 신경세포의 Slimb 또는 βTrCP 유전자의 발현 또는 활성의 측정은 중합효소연쇄반응(PCR), 마이크로어레이(microarray), 노던 블롯팅(northern blotting), 웨스턴 블롯팅(western blotting), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 면역화학염색법(immunohistochemistry) 및 면역형광염색법(immunofluorescence)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 이용할 수 있다.

본 발명자들은 본 발명을 완성하기 위해 초파리의 눈 조직, 초파리 유충, 초파리 성충, 초파리 신경세포 및 신경세포 내 미토콘드리아를 이용하였다.

본 발명의 일실시예에서는, FUS의 발현으로 세포사멸이 유도된 초파리 눈 조직에서 Shaggy의 불활성화 또는 발현량 감소가 있는 경우 정상적인 초파리 눈 모양을 회복한 것을 확인하였고, 이로써 Shaggy의 불활성 또는 발현량의 감소가 세포독성을 억제하는 것과 관련이 있다는 것을 알 수 있었다(실시예 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 신경세포 내 FUS의 양이 증가하면 9번 아미노산 세린이 인산화된 Shaggy의 양은 감소한다는 것을 확인하였다. 또한 Shaggy의 불활성화 또는 발현량의 감소가 있는 경우 신경세포 내 FUS의 양이 감소하며, 야생형 Shaggy의 양이 증가하는 경우 신경세포 내 FUS의 양이 증가하는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 신경세포 내 FUS의 양이 증가하면 초파리 유충(larvae) 및 성충의 운동능력이 감소하는데, Shaggy가 불활성화 되거나 발현량이 감소하는 경우 상기 운동능력의 감소가 회복되는 것을 확인하였다. 또한 야생형 Shaggy의 양이 증가하는 경우 초파리 유충 및 성충의 운동능력의 감소가 커진다는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, Shaggy의 불활성화가 있는 경우 FUS 증가로 인한 미토콘드리아의 크기감소가 회복되는 것을 확인하였다(실시예 5 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 야생형 Slimb의 양이 증가하는 경우 FUS로 인한 눈 조직의 손상이 회복되고, Slimb의 활성이 감소하는 경우(Slimb DN 형태, SlimbΔN 발현 증가) 눈 조직의 손상이 회복되지 않는 것을 확인하였다. 이는 야생형 Slimb의 양이 증가하는 경우 신경세포 내 FUS의 양이 감소하고, Slimb의 활성이 감소하는 경우(Slimb DN 형태, SlimbΔN 발현 증가) 신경세포 내 FUS의 양이 증가하는 것과 일치하는 결과이다. 또한, Slimb의 활성이 감소하는 경우 Shaggy가 불활성화되더라도 신경세포 내 FUS의 양이 감소하지 않는다는 것을 확인하였다(실시예 6 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 포유동물에서 GSK3β의 활성을 억제하는 것으로 알려진 리튬(Li)을 초파리 유충에 투여하면 FUS로 인한 운동능력의 감소가 회복되는 것을 확인하였다(실시예 7 참조).

상기 결과들을 통해 Shaggy가 불활성화되면 신경세포 내 FUS의 양이 감소하나, Shaggy가 불활성화되더라도 Slimb의 활성이 억제되면 신경세포 내 FUS의 양이 감소하지 않는다는 것을 확인하였다. 또한 FUS의 증가로 인해 운동능력이 감소한 초파리에 리튬을 투여하면 상기의 감소가 회복되는 것을 확인하였다.

상기 결과들을 기초로 신경세포의 Slimb 또는 β-TrCP 유전자의 발현 또는 활성의 측정을 통해 신경계 퇴행성 질환 치료 물질을 스크리닝할 수 있다는 것을 확인하였다.

또한, Shaggy 또는 GSK3β 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는, Slimb 또는 β-Trcp 증진용 시험관내 조성물을 제공할 수 있음을 확인하였다.

나아가, Shaggy 또는 GSK3β 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는, 치료 물질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경계 퇴행성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공할수 있으며, 상기의 치료 물질의 신경계 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용도를 제공할 수 있다는 것을 확인하였다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 노랑초파리(Drosophila melanogaster) 준비

모든 초파리 스톡(stock)은 표준 먹이 조건(standard food condition), 상온 조건(normal temperature)(25 ℃) 및 정상 습도 조건(normal humidity condition)(60%)에서 보관하였으며, 초파리의 교배(crossing)는 표준 절차에 따라 수행하고, 모든 자손은 25℃ 조건에서 사육하였다.

1-2. 형질전환 초파리(Transgenic flies)

UAS-FUS 라인(line)은 Nancy M. Bonini(University of Pennsylvania)로부터 얻었다. UAS-Shaggy^WT, UAS-Shaggy^DN, UAS-Shaggy RNAi 라인은 블루밍턴 초파리 스톡 센터(Bloomington Drosophila stock center)에서 얻었다. UAS-SlimbΔF 라인은 Jin Jiang(University of Texas Southwestern Medical Center)으로부터 얻었다. UAS-mitoGFP 라인은 H. J. Bellen(Baylor College of Medicine)으로부터 얻었다. pan-neuronal driver, elav-Gal4, eye-specific driver, GMR-Gal4, dopaminergic neuron-specific driver, TH-Gal4 라인은 블루밍턴 초파리 스톡 센터(Bloomington Drosophila Stock Centre)에서 얻었다. 유전적 배경에 따라 W¹¹¹⁸ 초파리를 대조군으로 사용했다.

1-3. 외부 눈 마이크로스코피(External eye microscopy)

초파리 성충의 머리를 슬라이드 글라스에 고정한 후 디지털 카메라를 사용하여 초파리 성충의 눈 이미지를 촬영하였다. 5 일령(齡)의 수컷 초파리가 실험에 사용되었다. Leica MZ10 F 스테레오마이크로스코프(stereomicroscope)와 Leica DFC450 카메라 시스템(camera system)을 사용하여 상기 초파리 눈의 디지털이미지를 촬영하였으며, 상기 이미지는 Adobe Photoshop 7.0 이미징 소프트웨어(imaging software)를 사용하여 프로세싱 및 일러스트레이션하였다.

1-4. 이뮤노블롯 분석(Immunoblot analysis)

웨스턴 블롯 분석을 위한 단백질 추출물은 LDS 샘플 버퍼 (Invitroge)에서 14일 된 수컷 초파리 10마리의 머리를 균질화하여 제하조였으며, 총 단백질 추출물을 4%~12% 구배 SDS-PAGE 겔을 사용하여 분리하고, PVDF 멤브레인 (Millipore)으로 옮긴 후, 멤브레인을 4% 탈지 분유(non-fat dry milk) 또는 4% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)을 함유한 Tris-완충 식염수(tris-buffered saline, TBS)로 1시간 동안 블로킹하고, 1차 항체와 함께 4℃에서 12시간 동안 배양하였다.

이 때, 사용한 1차 항체는 다음과 같다:

토끼 항-포스포-GSK-3α/β(rabbit anti-phospho-GSK-3α/β) (Ser21/9)(1:1000, Cell Signaling), 토끼 항 FUS(rabbit anti-FUS) (1:1000, Bethyl Laboratories) 및 토끼 항-β-액틴(rabbit anti-β-actin ) (1:4000, Cell Signaling).

블롯은 0.1% 트윈-20(TBS containing 0.1% Tween-20, TBST)을 함유하는 TBS에서 세척하고 2차 항체를 적용하여 배양 하였다. 상기의 1차 항체는 토끼 IgG HRP 접합체 및 염소 항-마우스 IgG HRP 접합체(1:2000, Millipore)와 같이 HRP(horseradish peroxidase)와 접합한 2차 항체에 의해 감지된다. 상기의 감지 과정은 ECL-Plus kit(Amersham)를 사용하여 수행했다.

1-5. 운동성 분석(Locomotive activity assays)

초파리 유충의 크롤링(crawling) 분석시, 남아있는 먹이 매체를 제거하기 위해 3기 령(齡)의 유충(3rd instar larvae)을 PBS 용액으로 세척한다. 유충을 깨끗한 여과지에서 건조시키고 2% 포도즙 한천 페트리 접시(grape juice-agar petri plate)에 놓았다. 상기의 유충은 90초 동안 크롤링할 수 있도록 놓아 두었다. 유충의 크롤링 동작을 정량화하기 위해 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 유충을 추적하고 거리를 측정했다. 각 트랜스제닉 라인(transgenic line)에 대해 적어도 10마리의 유충의 크롤링을 관찰하여 평균을 구했다.

초파리 성충의 클라이밍 분석을 위해, 각 연령 집단의 수컷 초파리 10마리를 이산화탄소(CO₂)로 마취시키고 칼럼 바이알(column vial)에 넣었다. 초파리를 빈 바이알(empty vial)에 옮기고 실온에서 1시간 동안 배양하여 환경에 적응시켰다. 바이알을 두드리고, 초파리를 바닥에 떨어뜨린 후 10초 이내에 바이알의 꼭대기까지 올라가는 초파리의 수를 세었다. 상기의 실험은 5분 간격으로 각 트랜스제닉 라인에 대해 독립적으로 4회 반복하였다. 모든 클라이밍 실험은 25℃에서 수행하였다.

1-6. 미토콘드리아 이미징과 형태(Mitochondrial imaging and morphology)

뇌의 도파민성 뉴런(dopaminergic neurons)의 미토콘드리아 이미징을 위해, 7일 된 수컷 초파리 성충을 PBS용액에서 해부하고 고정 완충액(100mM PIPES, 1mM EGTA, 1% Triton X-100 및 2mM MgSO₄, pH 6.9)으로 25분간 처리하였다. 그 다음, 세척 완충액(50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 및 0.5mg/ml BSA, pH6.8)으로 헹군다. 샘플은 SlowFadeTM Gold antifade 시약(Invitrogen)을 사용하여 커버슬립(coverslips)에 고정했다. 이미지는 Carl Zeiss 공초점현미경(confocal microscope, LSM710)를 사용하여 얻었다.

1-7. 염화리튬 처리 후 분석(Assay for lithium chloride treatment)

염화리튬(LiCl, Sigma-Aldrich)과 염화나트륨(NaCl, Sigma-Aldrich)을 물에 녹여 10M 저장 용액을 만들었고, 이를 표준 초파리 먹이에 첨가하였다. 새롭게 분류된 성충과 유충을 염화리튬이 함유된 먹이가 담긴 바이알에 옮기고 실험을 하기 전에 7일 동안 성숙시켰다.

실시예 2.Shaggy 단백질과 세포독성의 연관성 확인

초파리 눈 조직에서 근위축성 측색 경화증의 원인 유전자로 알려진 유전자, FUS의 발현을 증가시켜 세포사멸을 유도하였다.

본 실시예에서는 Shaggy 유전자(Sgg)와 세포사멸을 유도하는 세포독성의 관련성을 확인하기위해, 초파리 눈 조직에서 FUS의 발현을 증가시킨 후 Shaggy 유전자(Sgg)를 조절하여 단백질의 활성을 억제하거나(Dominant Negative) 발현량을 감소시키고(RNAi) 초파리 눈 모양의 변화를 관찰하는 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 1에서 나타낸 바와 같이 Shaggy의 불활성화 또는 발현량이 감소한 경우 세포사멸이 유도되었던 초파리 눈 조직이 정상 눈 모양으로 회복된 것을 확인하였다.

이를 통해 Shaggy의 불활성화 또는 발현량의 감소가 세포독성을 억제한다는것을 확인하였다. 한편, GSK3β는 상기의 Shaggy의 포유류 상동 단백질이다. 따라서 GSK3β는 세포독성의 억제와 관련이 있을 것이라는 추론이 가능하다.

실시예 3. Shaggy와 FUS의 상호 영향 확인

3-1. FUS가 Shaggy의 활성에 미치는 영향 확인

Shaggy의 활성과 관련하여, Shaggy의 9번 아미노산 세린(Serine)이 인산화되면 상기 단백질의 활성이 감소하며, 9번 아미노산 세린의 인산화가 감소하면 상기 단백질의 활성이 증가하는 것이 알려져 있다.

본 실시예에서는 초파리 신경세포 내 FUS가 Shaggy의 활성에 미치는 영향을 확인하기위해, 9번 아미노산 세린이 인산화된 Shaggy의 양을 측정하는 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 2에서 나타낸 바와 같이 신경세포 내 FUS의 발현이 증가한 경우 9번 아미노산 세린이 인산화된 Shaggy의 양이 감소된 것을 확인하였다. 이로써, FUS의 발현이 증가하면(근위축성 측색 경화증 발병 시) Shaggy의 인산화가 감소하여 Shaggy의 활성이 증가함을 알 수 있다.

3-2. Shaggy가 FUS의 발현량에 미치는 영향 확인

본 실시예에서는 Shaggy가 신경세포 내 FUS의 양에 미치는 영향을 확인하기위해, 신경세포에서 FUS의 발현을 증가시킨 후 Shaggy가 불활성화되거나 감소하였을 때 상기 FUS의 양을 측정하는 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 3에서 나타낸 바와 같이 Shaggy가 불활성화 되거나 발현량이 감소한 경우 신경세포 내 FUS의 양이 감소한다는 것을 확인하였다. 또한, 야생형 Shaggy가 증가하면 신경세포 내 FUS의 양이 증가하는 것을 확인하였다.

실시예 4. Shaggy가 운동능력감소 회복에 미치는 영향 확인

초파리 신경세포 내 FUS의 양이 증가하면, 근위축성 측색 경화증의 증상 중 하나인 운동능력의 감소가 초파리에서 발견된다.

본 실시예에서는 Shaggy 유전자(sgg)를 억제하면 신경세포에서 FUS의 증가로 인한 운동능력 감소가 회복되는지 여부를 확인하기위해, Shaggy를 불활성화 또는 감소시킨 후 초파리 유충 및 성충의 운동능력을 측정하는 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 4 및 도 5에서 나타낸 바와 같이 신경세포에서 FUS의 증가하면 초파리 유충(larvae)의 운동능력이 감소하는데, Shaggy의 불활성화 또는 감소가 있는 경우에는 상기 운동능력감소가 회복되는 것을 확인하였다. 또한, 야생형 Shaggy가 증가하면 초파리 유충의 운동능력감소가 커지는 것을 확인하였다.

또한, 초파리 성충의 경우 상기와 같은 실험을 수행하되, 실험 1일, 3일 및 7일에 각각 운동능력을 측정하였다.

그 결과, 도 6에서 나타낸 바와 같이 초파리 유충의 운동능력 변화추이와 일치하는 결과를 얻었다.

실시예 5. Shaggy가 미토콘드리아 크기감소 회복에 미치는 영향 확인

초파리 신경세포 내 FUS의 양이 증가하면, 근위축성 측색 경화증의 증상 중 하나인 미토콘드리아의 크기의 감소가 초파리에서 발견된다. 상기의 미토콘드리아 크기의 감소는 미토콘드리아의 기능 손상을 의미한다.

본 실시예에서는 Shaggy의 활성 감소 시 신경세포에서 FUS로 인한 미토콘드리아 크기감소가 회복되는지 여부를 확인하기위해, Shaggy를 불활성화한 후 미토콘드리아 크기를 관찰하는 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 7에서 나타낸 바와 같이 신경세포에서 Shaggy가 불활성화 되면 신경세포 내 미토콘드리아의 크기감소가 회복되는 것을 확인하였다.

실시예 6. Slimb를 통한 FUS의 분해 확인

Shaggy가 불활성화 되거나 감소하면 FUS가 직접적으로 감소(실시예 3-2 참조)하는 것에 착안하여, 상기의 단백질의 양의 감소에 단백질 분해시스템의 관여가 있을 것이라는 가설을 세웠다.

Slimb(F box protein)는 초파리 단백질로, SCF 유비퀴틴 리가아제(SCF ubiquitin ligase)이며, 표적단백질에 유비퀴틴을 붙여 프로테오좀에서 분해를 유도하는 단백질이다.

본 실시예에서는 상기의 분해시스템에 관여하는 단백질인 Slimb와 세포독성과의 연관성을 확인하기위해, FUS가 증가하여 손상된 초파리 눈 조직에서 Slimb의 활성에 따른 초파리 눈 모양의 변화를 관찰하는 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 8에서 나타낸 바와 같이 야생형 Slimb의 발현량이 증가하면 FUS로 인한 초파리 눈 조직의 손상이 회복되는 것을 확인하였다. 또한, Slimb의 활성이 감소하면(Slimb DN 형태, SlimbΔN 발현 증가) 눈 조직의 손상이 회복되지 않는 것을 확인하였다.

또한, 상기의 실험 과정에서 Slimb의 활성에 따른 초파리의 신경세포 내 FUS의 양을 측정한 결과, 도 9에서 나타낸 바와 같이 야생형 Slimb의 발현량이 증가하면 FUS의 양이 감소하고, Slimb의 활성이 감소하면(Slimb DN 형태, SlimbΔN 발현 증가) FUS의 양이 증가하는 것을 확인하였다.

또한, Shaggy에 의한 FUS의 양 감소가 Slimb를 통해 일어나는 것인지 여부를 확인하기위해, Shaggy를 불활성화하고 Slimb의 활성을 감소시킨 후(Slimb DN 형태, SlimbΔN 발현 증가) 신경세포 내 FUS의 양을 측정하는 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 10에서 나타낸 바와 같이 Shaggy가 불활성화 되면 FUS의 양이 감소하,나 Slimb의 활성을 감소시키면 Shaggy가 불활성화 되더라도 FUS의 양은 감소하지 않는다는 것을 확인하였다.

또한 초파리 유충의 운동능력을 측정한 결과, 도 11에서 나타낸 바와 같이 Shaggy가 불활성화 되면 운동능력감소가 회복되나, Slimb의 활성을 감소시키면 Shaggy가 불활성화 되더라도 대조군과 비교 시 운동능력감소가 유의하게 회복되지 않은 것을 확인하였다.

이로써, Shaggy가 Slimb를 통해 FUS를 분해한다는 것을 확인할 수 있었다. 한편, β-TrCP는 상기 Slimb의 포유류 상동 단백질이다. 따라서 β-TrCP는 상기의 Slimb와 같이 FUS의 분해에 관여할 것이라는것을 예측할 수 있다.

실시예 7. Shaggy 활성을 억제 시 초파리의 운동능력감소 회복확인

리튬(Li)은 포유동물에서 GSK3β 활성을 억제하는 것으로 알려져 있다.

본 실시예에서는 FUS로 인한 초파리 유충의 운동능력감소가 리튬에 의해 회복되는지 여부를 확인하기위해, 리튬을 초파리 유충에 투여하고 운동능력을 측정하는 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 12 및 도 13에서 나타낸 바와 같이 상기 리튬 투여시 FUS로 인한 초파리 유충의 운동능력감소가 회복되는 것을 확인하였다.

또한, 도 14에서 나타낸 바와 같이 리튬을 투여시 신경세포 내 FUS가 감소하는 것을 확인하였다. 이는 Shaggy가 불활성화 되거나 감소할 때 신경세포 내 FUS의 양이 감소하는 것과 동일한 결과이다(실시예 3-2 참조).

상기의 결과부터 Shaggy 또는 GSK3β의 활성억제가 FUS에 의해 유발되는 근위축성 측색 경화증의 증상 중 하나인 운동능력감소의 회복에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 확인하였다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Soonchunhyang University Industry Academy Cooperation Foundation <120> Screening method of therapeutic agents for neurodegenerative diseases <130> PD18-121 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1533 <212> DNA <213> Slimb <400> 1 atgatgaaaa tggagactga caaaataatg gacgaaacca actccaatgc acaggccttc 60 acaaccacta tgctgtacga cccggtgcgc aagaaagact catcgcccac ctaccaaacg 120 gagcgggaac tctgctttca gtacttcacc cagtggagcg agtcgggcca ggtggacttt 180 gtggagcacc tgctgtcgcg catgtgccac tatcaacacg gacagatcaa tgcctatctc 240 aagccgatgc tccagcggga ctttatcaca ttgctgccaa tcaagggtct ggatcacatc 300 ggagaaaaca ttttgtcgta cttggatgcc gaatcgctca aatcgtccga gctggtctgc 360 aaggaatggc tgcgcgtcat ttccgagggc atgctctgga agaagctcat cgaacgcaag 420 gtgcgcacag attccttgtg gcgcggactg gccgagcggc gtaattggat gcagtacctc 480 ttcaagccaa gaccgggcca gactcaacgg ccacactcat tccatcgcga gttgttcccc 540 aagataatga atgacattga cagcatagag aacaactggc ggactggccg ccacatgctg 600 cgccgcatca actgccggtc cgagaactcg aagggtgtct attgtctgca 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agtggtgtgg atcagttggt agaaataatc aaggtcctgg gaactccaac aagggagcaa 840 atcagagaaa tgaacccaaa ctacacagaa tttaaattcc ctcaaattaa ggcacatcct 900 tggactaagg tcttccgacc ccgaactcca ccggaggcaa ttgcactgtg tagccgtctg 960 ctggagtata caccaactgc ccgactaaca ccactggaag cttgtgcaca ttcatttttt 1020 gatgaattac gggacccaaa tgtcaaacat ccaaatgggc gagacacacc tgcactcttc 1080 aacttcacca ctcaagaact gtcaagtaat ccacctctgg ctaccatcct tattcctcct 1140 catgctcgga ttcaagcagc tgcttcaacc cccacaaatg ccacagcagc gtcagatgct 1200 aatactggag accgtggaca gaccaataat gctgcttctg catcagcttc caactccacc 1260 tga 1263 <210> 8 <211> 420 <212> PRT <213> GSK3 beta <400> 8 Met Ser Gly Arg Pro Arg Thr Thr Ser Phe Ala Glu Ser Cys Lys Pro 1 5 10 15 Val Gln Gln Pro Ser Ala Phe Gly Ser Met Lys Val Ser Arg Asp Lys 20 25 30 Asp Gly Ser Lys Val Thr Thr Val Val Ala Thr Pro Gly Gln Gly Pro 35 40 45 Asp Arg Pro Gln Glu Val Ser Tyr Thr Asp Thr Lys Val Ile Gly Asn 50 55 60 Gly Ser Phe Gly Val Val Tyr Gln Ala Lys Leu Cys Asp Ser Gly Glu 65 70 75 80 Leu Val Ala Ile Lys Lys Val Leu Gln Asp Lys Arg Phe Lys Asn Arg 85 90 95 Glu Leu Gln Ile Met Arg Lys Leu Asp His Cys Asn Ile Val Arg Leu 100 105 110 Arg Tyr Phe Phe Tyr Ser Ser Gly Glu Lys Lys Asp Glu Val Tyr Leu 115 120 125 Asn Leu Val Leu Asp Tyr Val Pro Glu Thr Val Tyr Arg Val Ala Arg 130 135 140 His Tyr Ser Arg Ala Lys Gln Thr Leu Pro Val Ile Tyr Val Lys Leu 145 150 155 160 Tyr Met Tyr Gln Leu Phe Arg Ser Leu Ala Tyr Ile His Ser Phe Gly 165 170 175 Ile Cys His Arg Asp Ile Lys Pro Gln Asn Leu Leu Leu Asp Pro Asp 180 185 190 Thr Ala Val Leu Lys Leu Cys Asp Phe Gly Ser Ala Lys Gln Leu Val 195 200 205 Arg Gly Glu Pro Asn Val Ser Tyr Ile Cys Ser Arg Tyr Tyr Arg Ala 210 215 220 Pro Glu Leu Ile Phe Gly Ala Thr Asp Tyr Thr Ser Ser Ile Asp Val 225 230 235 240 Trp Ser Ala Gly Cys Val Leu Ala Glu Leu Leu Leu Gly Gln Pro Ile 245 250 255 Phe Pro Gly Asp Ser Gly Val Asp Gln Leu Val Glu Ile Ile Lys Val 260 265 270 Leu Gly Thr Pro Thr Arg Glu Gln Ile Arg Glu Met Asn Pro Asn Tyr 275 280 285 Thr Glu Phe Lys Phe Pro Gln Ile Lys Ala His Pro Trp Thr Lys Val 290 295 300 Phe Arg Pro Arg Thr Pro Pro Glu Ala Ile Ala Leu Cys Ser Arg Leu 305 310 315 320 Leu Glu Tyr Thr Pro Thr Ala Arg Leu Thr Pro Leu Glu Ala Cys Ala 325 330 335 His Ser Phe Phe Asp Glu Leu Arg Asp Pro Asn Val Lys Leu Pro Asn 340 345 350 Gly Arg Asp Thr Pro Ala Leu Phe Asn Phe Thr Thr Gln Glu Leu Ser 355 360 365 Ser Asn Pro Pro Leu Ala Thr Ile Leu Ile Pro Pro His Ala Arg Ile 370 375 380 Gln Ala Ala Ala Ser Thr Pro Thr Asn Ala Thr Ala Ala Ser Asp Ala 385 390 395 400 Asn Thr Gly Asp Arg Gly Gln Thr Asn Asn Ala Ala Ser Ala Ser Ala 405 410 415 Ser Asn Ser Thr 420

Claims

하기 단계를 포함하는, 근위축성 측색 경화증 치료 물질 스크리닝 방법:
(a) 후보물질을 분리된 신경세포에 처리하는 단계;
(b) 상기 후보물질이 처리된 신경세포에서 Slimb 또는 β-TrCP 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및
(c) 후보물질 비처리군에 비해 상기 발현 또는 활성 수준이 증가하는 경우 근위축성 측색 경화증 치료 물질로 선정하는 단계.
삭제
제1항에 있어서,
상기 후보물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 근위축성 측색 경화증 치료 물질 스크리닝 방법.
제1항에 있어서,
상기 Slimb 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 근위축성 측색 경화증 치료 물질 스크리닝 방법.
제1항에 있어서,
상기 Slimb는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 근위축성 측색 경화증 치료 물질 스크리닝 방법.
제1항에 있어서,
상기 β-TrCP 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 근위축성 측색 경화증 치료 물질 스크리닝 방법.
제1항에 있어서,
상기 β-TrCP는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 근위축성 측색 경화증 치료 물질 스크리닝 방법.
제1항에 있어서,
상기 발현 또는 활성의 측정은 중합효소연쇄반응(PCR), 마이크로어레이(microarray), 노던 블롯팅(northern blotting), 웨스턴 블롯팅(western blotting), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 면역화학염색법(immunohistochemistry) 및 면역형광염색법(immunofluorescence)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는, 근위축성 측색 경화증 치료 물질 스크리닝 방법.