KR102208546B1 - GstO2를 포함하는 신경계 퇴행성 질환 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 GstO2를 포함하는 신경계 퇴행성 질환 치료용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명자들은 근위축성 측삭 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis)의 유발 단백질로 알려진 FUS의 glutathionylation이 세포질 내 응집 및 신경 독성을 증가시키는 루게릭병의 발병 기작임을 규명하였고, FUS 단백질의 탈글루타치오닐화 (delglutathionylation)를 유도하는 인자인 GSTO1 또는 GstO2을 동정, 이를 이용하여 뇌 세포질 응집 및 신경 세포 독성을 억제하는 효과를 확인하였는바, 신경계 퇴행성 질환의 예방, 치료 또는 개선 용도로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

GstO2를 포함하는 신경계 퇴행성 질환 치료용 조성물 {Composition for treating neurodegenerative diseases including GstO2}

본 발명은 GstO2를 포함하는 신경계 퇴행성 질환 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, FUS 단백질의 탈글루타치오닐화를 유도하는 GstO2를 유효성분으로 포함하는 신경계 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

단백질 응집체는 연령과 관련된 신경 퇴행성 질환 (neurodegenerative diseases, ND), 예를 들어, 파킨슨병 (Parkinsons disease, PD), 알츠하이머병 (Alzheimers disease, AD), 헌팅턴병 (Huntingtons disease, HD) 및 근위축성 측삭 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis, ALS, 일명 루게릭 병)에서 특징적으로 발견된다.

FUS (Fused in Sarcoma)는 RNA/DNA결합 단백질로서, FUS의 N-말단은 전사 활성과 연관되어 있는 한편, C-말단은 단백질 및 RNA 결합에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한, FUS가 전사 인자인 AP2, GCF, Sp1에 대한 인지 사이트를 가지는 것으로 확인된 바 있으며, 최근 루게릭 병 환자나 전측두엽성 치매 환자에게서 FUS의 여러 돌연변이가 발견되었다고 보고된 바 있다. 이러한 돌연변이와 관련하여, 흥미롭게도 FUS 돌연변이 단백질은 핵 내의 원래 위치에서 벗어나 핵 밖으로 빠져 나온 뒤 스트레스 과립(stress granule)에 위치하여 응집체를 이루는 것으로 보고되고 있다.

한편, ALS 환자 대부분으로부터 FUS 돌연변이가 확인되고 있으며 (Mackenzie et al., 2010), FUS^P525L 돌연변이는 세포질 mislocalization을 보여주며, 급성 FUS 유발-ALS와 관련이 있고 (Sun et al., 2011), FUS 야생형 및 이의 변종인 FUS^P525L는 초파리에서 거친 눈, 운동성 감소 등의 동일한 표현형을 나타내는 것으로 알려져 있다 (Chen et al., 2016; Jackel et al., 2015).

그러나, 루게릭 병 환자나 전측두엽성 치매 환자에게서 발견되는 이들 FUS 돌연변이 단백질의 비정상적인 위치와 응집체 축적과 관련된 메커니즘 연구는 거의 알려진 바 없으며, 이에 근거한 치료법에 대해서도 전무한 실정이다.

상기와 같이 FUS 응집체 형성 및 이의 작용 기전을 확인하여 치료약물을 개발하고자 다양한 연구가 시도되었으나 (한국등록특허 10-1576602), 아직은 부족한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 다양한 연구를 진행한 결과, 근위축성 측삭 경화증 유발 단백질로 알려진 FUS 단백질의 글루타치오닐화 (glutathionylation)로 인한 단백질 응집체의 형성 및 이의 뇌 신경세포 세포질 침착이 근위축성 측삭 경화증의 발병 원인임을 확인하였으며, GSTO (omega class glutathione transferase)의 FUS 단백질의 글루타치오닐화 억제 활성을 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 GSTO1 (omega class glutathione transferase 1) 또는 GstO2 (omega class glutathione transferase 2) 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 유효성분으로 포함하는, 신경계 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

GSTO1 (omega class glutathione transferase 1) 또는 GstO2 (omega class glutathione transferase 2) 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 유효성분으로 포함하는, 신경계 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로 상기 GSTO1 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로 상기 GSTO1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로 상기 GstO2 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로 상기 GstO2 단백질은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로 상기 신경계 퇴행성 질환은 근위축성 측삭 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로 상기 조성물은 FUS 단백질의 글루타치오닐화를 억제시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로 상기 FUS 단백질의 글루타치오닐화는 상기 FUS의 Cys-447 잔기에서 글루타치오닐화될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경계 퇴행성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물의 신경계 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용도를 제공한다.

본 발명자들은 근위축성 측삭 경화증 유발 단백질로 알려진 FUS의 글루타치오닐화 (glutathionylation)가 세포질 내 응집 및 신경 독성을 증가시키는 근위축성 측삭 경화증의 발병 기작임을 규명하였으며, 이에, 본 발명의 신경계 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 FUS 단백질의 탈글루타치오닐화 (delglutathionylation)를 유도하는 GSTO1 또는 GstO2를 포함함으로써, 뇌 세포질 응집 및 신경 세포 독성을 억제하는 효과를 확인하였는바, 신경계 퇴행성 질환의 예방, 치료 또는 개선 용도로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a는 GSSG의 존재 하에 FUS 단백질의 글루타치오닐화 여부를 확인한 결과이다.
도 1b는 글루타치오닐화된 FUS 단백질의 초파리 뇌의 뉴런의 세포질에 위치하는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 1c는 N2a의 세포질에서 FUS 및 인간 돌연변이 FUS^P525L 단백질의 응집체를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 1d는 글루타치오닐화된 FUS 단백질의 MALDI-질량 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 1e는 RanBP2형 ZnF 도메인의 서열을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 1f는 FUS 단백질의 응집체 형성 실험을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 1g는 FUS 단백질 용해도를 웨스턴블랏으로 확인한 결과이다.
도 1h는 FUS 단백질의 RanBP2형 ZnF 도메인의 3차원 상동 모델을 나타낸 것이다.
도 2a는 GstO2에 따른 FUS 발현 파리의 눈 표현형을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 GstO2에 따른 FUS 발현 파리의 유충 크롤링 활동을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2c는 GstO2에 따른 FUS 발현 파리의 NMJ (neuromuscular junction)에서 시냅스 버튼 (synaptic bouton) 수를 확인한 결과이다.
도 2d는 GstO2에 따른 FUS 발현 파리의 수명을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2e는 GstO2-녹다운에 따른 FUS 발현 파리의 수명을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2f는 GstO2에 따른 FUS 발현 파리의 등반 활성을 확인한 결과이다.
도 3a는 GstO2에 따른 FUS 발현 파리의 미토콘드리아의 크기를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3b는 GstO2에 따른 FUS 발현 파리의 미토콘드리아 형태를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3c는 GstO2에 따른 FUS 발현 파리의 Marf 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3d는 GstO2에 따른 FUS 발현 파리의 미토콘드리아 복합체 함량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3e는 GstO2에 따른 FUS 발현 파리의 BN-PAGE 수행 결과를 나타낸 것이다.
도 3f는 GstO2에 따른 FUS 발현 파리의 ROS 생산을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3g는 GstO2에 따른 FUS 발현 파리의 ATP 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3h는 GstO2에 따른 FUS 발현 파리에서 세포질 내 산화된 단백질 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 GstO2에 따른 FUS 발현 파리의 뇌 추출물의 면역블롯팅 결과이다.
도 4b는 GstO2-녹다운에 따른 FUS 발현 파리의 뇌 추출물의 면역블롯팅 결과이다.
도 4c는 GstO2에 따른 FUS 발현 파리의 핵/세포질 분획 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4d는 GstO2에 따른 FUS 발현 파리의 FUS 응집체를 확인하기 위한 용해도 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4e는 GSTO1 또는 GstO3의 녹다운에 따른 FUS 응집체를 확인하기 위한 용해도 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4f는 GstO2에 따른 FUS 발현 파리의 미토콘드리아에서의 FUS 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 GstO2에 따른 FUS 발현 파리의 신경 세포에서 FUS의 글루타치오닐화 조절을 확인하기 위한 이중 면역형광분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5b는 내인성 GstO2에 의한 글루타치오닐화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 GstO2에 따른 FUS^P525L 발현 파리의 유충 크롤링 활동을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6b는 GstO2에 따른 FUS^P525L 발현 파리의 뇌 추출물의 면역블롯팅 결과를 나타낸 것이다.
도 6c는 GstO2에 따른 FUS^P525L 발현 파리의 FUS 응집체를 확인하기 위한 용해도 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7a는 GstO2의 인간 상동 염색체인 GSTO1의 FUS 유도 신경 독성 조절을 확하기 위해 Myc-DDK-GSTO1 융합 단백질을 발현하는 안정 N2a 세포주의 GSTO1 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7b는 GstO2의 인간 상동 염색체인 GSTO1에 따른 FUS 응집체를 확인하기 위한 용해도 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7c는 GstO2의 인간 상동 염색체인 GSTO1에 따른 신경 세포 사멸 회복 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 신경계 퇴행성 질환 치료와 관련하여 다양한 연구를 진행한 결과, 근위축성 측삭 경화증 유발 단백질로 알려진 FUS 단백질의 글루타치오닐화 (glutathionylation)로 인한 단백질 응집체의 형성 및 이의 뇌 신경세포 세포질 침착이 근위축성 측삭 경화증의 발병 원인임을 확인하였으며, GSTO (omega class glutathione transferase)의 FUS 단백질의 글루타치오닐화 억제 활성을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 GSTO1 (omega class glutathione transferase 1) 또는 GstO2 (omega class glutathione transferase 2) 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 유효성분으로 포함하는, 신경계 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 GSTO1 (omega class glutathione transferase 1) 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열 (Human GSTO1 NCBI Accession: NM_004832.2)로 이루어질 수 있으며, 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열 (Human GSTO1 NCBI Accession: NP_004823.1)로 이루어진 것일 수 있다. 이 때, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상, 가장 바람직하게는 95 % 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 GstO2 (omega class glutathione transferase 2) 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열 (Drosophila GstO2 NCBI Accession: NM_168277.2)로 이루어질 수 있으며, 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열 (Drosophila GstO2 NCBI Accession: NP_729388.1)로 이루어진 것일 수 있다. 이 때, 상기 서열번호 3으로 표시되는 염기서열과 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상, 가장 바람직하게는 95 % 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명에서 대상으로 하는 질환인 “신경계 퇴행성 질환”은 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 발생하는 모든 뇌질환을 포함하는 광의의 개념을 의미하며, 퇴행성 뇌질환은 대부분 발병 원인이 알려져 있지 않지만, 연관 신경계를 선택적으로 침범하며, 질병의 발병이 천천히 시작해서 지속적인 진행을 보이는 것이 특징이다. 바람직하게는 알츠하이머병, 경도인지장애, 뇌졸중 및 혈관성 치매, 전두측두엽 치매, 루이소체 치매, 크로이츠펠트-야콥병, 외상성 두부 손상, 매독, 후천성 면역 결핍 증후군 및 기타 바이러스 감염, 뇌농양, 뇌종양, 다발성경화증, 대사성 질환에 의한 치매, 저산소증, 파킨슨병, 루게릭병, 헌팅턴병, 픽병, 근위축성 측삭 경화증, 간질, 허혈, 중풍, 주의력결핍-과잉행동장애, 정신분열증, 우울증, 조울증, 외상 후 스트레스 장애, 척수손상, 척수염 등을 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 근위축성 측삭 경화증일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 신경계 퇴행성 질환의 발병 원인 단백질로 알려진 “FUS” 단백질은 RNA/DNA결합 단백질로서, FUS의 N-말단은 전사 활성과 연관되어 있는 한편, C-말단은 단백질 및 RNA 결합에 관여하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 “글루타치오닐화 (glutathionylation)”는 시스테인과 환원된 글루타치온 (GSH) 사이 디설파이드 결합의 결과로써, 이로 인해, 단백질 구조 및 기능의 변화를 가져올 수 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서는 전술한 바와 같이, 근위축성 측삭 경화증 유발 단백질로 알려진 FUS 단백질의 글루타치오닐화 (glutathionylation)로 인한 단백질 응집체의 형성 및 이의 뇌 신경세포 세포질 침착이 근위축성 측삭 경화증의 발병 원인임을 확인하였다. 이에, 본 발명의 일실시예에서는 FUS를 GSSG의 존재 하에 배양한 결과, GSH의 함량이 증가하면서, 글루타치오닐화된 FUS 함량이 증가되는 것을 확인하였을 뿐만 아니라, FUS의 Cys-447에서 글루타치오닐화 된다는 것을 확인하였으며 (실시예 2 참조), FUS의 글루타치오닐화로 인해, FUS의 응집체 형성을 구체적으로 확인하였다 (실시예 3 참조).

본 발명의 다른 일실시예에서는 글루타치오닐화된 FUS로 인한 병리를 조절할 수 있는 단백질로서, GstO를 동정하였으며, GstO2의 초파리에서 FUS의 과발현으로 인한 표현형 결손 및 미토콘드리아 분열 및 기능장애에 대한 완화 효과를 확인하였다 (실시예 4 및 5 참조).

본 발명의 또 다른 일실시예에서는 GstO2에 의해 초파리 신경세포에서의 FUS의 응집체 형성 억제 효과를 확인하였을 뿐만 아니라, GstO2로 인해 초파리 신경세포에서 FUS의 글루타치오닐화를 조절하는지를 구체적으로 확인하였고 (실시예 6 및 7 참조), 또한, FUS 돌연변이 FUS^P525L의 발현으로 인한 ALS 표현형을 나타내는 파리에 대해서도 GstO2의 과발현 FUS와 동일한 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다 (실시예 8 참조). 마지막으로 본 발명자들은 FUS 유도 신경 세포 독성에 대한 GstO2의 회복 효과가 포유류 시스템에도 적용되는지 확인하기 위해서, GstO2의 인간 상동 염색체인 GSTO1에 대해 신경 세포 독성 억제 효과를 확인한 결과, ALS의 포유류 신경 세포 모델에서도 FUS 불용성 및 FUS 유도 세포사를 개선시키는 효과를 구체적으로 확인하였다 (실시예 9 참조).

상기 경과들은 GSTO1 (omega class glutathione transferase 1) 또는 GstO2 (omega class glutathione transferase 2)가 FUS의 탈글루타치오닐화를 유도하여, FUS 세포질 내 응집 및 신경 독성 억제 효과를 나타내는바, 신경계 퇴행성 질환의 치료제로써 유용하게 이용될 수 있음을 시사한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 GSTO1 (omega class glutathione transferase 1) 또는 GstO2 (omega class glutathione transferase 2) 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 유효성분으로 포함하며, 또한 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제, 또는 경구 섭취제 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 피부, 비강, 기도에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 신경계 퇴행성 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경계 퇴행성 질환 예방, 조절 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “예방”이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 신경계 퇴행성 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 신경계 퇴행성 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 "개체"란 질병의 예방, 조절 또는 치료방법을 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 노랑초파리 (Drosophila melanogaster) 준비

모든 초파리 스톡 (stock)은 표준 먹이 조건 (standard food condition), 상온 조건 (normal temperature)(25 ℃) 및 정상 습도 조건 (normal humidity condition)(60 %)에서 보관하였으며, 초파리의 교배 (crossing)는 표준 절차에 따라 수행하고, 모든 자손은 25 ℃ 조건에서 사육하였다.

1-2. 세포 배양 (cell culture)

마우스 신경아세포종 (neuroblastoma)인 Neuro2a 세포는 10 % 소 태아 혈청 (fetal bovine serum; FBS)(gibco) 및 페니실린-스트렙토마이신 (50 ㎎/㎖)(gibco) 용액을 함유하는 DMEM (Life Technologies)에서 37 ℃, 5 % CO₂/95 % air 조건에서 배양하였다.

1-3. in vitro 글루타치오닐화 분석 (in vitro glutathionylation assay)

HEK293 (OriGene) 세포로부터 정제된 myc-태그 인간 FUS (0.51 ㎍)의 재조합 전장 (full-length) 단백질을 산화 형태 글루타치온(Glutathione disulfide, GSSG)의 다양한 농도의 존재하의 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)에서 25 ℃ 온도 조건에서 배양하였으며, 배양 1 시간 후, 샘플을 아이스 (ice) 상에 놓고, 3 × 비-환원성 LDS 샘플 완충액 (Invitrogen)을 첨가하였다. 이 후, 상기 샘플을 12 % SDS-PAGE로 분리하여 마우스 항-GSH (1:1,000; ViroGen Corp.) 및 마우스 항-myc (1:1,000; Millipore) 항체를 이용하여 웨스턴블랏 분석을 수행하였다.

1-4. 형질 전환 파리

UAS-FUS, UAS-FUS^P525L 세포주는 Nancy M. Bonini (University of Pennsylvania)로부터 수득하였고, UAS-GstO2 세포주는 이전에 기술되어 있는 문헌 (Kim et al., 2012; Kim and Yim, 2013)에 따라 수득하였다. 또한, UAS-GSTO1 RNAi (BL34727, v26711), UAS-GstO2 RNAi (v109255), 및 UAS-GstO3 RNAi (v105274) 세포주는 Bloomington Drosophila stock center 및 Vienna Drosophila RNAi center로부터 수득하였고, UAS-mitoGFP 세포주는 H. J. Bellen (Baylor College of Medicine)으로부터 수득하였으며, pan-neuronal driver, elav-Gal4, muscle-specific driver, mhc-Gal4, 및 motor neuron-specific driver, D42-Gal4 세포주 또한 Bloomington Drosophila stock center 및 Vienna Drosophila RNAi center로부터 수득하였다. 이 때, 유전적 배경기술에 따라 W1118 파리를 대조군으로 사용하였다.

1-5. 형질 감염 (transfection)

N2a 세포를 6웰 플레이트에 분주하고, 각 웰에 4 ㎍의 pCMV6-FUS-GFP(green fluorescent protein, 녹색 형광 단백질)가 표지된 인간 야생형 FUS 및 pCMV6-FUS^P525L-GFP가 표지된 돌연변이 FUS^P525L를 Lipofectamine 3000 시약 (Invitrogen)을 사용하여 제조사 매뉴얼에 따라 형질 감염시켰다. 이 때, 빈 pCMV6-AC-GFP 플라스미드를 음성 대조군으로 사용하였다.

1-6. Stable 세포주 생성

24-웰 플레이트의 N2a 세포를 Lipofectamine 3000 시약 (Invitrogen)을 사용하여 1 ㎍의 인간 GSTO1 cDNA로 형질 감염시켰으며, 형질 감염시킨 후, 2 일 동안 G418 (600 μg/㎖)의 존재 하에 안정 형질 전환체를 선별하였다. 이 때, 안정 형질 전환체에서 GSTO1 단백질의 과발현은 면역블롯 분석을 통해 확인하였다.

1-7. 전체 뇌 면역 염색 (brain immunostaining)

7 일된 성체 수컷 파리의 뇌를 고정 완충액 (100 mM PIPES, 1 mM EGTA, 1 % Triton X-100, 2 mM MgSO₄, pH 6.9)에서 4 % 포름알데하이드로 고정시킨 뒤, 10 ㎎/㎖ BSA를 함유한 세척 버퍼액 (50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.1 % Triton X-100 및 0.5 ㎎/㎖ BSA, pH 6.8)으로 차단시킨 다음 차단 완충액으로 희석한 1 차 항체와 함께 4 ℃에서 12 시간 동안 배양하였으며, 이 때, 사용한 항체는 다음과 같다:

토끼 항-FUS (1 : 100, Bethyl Laboratories), 마우스 항-FUS (1:50, Santa Cruz Biotechnology), 토끼 항-GstO2 (1:20), 및 마우스 항-GSH.

이 후, 샘플을 Alexa 488 접합 2 차 항체 (1 : 200, Invitrogen), Cy3 접합 2 차 항체 (1 : 200, Jackson Immuno Research Laboratories) 및 DAPI (1 : 500, Sigma-Aldrich)와 함께 배양한 후, 뇌를 세척 완충액으로 10 분씩 3 회 세척하고, SlowFade^TM Gold antifade reagent (Invitrogen)를 처리하여 고정하였다. 이 때, 모든 이미지는 Carl Zeiss 공초점 현미경 (LSM710)을 통해서 확보하였다.

1-8. 면역조직화학 (Immunohistochemistry)

세포를 인산 완충 식염수 (phosphate-buffered saline; PBS)에서 4% 파라포름알데하이드로 30 분 동안 고정시킨 후, 0.3 % Triton X-100 (PBST)을 함유한 PBS로 10 분씩 3 회 세척하였다. 이 후, 세포를 차단 완충액 (5 % NGS (normal goat serum)를 함유한 PBST)과 함께 25 ℃에서 1 시간 동안 배양한 다음, 4 ℃에서 12 시간 동안 차단 완충액으로 희석한 1 차 항체와 함께 배양하였으며, 이 때, 사용된 항체는 다음과 같다:

마우스 항-GSH (1:100; ViroGen Corp.), 토끼 항-FUS (1:100; Bethyl Laboratories), 마우스 항-GFP (1:200; Roche), 및 토끼 항-caspase-3 (1:500; Cell Signaling).

1 차 항체와 함께 배양한 후, 세포를 PBST로 10 분씩 3 회 세척한 다음, PBST에서 1:2000로 희석한 2 차 항체와 함께 25 ℃에서 1 시간 동안 배양을 실시하였으며, 이 때, 사용된 2 차 항체는 다음과 같다:

Alexa-594 접합 염소 항-토끼 IgG, Alexa-488 접합 염소 항-토끼 IgG, Alexa 594 접합 염소 항-마우스 IgM 및 Alexa-488 접합 염소 항-마우스 IgG (Jackson Immuno Research 실험실).

이 후, 샘플을 Leica 공초점 현미경을 이용하여 관찰하였다.

다음으로 초파리 (Drosophila)에서 NMJ (neuromuscular junction) 분석을 위해 3 번째 영 (齡, instar) 단계의 유충 (3rd instar larva)을 해부한 다음, 15 분 동안 PBS에서 4 % 포름알데하이드로 고정하였다. 이 후, 샘플을 0.1 % Triton X-100을 함유한 PBS로 10 분씩 3 회 세척하고, PBST에서 5 % BSA로 차단시킨 다음, 1 차 항체와 함께 4 ℃에서 12 시간 동안 배양하였다. 이 때, FITC-접합 항-HRP (Jackson Immuno Research Laboratories)를 1:150으로 사용하였으며, SlowFade^TM Gold antifade reagent (Invitrogen)를 처리하여 고정하고, 모든 이미지는 Leica TCS SP5 AOBS 공초점 현미경으로 획득하였다.

1-9. 상동성 모델링 (Homology modeling)

Molegro Molecular Viewer 2.5.0 (Molegro ApS, 오르후스 C, 덴마크)을 기반으로 I-TASSER server를 이용하여 단백질 구조 및 기능 예측을 위한 FUS ZnF 도메인 (32 아미노산 잔기, 422-RAGDWKCPNPTCENMNFSWRNECNQCKAPKPD-453)의 3D 구조를 예측하여 생성하였다.

1-10. In vitro 단백질 응집 분석 (In vitro protein aggregation assay)

In vitro 글루타치오닐화 후, 샘플을 37 ℃에서 열-블록을 시킨 후, 4 ℃에서 30 분 동안 20,000 × g 조건으로 원심 분리하여 상등액과 펠릿 분획으로 나누어 펠릿을 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)에서 10 분 씩 5 회 세척 한 후, 환원제와 함께 LDS 샘플 완충액 (2 % SDS)(Invitrogen)으로 용해시켰다. 양 분획에서 FUS는 토끼 항-FUS (1:1000; Bethyl Laboratories) 항체로 웨스턴블랏 분석에 의해 검출하였다.

1-11. External eye microscopy

성인 파리 눈 이미지의 경우 머리를 슬라이드 글라스에 고정 후, 디지털 카메라로 이미지를 촬영하였으며, 이 때, 5 일 된 수컷 파리를 실험에 사용하였다. 한편, 이미지 촬영은 Leica MZ10 F 입체 현미경과 Leica DFC450 카메라 시스템을 사용하여 촬영하였다.

1-12. 운동성 및 수명 분석 (Locomotive activity and lifespan assays)

유충 크롤링 (crawling) 분석을 위해서, 3 번째 영 (齡, instar) 단계의 유충 (3rd instar larva)에 남아있는 음식찌꺼기 등을 제거하기 위해 PBS를 이용하여 세척하고 곧바로 깨끗한 여과지로 건조시킨 후, 2 % 포도 주스-한천 페트리 접시에 위치시켰으며, 각 유전선의 유충은 90 초 동안 크롤할 수 있게 허용하였다. 이 때, 유충의 크롤링 동작을 정량화하기 위해 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 유충을 추적하고 거리를 측정하였으며, 적어도 10 마리의 유충에 대한 결과를 각각의 형질 전환 계통에 대해 평균화하였다.

다음으로, 클라이밍 (climbing) 분석을 위해서, 각 연령 그룹의 10 마리의 수컷 파리를 이산화탄소로 마취시킨 다음, 컬럼 바이알 (column vial)에 위치시킨 후, 상기 파리를 빈 바이알에 옮겨 실온에서 1 시간 동안 배양하여 환경에 순응시키고, 10 초 이내에 바이알의 꼭대기까지 등반한 파리의 수를 세었다. 이 때, 실험은 5 분 간격으로 각 트랜스제닉 라인에 대해 독립적으로 4 회 반복 하였으며, 모든 등반 실험은 25 ℃에서 수행하였다.

마지막으로 수명 분석을 위해서, 각 유전자형 (>150 파리)의 수컷 파리 20 마리를 각기 다른 바이알에 넣고, 25 ℃를 유지한 후, 다음 날 모든 그룹을 새로운 바이알로 옮긴 뒤 죽은 파리의 수를 기록하였다.

1-13. 면역블롯분석 (Immunoblot analysis)

웨스턴블롯 분석을 위한 단백질 추출물은 LDS 샘플 버퍼 (Invitroge)에서 10 마리의 14 일된 수컷 파리의 머리를 균질화하여 제조하였으며, 총 단백질 추출물을 4 ~ 12 % 구배 SDS-PAGE 겔을 사용하여 분리하고, PVDF 멤브레인 (Millipore)으로 ?ケ? 후, 멤브레인을 4 % 탈지 분유 또는 4 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유한 Tris-완충 식염수 (TBS)로 1 시간 동안 블로킹하고, 1 차 항체와 함께 4 ℃에서 12 시간 동안 배양하였다.

이 때, 사용한 1 차 항체는 다음과 같다:

토끼 항-FUS (1 : 1000, Bethyl Laboratories), 토끼 항-Drosophila Marf (1 : 1000, Leo Pallanck, 워싱턴 대학으로부터의 선물), 마우스 항-Opa1 (1 : 1000; 마우스 항-UQCRC2 (1 : 1000, Abcam), 마우스 항-ATP5A (1 : 10000, Abcam), 마우스 항-Drosophila GstO2 (1 : 1000), 토끼 항-라민 C (Developmental Studies Hybrodoma Bank, DSHB), 토끼 항-α-튜불린 (1 : 2000, Sigma), 및 토끼 항 β-액틴 (1 : 4000, Cell Signaling).

블롯을 0.1 % Tween-20을 함유하는 TBS (TBST)에서 세척하고, 2 차 항체와 함께 배양하였으며, 염소 항-토끼 IgG HRP 접합체 및 염소 항-마우스 IgG HRP 접합체 (1 : 2000, Millipore)를 사용하여 1 차 항체를 HRP-접합 2 차 항체로 검출하였다. 이 때, 검출은 ECL-Plus 키트 (Amersham)를 사용하여 수행하였다.

다음으로 단백질 추출물을 protease-phosphatase inhibitor cocktail (Roche)을 함유한 RIPA 완충액 (Cell signaling)에서 균질화시킨 뒤, 환원제와 함께 LDS 샘플 완충액 (Invitrogen)과 혼합하였다. 이 후, 단백질 샘플을 4 ~ 12 % Bis-Tris 겔 (Novex)로 분리하고, PVDF 멤브레인 (Novex)으로 옮긴 다음, 토끼 항-TurboGFP (1 : 2000, OriGene), 마우스 항-GSTO1 (1 : 1000, Proteintech), 토끼 항-DDK (1 : 1000, OriGene), 토끼 항-α-튜불린 (1 : 2000, Sigma) 1 차 항체를 사용하여 웨스턴블롯 분석에 사용하였다.

1-14. 미토콘드리아 이미지 및 형태

흉부의 근육 조직에서 미토콘드리아의 이미지를 확인하기 위해서, 7 일된 성충 수컷 파리를 PBS에서 해부하고 고정 완충액 (100 mM PIPES, 1 mM EGTA, 1 % Triton X-100 및 2 mM MgSO₄, pH 6.9)에서 3 % 포름알데하이드로 25 분 동안 고정시킨 후, 세척 완충액 (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1 % Triton X-100, 및 0.5 ㎎g/㎖ BSA, pH 6.8)으로 헹궜다. 이 후, SlowFade^TM Gold antifade 시약 (Invitrogen)으로 고정하고 CarlZeiss 공초점 현미경 (LSM710)으로 촬영하여 이미지를 획득하였다.

다음으로 다리의 운동 뉴런에서 미토콘드리아의 이미지를 확인하기 위해서, 7 일 된 성충 수컷 파리를 PBS에서 해부하고 앞 다리를 고정 완충액 (100 mM PIPES, 1 mM EGTA, 1 % Triton X-100 및 2 mM MgSO₄, pH 6.9)에서 4 % 포름알데하이드로 25 분 동안 고정시킨 후, PBST로 세척하고, SlowFade^TM Gold antifade 시약 (Invitrogen)으로 고정하여 CarlZeiss 공초점 현미경 (LSM710)으로 촬영하여 이미지를 획득하였다.

1-15. BN-PAGE (Blue native polyacrylamide gel electrophoresis)

미토콘드리아는 제조사의 포로토콜에 따라 mitochondrial isolation kit (Pierce)를 사용하여 14 일된 수컷 성충 파리로부터 분리한 후, 정제된 미토콘드리아 추출물을 2 % n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM), 1% Digitonin, 및 protease inhibitor (Halt)를 함유한 60 μL의 1 × Native PAGE 샘플 완충액 (Invitrogen)에서 재현탁시켰다. 다음으로 샘플을 아이스 상에서 15 분 동안 배양하고, 12,000 × g에서 원심 분리한 뒤, 상등액에서 미토콘드리아 단백질 농도를 측정하고, 상기 상등액 (20 ㎍)을 0.5 % G-250 샘플 첨가제와 혼합한 뒤, 4 ℃에서 3 ~ 12 % Native PAGE Bis-Tris gel (Invitrogen)을 사용하여 BN-PAGE (Blue native polyacrylamide gel electrophoresis)을 수행하였다. 이 때, 양극 런닝 완충액 (Anode running buffer)을 겔 외부에서 사용하고, 음극 러닝 완충액 (cathode running buffer)을 겔 내부에서 사용하였고, PAGE 후, 마우스 항 -NDUFS3 (1 : 5000, Abcam), 마우스 항-UQCRC2 (1 : 1000, Abcam), 마우스 항-ATP5A (1 : 10000, Abcam) 항체로 웨스턴블랏 분석을 수행하였다.

1-16. 미토콘드리아 슈퍼옥사이드 측정

파리에서의 미토콘드리아 ROS 생성은 제조사의 프로토콜에 따라 미토콘드리아 산소자유라디칼 (oxygen free radical) 표시기 mitoSOX-Red (Invitrogen)를 사용하여 측정하였다. 보다 구체적으로, 11 일된 파리 흉부로부터 차가운 PBS에서 절개한 근육 조직을 DMSO 중 5 μM MitoSOX-Red와 함께 25 ℃에서 20 분간 배양한 다음, 차가운 PBS로 3 회 세척한 후, 근육 조직 샘플을 빠르게 SlowFade^TM Gold antifade (Invitrogen) 시약으로 처리하여 고정시킨 뒤, Carl Zeiss 공초점 현미경 (LSM710)으로 15 이내에 관찰하였으며, 이 때, 형광 강도는 Image J 소프트웨어를 사용하여 정량하였다.

1-17. ATP 분석 (ATP assay)

28 일된 파리의 흉부를 ATPase 효소 활성을 저해하기 위해서, 100 ㎕의 추출 완충액 (6 M Guanidine-HCl, 100 mM Tris, 4 mM EDTA, pH 7.8)에서 균질화 시킨 뒤, 추출물을 액체 질소에서 즉시 동결시킨 후, 가열하여 ATP 생성효소 (ATP synthase)를 변성시켰다. 이 후, 샘플을 20,000 × g에서 15 분 동안 원심 분리하여 상등액을 새로운 튜브로 옮긴 다음, 추출 완충액 (1/100)으로 희석한 뒤, 96-웰 플레이트 각 웰에 샘플을 넣고, Enliten ATP 분석 키트 (Promega)의 발광 용액과 혼합시켰으며, Glomax microplate reader (Promega)를 사용하여 10 초 간격으로 발광을 측정하였다. 다음으로, 상등액을 추출 완충액 (1/2)으로 희석하여 BCA 단백질 분석 키트 (Pierce)를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 이후, 총 단백질 농도로 나누어 표준과 비교한 상대적인 ATP 수준을 계산하였다.

1-18. 단백질 산화 분석 (Protein oxidation assay)

단백질 산화 검출은 제조사의 프로토콜에 따라 OxyBlot protein oxidation detection kit (Millipore)를 사용하여 검출하였다. 구체적으로, 28 일된 파리의 흉부를 6 % SDS를 함유한 2 % β-머캅토에탄올을 함유한 용해 완충액에서 균질화시킨 후, 균질액을 20,000 × g에서 30 분간 원심 분리하여 펠렛 파편은 버린 다음, 변성된 단백질을 25 ℃에서 DNPH (2, 4-dinitrophenylhydrazine)으로 유도체화한 후, 중화 용액으로 이용하여 중화시켰다. 이 후, DNPH로 표지된 단백질을 SDS-PAGE에 적용하고, PVDF 멤브레인 (Millipore)으로 옮긴 뒤, 상기 멤브레인을 항-DNP 항체 (1:150, Millipore)로 분석한 뒤, 염소 항-토끼 IgG HRP 접합 2 차 항체 (1:300; Millipore)를 사용하여 신호를 검출하였으며, 이 때, 검출은 ECL-Plus 키트 (Amersham)를 사용하여 수행하였고, 밴드 밀도는 Image J 소프트웨어를 통해 측정하였다.

1-19. 핵/세포질 분획 분석 (Nuclear/cytoplasmic fractionation assay)

수컷 파리의 머리 20 개를 제조사의 프로토콜에 따라 nuclear extract kit (Active Motif) 시약으로 용해시킨 뒤, 상이한 세포 분획에서의 단백질 추출물은 SDS 로딩 완충액과 혼합시킨 후, 가열하여 웨스턴블랏 분석을 위해 SDS-PAGE에 적용시켰다.

1-20. 단백질 용해도 분석 (Protein solubility assay)

총 단백질은 이전에 기술된 몇 가지를 수정한 프로토콜 (Woo et al., 2017)을 사용하여 용해도에 따라 분획시켰으며, 7 또는 14 일된 파리의 20 개의 머리를 SDS (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40, and 10% glycerol, pH 7.5) 없이 용해 완충액에서 균질화 시켰다. 이 후, 균질 샘플을 100,000 × g, 4 ℃에서 30 분 동안 원심 분리하여 상등액을 가용성 분획으로 수득하였다. 또한, 남은 펠릿 (pellet)을 2 % SDS를 포함하는 50 ㎕ 2 × 완충액으로 추가로 추출하여 초음파 처리 후, 95 ℃에서 10 분간 가열하였다. 상기 과정에서의 상등액은 불용성 분획으로 수득하였다.

1-21. GSH/GSSG 함량

산화 형태(글루타치온 설파이드, GSSG) 및 환원 형태의 글루타치온(GSH) 측정을 위한 방법은 제조사의 포로토콜에 따라 글루타치온 분석 키트 (Cayman chemical)를 이용하여 측정하였으며, 보다 구체적으로 10 일된 파리 머리 10 개의 총 글루타치온을 50mM MES 완충액 50 ㎕에서 균질화시킨 후, 샘플을 10,000 × g에서 15 분간 원심 분리하고 상등액을 새로운 튜브로 옮겼다. 이 후, 샘플에 동일한 양의 MPA 시약을 첨가하고 실온에서 5 분간 방치하였으며, 상기 혼합물을 2,000 × g에서 2 분간 원심 분리시킨 다음, 2.5 ㎕의 TEAM 시약을 추가한 즉시 샘플을 볼텍싱하였다. 다음으로 샘플을 96 웰 플레이트 각 웰에 넣고, MES 완충액, 보조 인자 혼합물 (Cofactor mixture), 효소 혼합물 (Enzyme mixture), 및 DTNB의 혼합물을 첨가하였다. 이 후, Glomax microplate reader (Promega)를 사용하여 405 ㎚ 흡광도를 측정하였으며, 2.5 ㎕의 TEAM 시약을 첨가한 후, 전체 글루타치온 분석법과 동일한 방법을 사용하여 산화 형태 글루타치온(GSSG)을 측정하였다. 또한, 2-비닐피리딘 (2-vinylpyridine)을 추가로 첨가하여 25 ℃에서 1 시간 동안 배양을 진행한 후, 전체 글루타치온 분석법과 동일한 과정을 진행하여 상등액을 추출 완충액 (1/10)으로 희석하여 BCA 단백질 분석 키트 (Pierce)를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 표준의 레벨과 비교한 산화 형태 글루타치온(GSSG) 및 환원 형태의 글루타치온(GSH)의 레벨의 계산 값을 얻기 위해 전체 단백질의 농도로 나누었다.

실시예 2. FUS의 글루타치오닐화 확인

글루타치오닐화는 시스테인과 환원된 글루타치온 (GSH) 사이 디설파이드 결합의 결과로써, 이로 인해, 단백질 구조 및 기능의 변화를 가져올 수 있는 것으로 알려져 있다.

이에, FUS의 글루타치오닐화가 일어나는지 여부를 확인하기 위해서, in vitro 글루타치오닐화 분석을 수행한 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 야생 FUS 단백질은 다양한 농도의 산화형 글루타치온 (GSSG)의 존재 하에 글루타치오닐화 되는 것을 확인하였으며, 또한, FUS의 글루타치오닐화를 항-GSH 및 항-myc 항체로 웨스턴블랏 분석을 수행한 결과, 글루타치오닐화된 FUS는 혼합 디설파이드(disulfide) 결합을 절단하는 2-머캅토에탄올 (2-mercaptoethanol) 또는 디티오트레이톨 (dithiothreitol)과 같은 환원제를 처리하는 경우 FUS로 환원되는 것을 확인하였다. 즉, GSSG의 농도에 의존적으로 FUS 단백질의 글루타치오닐화가 일어나는 것을 확인할 수 있었다.

또한, in vivo에서 FUS의 글루타치오닐화를 확인하기 위해서, 뉴런에서 특이적으로 발현하는 인간 FUS를 elav-Gal4 driver를 사용하여 초파리의 뉴런에서 발현하였다.

그 결과, 도 1b의 흰색 화살표에 나타낸 바와 같이, FUS 단백질은 주로 뉴런의 핵에 국한되었으나, FUS가 과발현된 파리 두뇌의 뉴런에서 세포질의 FUS 응집체가 많이 관찰된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 흥미롭게도 세포질 및 잘못 배치된 (mislocalized) FUS는 in vitro 연구에서 나타난 결과와 마찬가지로 뇌 조직에서 GSH와 함께 공통 배치되는 것을 확인할 수 있었다.

다음으로 FUS 및 이의 돌연변이인 FUS^P525L의 글루타치오닐화가 포유류 시스템에서도 상기와 같은 결과를 나타내는지 확인해보고자 마우스 신경모세포종 (neuroblastoma) 세포주인 Neuron2a (N2a)에서 human FUS와 FUS^P525L을 발현시켜 본 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이, GSH-양성 신호가 FUS 또는 FUS^P525L 응집체에 국한되어 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, FUS와 FUS^P525L가 in vitro 및 in vivo 모두에서 글루타치오닐화되는 것을 확인할 수 있었다.

마지막으로 글루타치오닐화 부위를 동정하기 위해서, myc-태그 인간 FUS를 in vitro에서 글루타치오닐화를 유도하고, 쿠마시 염색된 겔 (coomassie stained gel)을 통해 밴드를 검출한 뒤, FUS 단백질 밴드를 겔로부터 적출하고, 트립신 처리시킨 뒤, MALDI-질량 분석법으로 분석을 진행하였다.

그 결과, 도 1d에 나타낸 바와 같이, 하나의 GSH moiety를 나타내는 305 Da의 질량 차이를 갖는 펩티드가 질량 분석에 의해 검출되었다. FUS의 RanBP2 zinc-finger (ZnF) 도메인은 4개의 시스테인을 가지고 있으며, 생체 내 산화 스트레스에 민감할 수 있다.

또한, 진핵 생물들 중 시스테인 보존에 대한 FUS 서열 배열을 조사하였고, 4 개의 시스테인 모두가 파리에서 인간까지 잘 보존되는 것을 확인할 수 있었으며, 이 중 RanBP2 형 ZnF 도메인, Cys-447 (도 1e, 화살표)에서 글루타치오닐화하는 부위를 확인하였다.

따라서, 인간 FUS가 Cys-447 잔기에서 특이적으로 글루타치오닐화 된다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3. FUS의 글루타치오닐화에 따른 응집체 형성 확인

번역 후 변형 (Post-translational modification)은 ALS (amyotrophic lateral sclerosis)를 포함한 여러 신경 퇴행성 질환에서 병인성 단백질 응집에 중요한 중재자로서 알려져 왔다. 본 발명자들은 도 1b에 나타난 바와 같이, 이미 세포질 또는 잘못 배치된 FUS 단백질은 초파리 두뇌에서 GSH와 함께 공통 배치되는 것을 확인할 수 있었다. 상기 실험적 배경은 FUS의 ZnF 도메인에서 Cys-477의 글루타치오닐화가 FUS 응집체 발생 가능성을 나타낸다. 따라서, 세포질 내 FUS 응집이 FUS 글루타치오닐화에 의해 조절될 수 있다고 예측하였다.

이에, Cys-477의 잔기에서의 FUS 글루타치오닐화가 FUS 단백질의 응집을 조절하는지 여부를 확인하기 위해서, FUS에 대한 용해도 시험을 수행하였다.

보다 구체적으로, HEK293 세포에서 정제된 myc-태그 인간 FUS 단백질을 GSSG와 함께 첨가하여 배양함으로써, 글루타치오닐화를 유도하고, 단백질 독성 스트레스을 주기 위해서 열 충격에 노출시켰다 (도 1f 참조).

FUS 용해도는 웨스턴블랏 분석으로 각 샘플의 상등액 및 펠렛 분획에서 FUS 단백질을 상이한 시점에서 정량화하여 평가하였다.

그 결과, 도 1g에 나타낸 바와 같이, GSSG 처리가 없는 FUS 단백질은 37 ℃에서 2 시간 동안 높은 가용성으로 남을 수 있었으나, GSSG를 처리하여 글루타치오닐화를 유도한 후 가용성 분획의 FUS 단백질은 2 시간 후부터 GSSG를 처리하지 않은 FUS 단백질과 비교하여 용해도가 90 %에서 20 %로 급격히 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

이는, FUS의 글루타치오닐화는 응집체의 형성을 유의하게 유도한다는 것을 보여주는 것이며, Cys-447 잔기의 FUS 글루타치오닐화가 단백질 응집을 유도하고 FUS 응집체 형성의 중요한 결정 인자로서, 시스테인 글루타치오닐화를 지지할 수 있는 가설을 증명할 수 있었다.

아울러, Cys-447 잔기의 상대적 위치에 대한 구조적 근거를 더욱 평가하기 위해서, I-TASSER 서버를 사용하여 인간 FUS ZnF 도메인의 3 차원 상동 모델을 생성하였으며, 상기 FUS ZnF 도메인 모델은 PDB (protein database bank)에서 구조 상동성 영역을 갖는 단백질을 탐색하는데 사용되었다.

그 결과, 도 1h에 나타낸 바와 같이, ZnF 도메인 내의 Cys-447 잔기가 산화적 변형을 위해 표면에 노출되어 있는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 글루타치오닐화에 대한 Cys-447의 높은 감수성을 입증할 수 있음을 제시하고, ZnF 도메인 내에서 구조 변화의 가능성을 보여주었다.

실시예 4. GstO2의 FUS에 의한 신경 세포 독성 억제 효과 확인

글루타치오닐화된 FUS로 인한 병리를 줄이기 위해서, 글루타치오닐화 과정을 조절할 수 있는 정확한 분자 메커니즘 및 단백질을 확인하고자 하였으며, GSTO (omega class glutathione transferase)를 잠재적인 후보자로 선정하였다.

인간 GSTO1은 이전 보고에 의하면, 탈 글루타치오닐화 효소로서 작용할 수 있다고 알려져 있으며, 또한 본 발명자들은 이전에 인간 GSTO1의 초파리 상동 염색체인 GstO2가 초파리 PD 모델 (Kim et al., 2012)에서 ATP 합성효소 β subunit의 글루타치오닐화를 조절함으로써, 신경 독성을 억제한다고 보고한 바 있다.

상기 배경지식을 바탕으로 본 발명자들은 FUS에 의해 유발된 ALS 발병 기전에서 글루타치오닐화의 새로운 역할과 조절 인자를 확인하기 위해 초파리를 유전 도구로서 이용하였다. 먼저, GstO2의 증가가 초파리에서 인간 FUS의 과발현으로 인한 표현형을 완화시킬 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다.

보다 구체적으로, 초파리에서 GstO2 및 FUS 사이의 기능적 관계를 평가하기 위해서, GstO2의 과발현 및 눈 특정 eye-specific Gal4, GMR-Gal4에 의해 유도된 FUS가 발현된 트랜스제닉 파리를 생성하였다.

한편, 초파리 유전 접근법을 사용한 최근 연구에 따르면, 성인 눈에서 FUS 발현은 거친 눈의 표현형을 나타내는 것으로 알려져 있는데, 이전 보고와 마찬가지로 FUS 발현이 거친 눈의 표현형을 나타냈으며, ommatidial 조직을 파열시키는 것을 확인하였다.

그러나, FUS와 GstO2의 동시 발현은 거친 눈의 표현형을 현저히 회복시키는 것을 확인할 수 있었으며, 단독 GstO2 발현 파리에서 파열된 눈의 변화 또한 발견되지 않았다 (도 2a). 상기 결과는 GstO2가 초파리에서 FUS와 유전적으로 상호작용하는 것을 나타낸다.

다음으로, pan-neuronal Gal4, elav-Gla4을 사용하여 FUS 발현에 의한 운동성 결함 기전을 확인하고자, 뉴런에서 FUS를 발현하는 유충의 운동성을 조사하는 larval crawling 실험을 수행하였다.

그 결과 도 2b에 나타낸 바와 같이, 뉴런에서 FUS를 발현하는 파리는 대조군과 비교하여 운동성이 크게 감소하는 것을 확인할 수 있었는데, GstO2와 동시 발현시킨 경우, 유충의 크롤링 활동을 향상시키는 것을 확인하였다. 반면에, GstO2-녹다운 FUS를 발현하는 유충의 경우에는 크롤링 활동을 잃는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 단독 GstO2의 과발현 또는 녹다운은 유충의 크롤링 활동에 아무런 영향을 끼치지는 않는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 본 발명의 발명자들은 유충의 운동성 결함이 NMJ (neuron muscular junction)에서 결함으로부터 야기되는지 여부를 확인하고자 NMJ에서 시냅스 버튼 (synaptic bouton)의 수를 조사하였다.

그 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이, elav-Gal4의 조절 하에 FUS를 발현시킨 파리의 NMJ에서 총 버튼수가 현저히 감소하는 것을 확인하였으나, 이 표현형은 GstO2의 동시발현에 의해 현저히 회복되었고, 다만, GstO2 자체만으로는 버튼 수의 감소를 억제하는 효과는 없었으나, GstO2-녹다운 FUS를 발현하는 파리는 NMJ에서 버튼 수가 감소하지 않는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 2d에 나타낸 바와 같이, 뉴런에서 FUS의 발현은 수명을 크게 단축시키나, GstO2의 동시발현에 의해 수명을 회복시키는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 도 2e에 나타낸 바와 같이, FUS를 발현하는 파리에서 GstO2-녹다운은 부분적으로 수명을 단축시킬 뿐만 아니라, GstO2 RNAi에 의해 영향을 받지 않았다.

한편, Negative geotaxis 분석은 ALS를 포함한 다양한 신경 퇴행성 질환 연구에서 신경 시스템의 기능 장애를 평가하는 분석으로서, 본 발명에 따른 초파리 모델 시스템에 적용한 결과, 도 2f에 나타낸 바와 같이, 이전 연구와 일치하게 FUS-발현 파리는 연령-매칭 대조군과 비교하여 현저히 감소된 등산 활성을 나타내는 것을 확인하였으나, 뉴런에서 GstO2의 동시 발현된 FUS-발현 파리의 경우에는 등반 결손을 현저히 억제시킬 수 있음을 확인하였다. 이 때, 단독 GstO2 과발현은 등반 능력에 영향을 미치지는 않는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 상기 데이터를 통해 GstO2 발현 조절을 통해서 FUS로 유도된 신경 독성을 현저히 억제 또는 강화시킬 수 있는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5. GstO2에 의한 FUS로 유도된 미토콘드리아 역학 및 OXPHOS 기능장애 억제 확인

비정상적인 미토콘드리아가 ALS의 동물 모델에서 일관되게 관찰되는 것으로 알려져 있다 (Dal Canto and Gurney, 1994; Magrane et al., 2014). 또한, 운동 뉴런에서 돌연변이 FUS의 과발현은 미토콘드리아의 분열을 일으키고 (Tradewell et al., 2012), NSC34 운동 뉴런 세포에 야생형 및 돌연변이 형태의 FUS의 발현은 미토콘드리아 ATP 생산을 감소시켰다 (Stoica et al., 2016). 비록 다양한 이전의 연구에서 미토콘드리아 기능장애가 ALS의 공통된 특징으로 남아 있기는 하지만, FUS 유도에 의한 단백질 병증에서 미토콘드리아 역학 및 OXPHOS (oxidative phosphorylation) 시스템의 기능장애가 ALS 발병 기전에 주요한 원인임은 아직 입증되지는 않은 실정이다. 이에, 본 발명자들은 이전 연구에서 미토콘드리아 분열이 FUS-발현 파리의 근육 또는 운동 뉴런에서 강화되는 것을 확인하였으며, 미토콘드리아 융합 단백질에 의한 Marf 불안정성에 의해 미토콘드리아 역학의 불균형을 야기하는 것을 확인하였다 (Altanbyek et al., 2016).

상기 연구 결과를 바탕으로 GstO2 발현이 FUS 발현 파리의 미토콘드리아 분열을 억제하는지 여부를 확인하고자 하였으며, 이를 위해 흉부 근육에서 FUS를 발현하는 파리의 GstO2의 영향을 특성화하였다.

상기 GstO2의 영향을 특성화하기 위해 FUS 발현 파리 라인을 근육 특이적 Gal4, Mhc-Gal4와 교차시킨 후, 미토콘드리아는 미토콘드리아-표적 GFP (mitoGFP)를 발현시킴으로써 시각화하였다.

그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, FUS-발현 파리의 경우, 미토콘드리아의 크기가 대조군과 비교하여 심하게 작고, 단편적인 미토콘드리아를 확인할 수 있었고, 단독 GstO2의 과발현군은 미토콘드리아 형태의 검출 가능한 변화를 발견할 수는 없었다. 그러나, FUS-발현 파리에서 GstO2를 동시 발현시킨 경우, 미토콘드리아의 크기가 극적으로 회복되는 것을 확인할 수 있었다.

다음으로, GstO2가 운동 뉴런에서 미토콘드리아의 형태를 회복시키는지 여부를 확인하기 위해서, mitoGFP와 함께 운동 신경 특이적 Gal4, D42-Gal4를 사용하여 GstO2를 과발현시켰다.

그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, FUS-발현 파리의 근육에서 분열된 미토콘드리아에 대한 GstO2의 회복 효과와 일치하게 성충 파리 다리의 운동 뉴런에서 FUS의 발현은 미토콘드리아 분열을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 이러한 표현형 역시 GstO2의 동시 발현에 의해 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 미토콘드리아 분열이 미토콘드리아 역학을 조절하는 단백질의 기능 장애로 인한 것인지를 조사하였다. 본 발명자들은 이전 연구에서 FUS-발현 파리에서 감소된 Marf 발현이 미토콘드리아의 과도한 분열을 유도하는 것을 확인하였는 바 (Altanbyek et al., 2016), Marf 발현이 GstO2에 의해 변화하는지 여부를 평가하였다.

그 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이, GstO2와 동시 발현한 FUS 파리의 Marf 발현이 풍부하게 증가하는 것을 확인할 수 있었으나, Opa1 수준은 그대로 남아있는 것을 확인할 수 있었다.

다음으로, FUS 과발현에서 미토콘드리아의 형태학적 변화가 OXPHOS 시스템에 영향을 미치는지 확인하고자 FUS-유도 ALS에서 불균형한 미토콘드리아 역학의 기능적 관련성을 평가하였다. 보다 구체적으로, FUS-발현 파리의 여러 복합 서브유닛의 수준을 분석하여 간접적으로 측정된 ETC (electron transport chain)에서 미토콘드리아 복합체의 함량을 측정하였다.

그 결과 도 3d에 나타낸 바와 같이, FUS-발현 파리는 복합체 Ⅰ 서브유닛인 NDUFS3 및 복합체 Ⅲ 서브유닛인 UQCRC2를 현저히 감소시켰으나, 복합체 Ⅴ인 ATP5A의 α-서브유닛은 거의 변화하지 않은 것을 확인할 수 있었다. 한편, 초파리의 복합체 Ⅱ 및 Ⅳ 서브유닛 중 어느 하나와 교차 반응하는 항체를 찾을 수 없었기 때문에 이들의 함량을 측정할 수는 없었다. 이 때, FUS를 이용한 GstO2의 과발현은 NUDFS3 및 UQCRC2의 농도를 대조군과 유사한 수준으로 회복시키는 것을 확인할 수 있었다.

복합체 어셈블리를 더 연구하기 위해서, 성충 파리의 흉부 조직으로 부터 정제된 미토콘드리아에 대한 BN-PAGE (blue native gel electrophoresis)를 수행하였다.

그 결과, 도 3e에 나타낸 바와 같이, FUS 발현 파리에서 복합체 I 및 III 서브유닛의 발현 감소 효과와 일치하게 조립 복합체 I 및 III의 수준은 FUS 발현 파리에서 BN-PAGE에서 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, FUS 유도 복합체 I 및 III의 해체는 또한 GstO2의 과발현에 의해 완화될 수 있으나, 복합체 V 어셈블리의 상태는 모든 돌연변이 라인에서도 변하지 않는 것을 확인하였다.

다음으로, GstO2가 미토콘드리아 기능성을 회복시킬 수 있는지 여부를 확인하기 위해서, mitoSOX를 사용하여 FUS 발현 파리에서 활성 산소 종 (ROS)의 미토콘드리아 생산을 측정했다.

그 결과, 도 3f에 나타낸 바와 같이, ROS 생산이 FUS-발현 파리에서 증가하는 것을 확인하였고, GstO2 발현에 의해 회복되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 미토콘드리아는 ATP의 형태로 세포 에너지를 생산하는데, FUS-발현 파리에서 ATP 수준이 대조군에 비해 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다 (도 3g).

GstO2가 세포질 내부 산화스트레스 증가를 감소시킬 수 있는지 여부를 세포질 내 산화된 단백질의 양을 측정하여 확인하였다.

그 결과, 도 3h에 나타낸 바와 같이, 산화된 단백질이 FUS-발현 파리에서 증가하는 것을 관찰하였고, GstO2 발현에 의해 회복되는 것을 확인 할 수 있었다.

따라서, FUS에 의해 유도된 세포질 내부 산화스트레스와 미토콘드리아 역학 불균형 및 기능 장애를 GstO2에 의해 현저히 예방할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6. GstO2에 의한 초파리 신경 세포에서 FUS의 응집체 형성 억제 효과 확인

GstO2 과발현이 초파리에서 FUS 발현에 의해 야기된 모든 결함 표현형의 억제를 확인하는 상기 결과들은 GstO2가 신경 세포에서 병인 인자인 FUS의 감소를 촉진시킬 수 있음을 시시한다.

이에, GstO2에 의한 초파리 신경 세포에서의 FUS의 응집체 형성 억제 효과를 확인하기 위해서, FUS-발현 성충 파리의 뇌 추출물의 면역블롯팅을 진행한 결과, GstO2의 동시 발현은 FUS 수준에 영향을 미치지 않는 것을 확인할 수 있었으나 (도 4a 참조), 도 4b에 나타낸 바와 같이, FUS-발현 파리에서 GstO2의 녹다운은 FUS 단백질을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

다음으로 GstO2의 발현이 뇌 조직에서 FUS의 mislocalization을 억제하는지 여부를 확인하기 위해서, 세포질 및 핵에서 FUS 수준을 측정하기 위한 핵/세포질 분획 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이, GstO2-FUS의 동시 발현에서 FUS 단백질 수준이 세포질 분획에서는 감소되었으나, 핵 분획에서는 감소하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, GstO2가 세포질에서 FUS 단백질 수준을 감소시킴으로써, FUS 독성 억제자로서 작용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

트랜스제닉 파리에서 FUS 응집에 대한 GstO2의 영향을 더 알아보기 위해서, 다양한 유전자형의 파리 머리를 수집하고, 변형된 용해 완충액에서 용해시킨 후, 세제 가용성 및 불용성 분획으로 분리하였다.

그 결과, 도 4d에 나타낸 바와 같이, GstO2 및 FUS를 동시 발현 파리는 가용성 분획에서 FUS 양을 유의적으로 증가시켰으며, 불용성 분획에서는 FUS 양을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 반면에 GstO2의 신경 세포 특이적 녹다운은 가용성 분획에서 불용성 분획으로 FUS 전환을 유도하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, FUS-발현 파리와 비교하여 GstO2 동시 발현 파리에서 불용성/가용성 FUS의 비율이 > 40 %로 감소한 반면, GstO2 녹다운 FUS-발현 파리에서는 불용성/가용성 FUS의 비율이 크게 증가하는 것을 가용성 및 불용성 FUS의 정량화를 통해 알 수 있었다.

반면, 도 4e에 나타낸 바와 같이, GSTO1 또는 GstO3 중 어느 하나의 녹다운은 면역블롯팅 (immunoblotting)에 의해 FUS 응집을 향상시키기에는 충분하지 않았다

따라서, GstO 패밀리 중 GstO2가 세포질에서 FUS 응집체 형성을 조절함으로써, FUS로 유도된 ALS에서 보호 기능을 갖는 것을 나타낸다.

세포질에서 증가된 FUS 발현은 FUS와 미토콘드리아의 결합을 촉진하고, 미토콘드리아 기능 장애를 유도하는 것으로 알려져 있는데 (Deng et al., 2015), GstO2가 미토콘드리아의 FUS 수준을 조절하는지를 확인하기 위해서, 파리 근육 조직에서 FUS와 GstO2를 동시 발현시킨 후, 정제된 미토콘드리아로부터 FUS 수준을 웨스턴 블랏팅으로 조사하였다.

그 결과, 도 4f에 나타낸 바와 같이, 미토콘드리아 FUS 수준이 GstO2 동시 발현 파리에서 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7. GstO2에 의한 초파리 신경 세포에서 FUS의 글루타치오닐화 조절 확인

GstO2에 의한 FUS-발현 파리의 표현형의 회복은 FUS의 글루타치오닐화와 관련될 수 있으며, 이에, 본 발명자들은 GstO2가 초파리 뇌에서 FUS 글루타치오닐화 및 응집을 조절할 수 있을 것이라는 가설을 세웠으며, 이를 확인하고자 다음과 같은 실험을 수행하였다.

먼저, FUS-발현 성충 파리 뇌조직에 대한 이중 면역형광분석 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, FUS 응집체가 세포질에서 GSH와 함께 동시 국소화되는 것을 확인할 수 있었으나, GstO2 동시 발현은 FUS 응집체 형성의 증가를 억제하고, FUS의 글루타치온성을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 다음으로, RNAi를 이용하여 GstO2이 하향 조절된 세포질 FUS의 글루타치오닐화 유도 응집을 분석하였다. 그 결과, GstO2 녹다운은 세포질 FUS 응집체 및 글루타치온성을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

상기로부터 FUS의 GstO2에 의한 deglutathionylation이 신경 세포의 세포질에서 FUS 응집체 형성을 억제하고, FUS에 의한 신경 독성을 지연시키는데 유용하게 쓰일 수 있을 것으로 예측된다.

다음으로, 내인성 (endogenous) GstO2가 신경 세포에서 FUS와 상호작용하는지 여부를 확인을 조사하였다. 그 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 내인성 GstO2 국소화는 초파리 신경 세포 세포질에 분산되어 있었으며, 내인성 GstO2는 FUS-발현 파리에서 세포질 FUS 응집체와 동시 위치하고 있는 것을 확인하였는바, GstO2와 FUS가 상호작용하고 있음을 뒷받침하며, GstO2가 FUS 유도성 ALS에서 역할 할 수 있음을 유추할 수 있었다.

실시예 8. GstO2에 의한 초파리에서 FUS ^P525L 유도 신경 독성 및 불용성 억제 확인

이전 연구에 따르면, ALS 환자 대부분으로부터 FUS 돌연변이가 확인되고 있으며 (Mackenzie et al., 2010), FUS^P525L 변종은 세포질 mislocalization을 보여주며, 급성 FUS 유발-ALS와 관련이 있고 (Sun et al., 2011), FUS 야생형 및 이의 변종인 FUS^P525L는 초파리에서 거친 눈, 운동성 감소 등의 동일한 표현형을 나타내는 것으로 알려져 있다 (Chen et al., 2016; Jackel et al., 2015).

본 발명의 일실시예의 도 1c에서의 FUS^P525L이 neuro2a의 세포질에서 글루타치오닐화를 확인한 결과를 기초로 하여 GstO2가 초파리 뇌에서 FUS^P525L 발현에 의한 표현형에 기여할 수 있을 것으로 예측하고, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, GstO2 발현이 FUS^P525L 유발 운동 결손을 억제할 수 있는지 여부를 확인하기 위해서, elav-Gal4를 사용하여 신경 세포에 FUS의 돌연변이 형태인 FUS^P525L를 발현시켰으며, 유충 운동성 확인 실험을 수행하였다. 이 때, FUS^P525L 돌연변이는 야생형 FUS보다 더 독성을 나타내지는 않았다.

그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, FUS 발현 파리와 유사하게 유충의 크롤링 활성이 약 40 % 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, GstO2의 동시 발현에 의해서, 크롤링을 반대로 활성시키는 것을 확인하였고, 도 6b에 나타낸 바와 같이, GstO2 발현은 성충 파리 뇌의 전체 추출물에서 FUS^P525L 수준에 영향을 미치지는 않았다.

다음으로, FUS^P525L 용해도에 대한 GstO2의 영향을 확인하고자 하였다. 그 결과, 도 6c에 나타낸 바와 같이, FUS^P525L-단독 발현 파리와 비교하여 GstO2 동시 발현 파리에서의 불용성/가용성 FUS^P525L 비율이 50 % 이상 감소하는 것을 가용성 및 불용성 FUS^P525L의 정량화를 통해 입증하였다.

종합적으로, GstO2가 단백질 응집체 형성을 통한 FUS^P525L의 독성을 조절하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 9. 포유류에서의 FUS 유도 신경 독성 조절 확인

FUS 유도 신경 세포 독성에 대한 GstO2의 회복 효과가 포유류 시스템에도 적용되는지를 확인하기 위해서, GstO2의 인간 상동염색체인 GSTO1에 대한 Myc-DDK-GSTO1 융합 단백질을 발현하는 안정 N2a 세포주를 개발하였으며 (도 7a 참조), 이를 이용하여 GFP-태그 FUS를 상기 GSTO1 안정 세포주에 형질 감염시킨 후, FUS에 대한 GSTO1의 영향을 조사하였다.

그 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이, FUS-발현 파리와 비교하여 GSTO1 동시 발현 파리에서 불용성/가용성 FUS 비율이 50 % 이상 감소하는 것을 가용성 및 불용성 FUS 정량화를 통해 확인하였다.

다음으로, FUS의 증가된 발현이 포유류 신경 세포에서의 세포 사멸을 촉진한다는 이전 연구 결과 (Deng et al., 2015)를 기초로 FUS-유도 세포 사멸사에 대한 GSTO1의 영향을 조사하기 위해서, N2a 세포를 항-cleaved caspase-3 항체와 함께 염색을 통해 확인하였다.

그 결과, 도 7c에 나타낸 바와 같이, cleaved caspase-3 신호가 대조군 세포와 비교하여 FUS-GFP를 발현하는 N2a 세포에서 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었으나, FUS가 GSTO1과 동시 발현될 때, cleaved caspase-3 신호가 감소하여 신경 세포 사멸 표현형이 회복되는 것을 확인하였다.

따라서, GstO2의 인간 상동염색체인 GSTO1의 발현 또한 ALS의 포유류 신경 세포 모델에서 FUS 불용성 및 FUS 유도 세포사를 개선시키는 것을 확인할 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Soonchunhyang University Industry Academy Cooperation Foundation <120> Composition for treating neurodegenerative diseases including GstO2 <130> PD18-120 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 726 <212> DNA <213> GSTO1 polynucleotide <400> 1 atgtccgggg agtcagccag gagcttgggg aagggaagcg cgcccccggg gccggtcccg 60 gagggctcga tccgcatcta cagcatgagg ttctgcccgt ttgctgagag gacgcgtcta 120 gtcctgaagg ccaagggaat caggcatgaa gtcatcaata tcaacctgaa aaataagcct 180 gagtggttct ttaagaaaaa tccctttggt ctggtgccag ttctggaaaa cagtcagggt 240 cagctgatct acgagtctgc catcacctgt gagtacctgg atgaagcata cccagggaag 300 aagctgttgc cggatgaccc ctatgagaaa gcttgccaga agatgatctt agagttgttt 360 tctaaggtgc catccttggt aggaagcttt attagaagcc aaaataaaga agactatgct 420 ggcctaaaag aagaatttcg taaagaattt accaagctag aggaggttct gactaataag 480 aagacgacct tctttggtgg caattctatc tctatgattg attacctcat ctggccctgg 540 tttgaacggc tggaagcaat gaagttaaat gagtgtgtag accacactcc aaaactgaaa 600 ctgtggatgg cagccatgaa ggaagatccc acagtctcag ccctgcttac tagtgagaaa 660 gactggcaag gtttcctaga gctctactta cagaacagcc ctgaggcctg tgactatggg 720 ctctga 726 <210> 2 <211> 241 <212> PRT <213> GSTO1 protein <400> 2 Met Ser Gly Glu Ser Ala Arg Ser Leu Gly Lys Gly Ser Ala Pro Pro 1 5 10 15 Gly Pro Val Pro Glu Gly Ser Ile Arg Ile Tyr Ser Met Arg Phe Cys 20 25 30 Pro Phe Ala Glu Arg Thr Arg Leu Val Leu Lys Ala Lys Gly Ile Arg 35 40 45 His Glu Val Ile Asn Ile Asn Leu Lys Asn Lys Pro Glu Trp Phe Phe 50 55 60 Lys Lys Asn Pro Phe Gly Leu Val Pro Val Leu Glu Asn Ser Gln Gly 65 70 75 80 Gln Leu Ile Tyr Glu Ser Ala Ile Thr Cys Glu Tyr Leu Asp Glu Ala 85 90 95 Tyr Pro Gly Lys Lys Leu Leu Pro Asp Asp Pro Tyr Glu Lys Ala Cys 100 105 110 Gln Lys Met Ile Leu Glu Leu Phe Ser Lys Val Pro Ser Leu Val Gly 115 120 125 Ser Phe Ile Arg Ser Gln Asn Lys Glu Asp Tyr Ala Gly Leu Lys Glu 130 135 140 Glu Phe Arg Lys Glu Phe Thr Lys Leu Glu Glu Val Leu Thr Asn Lys 145 150 155 160 Lys Thr Thr Phe Phe Gly Gly Asn Ser Ile Ser Met Ile Asp Tyr Leu 165 170 175 Ile Trp Pro Trp Phe Glu Arg Leu Glu Ala Met Lys Leu Asn Glu Cys 180 185 190 Val Asp His Thr Pro Lys Leu Lys Leu Trp Met Ala Ala Met Lys Glu 195 200 205 Asp Pro Thr Val Ser Ala Leu Leu Thr Ser Glu Lys Asp Trp Gln Gly 210 215 220 Phe Leu Glu Leu Tyr Leu Gln Asn Ser Pro Glu Ala Cys Asp Tyr Gly 225 230 235 240 Leu <210> 3 <211> 756 <212> DNA <213> GstO2 polynucleotide <400> 3 atggccctgc cgcaaaagca cttcaagagg ggttccacca agcccgagct gccagaagat 60 ggagttcctc gtttcttttc catggcattc tgccccttca gccaccgagt tcgtctgatg 120 ctggccgcca aacatattga acatcataag atctacgtcg atttgattga gaagcctgaa 180 tggtacaagg atttcagtcc tctgggcaaa gtgccagccc tgcagcttac tggggtgaag 240 gaccaaccga ccctcgtgga gtcgctcatc atagcagagt acttggacca gcaatatccc 300 cagacgcgac tctttcccac ggatccgctt cagaaggcgc tggacaagat tctaatcgaa 360 cgttttgctc cagtggtcag tgccatttat cctgtgctga cttgtaatcc caacgctccg 420 aaagatgcca taccgaactt cgagaatgcc ttggatgttt ttgaagtgga gttgggcaaa 480 agaggaacgc cctactttgc cggccagcac attggaatcg tggactacat gatttggcct 540 tggttcgaac gttttcccag catgaagatc aatacggagc aaaagtatga gctggataca 600 aaacgatttg agaagctgct caagtggcgc gatttgatga cccaggatga ggttgtgcag 660 aagacagctt tggatgtcca gttgcatgct gagttccaga aatcgaagac ccttggaaat 720 ccccagtacg acattgcctt caagggtaca ccatag 756 <210> 4 <211> 251 <212> PRT <213> GstO2 protein <400> 4 Met Ala Leu Pro Gln Lys His Phe Lys Arg Gly Ser Thr Lys Pro Glu 1 5 10 15 Leu Pro Glu Asp Gly Val Pro Arg Phe Phe Ser Met Ala Phe Cys Pro 20 25 30 Phe Ser His Arg Val Arg Leu Met Leu Ala Ala Lys His Ile Glu His 35 40 45 His Lys Ile Tyr Val Asp Leu Ile Glu Lys Pro Glu Trp Tyr Lys Asp 50 55 60 Phe Ser Pro Leu Gly Lys Val Pro Ala Leu Gln Leu Thr Gly Val Lys 65 70 75 80 Asp Gln Pro Thr Leu Val Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Tyr Leu Asp 85 90 95 Gln Gln Tyr Pro Gln Thr Arg Leu Phe Pro Thr Asp Pro Leu Gln Lys 100 105 110 Ala Leu Asp Lys Ile Leu Ile Glu Arg Phe Ala Pro Val Val Ser Ala 115 120 125 Ile Tyr Pro Val Leu Thr Cys Asn Pro Asn Ala Pro Lys Asp Ala Ile 130 135 140 Pro Asn Phe Glu Asn Ala Leu Asp Val Phe Glu Val Glu Leu Gly Lys 145 150 155 160 Arg Gly Thr Pro Tyr Phe Ala Gly Gln His Ile Gly Ile Val Asp Tyr 165 170 175 Met Ile Trp Pro Trp Phe Glu Arg Phe Pro Ser Met Lys Ile Asn Thr 180 185 190 Glu Gln Lys Tyr Glu Leu Asp Thr Lys Arg Phe Glu Lys Leu Leu Lys 195 200 205 Trp Arg Asp Leu Met Thr Gln Asp Glu Val Val Gln Lys Thr Ala Leu 210 215 220 Asp Val Gln Leu His Ala Glu Phe Gln Lys Ser Lys Thr Leu Gly Asn 225 230 235 240 Pro Gln Tyr Asp Ile Ala Phe Lys Gly Thr Pro 245 250

Claims (8)

1. GSTO1 (omega class glutathione transferase 1) 또는 GstO2 (omega class glutathione transferase 2) 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 유효성분으로 포함하는, FUS 단백질의 글루타치오닐화 억제용 시험관 내 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 GSTO1 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, FUS 단백질의 글루타치오닐화 억제용 시험관 내 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 GSTO1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, FUS 단백질의 글루타치오닐화 억제용 시험관 내 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 GstO2 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, FUS 단백질의 글루타치오닐화 억제용 시험관 내 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 GstO2 단백질은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, FUS 단백질의 글루타치오닐화 억제용 시험관 내 조성물.
6. 삭제
7. 삭제
8. 제1항에 있어서, 상기 FUS 단백질의 글루타치오닐화는 상기 FUS의 Cys-447 잔기에서 글루타치오닐화된 것을 특징으로 하는, FUS 단백질의 글루타치오닐화 억제용 시험관 내 조성물.

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