CN114057838A - 乙酰基六肽-8的固相合成方法 - Google Patents

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CN114057838A CN202210025756.6A CN202210025756A CN114057838A CN 114057838 A CN114057838 A CN 114057838A CN 202210025756 A CN202210025756 A CN 202210025756A CN 114057838 A CN114057838 A CN 114057838A
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Abstract

本发明公开了一种乙酰基六肽‑8的固相合成方法；属于化妆品技术领域；其步骤包括：溶胀树脂、脱保护；固相接肽反应；Ac反应和肽的收缩；肽链切割；其中步骤（2）中缩合剂包括改性N‑羟基邻苯二甲酰亚胺；改性N‑羟基邻苯二甲酰亚胺为对二甲基醌改性N‑羟基邻苯二甲酰亚胺；利用本发明的固相合成方法制得的乙酰基六肽‑8具有较高的收率与纯度。

Description

乙酰基六肽-8的固相合成方法
技术领域
本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种乙酰基六肽-8的固相合成方法。
背景技术
乙酰基六肽-8别名乙酰基六肽-3，六胜肽，商业名为阿基瑞林，它是优质的祛皱原料，其抗皱活性高，副作用小，现已成为风靡世界的祛皱原料，在各高端化妆品系列中都有应用；能局部阻断神经传递肌肉收缩讯息，影响皮囊神经传导，使脸部肌肉放松，能够平扶动态纹、静态纹及细纹；有效重新组织胶原弹力，可以增加弹力蛋白的活性，使脸部线条放松，皱纹抚平改善松弛，作为抗皱成分，且效果极佳。
现有技术如公开号CN102603869A公开了一种六胜肽的合成方法；采用不同的制备方法合成了两个三肽片段：固相合成方法制备了NH2-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pdf)-NH-resin肽树脂，液相合成方法制备了Fmoc-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Met-COOH，再将两者进行偶联、脱保护、酰基化、裂解，即得六胜肽。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对氨基酸具有较高缩合效率，同时能够得到较高收率与纯度的乙酰基六肽-8的固相合成方法。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种乙酰基六肽-8的固相合成方法，包括以下步骤：
（1）溶胀树脂、脱保护：将氨基树脂置于反应柱中溶胀，洗涤，干燥，脱保护，得到预处理后的树脂；
（2）固相接肽反应：将Fmoc-Arg(pdf)-OH与缩合剂溶解于溶剂中，加入预处理后的树脂，搅拌反应，抽滤，洗涤，脱保护，得到接上第一个氨基酸的树脂；然后依次偶联精氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、谷氨酸、谷氨酸，得到肽树脂A；
（3）Ac反应和肽的收缩：将肽树脂A置于反应柱中，然后加入二氯甲烷、乙酸酐、吡啶和缩合剂进行反应，洗涤，干燥，得到肽树脂B；
（4）肽链切割：将肽树脂B置于裂解液中进行裂解，过滤，离心，静置，减压干燥，纯化，浓缩，冻干，得到乙酰基六肽-8；
步骤（2）中缩合剂包括改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺；其结构式如下：
Figure 119686DEST_PATH_IMAGE001
。
本发明采用对二甲基醌改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺制得缩合剂，其缩短了缩合反应的时间，提高了其对氨基酸的缩合效率，且不易发生消旋化反应；将改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺作为乙酰基六肽-8固相合成的缩合剂，其提高了乙酰基六肽-8的收率与纯度。
优选地，在本发明的一些实施例中，改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺为对二甲基醌改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺。
优选地，在本发明的一些实施例中，步骤（1）中，氨基树脂的取代度为0.45~0.65mmol/g，溶胀20~40 min。
优选地，在本发明的一些实施例中，步骤（1）中，氨基树脂为Rink Amide Resin树脂。
进一步优选地，在本发明的一些实施例中，步骤（1）中，溶胀树脂、脱保护为：按重量份计，将1.5~2.2份氨基树脂置于反应柱中，用8~12份DMF洗涤1~2次，抽干，然后加入8~15份DMF溶胀，并用氮气吹拂搅拌20~40 min，抽干液体，再用10~15份DMF洗涤1~2次，抽干；加入5~8份10~20% 哌啶/DMF（v/v）溶液，脱保护5~10 min，抽干，用10~15份DMF洗涤1~2次，抽干，再加入5~8份10~20% 哌啶/DMF（v/v）溶液，脱保护5~10 min，分别加入5~10份DMF、5~10份DCM洗涤树脂3~5次。
优选地，在本发明的一些实施例中，步骤（2）中，缩合剂还包括HOBt、DCC、DIC、EDC中的至少一种。
进一步优选地，在本发明的一些实施例中，步骤（2）中，缩合剂为改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺与DIC；其中改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺与DIC的重量比为1：1~2。
另一方面，本发明将改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺与DIC作为复合缩合剂联合使用，进一步提高了氨基酸的缩合效率，进而得到收率与纯度较高的乙酰基六肽-8。
优选地，在本发明的一些实施例中，步骤（2）中，按重量份计，Fmoc-Arg(pdf)-OH为2.5~3.5份、缩合剂为0.5~0.8份、溶剂为5~10份。
进一步优选地，在本发明的一些实施例中，步骤（2）中，固相接肽反应：将2.5~3.5份Fmoc-Arg(pdf)-OH与0.5~0.8份缩合剂溶解于5~10份溶剂中，加入1.25~1.75份预处理后的树脂，氮气吹拂搅拌反应1~2 h，抽滤除去反应液，用DMF洗涤1~2次，抽干，然后加入5~8份10~20% 哌啶/DMF（v/v）溶液，脱保护5~10 min，分别加入5~10份DMF、5~10份DCM洗涤树脂3~5次，得到接上第一个氨基酸的树脂；然后按上述方法依次偶联2.5~3.5份精氨酸、1.85~2.5份谷氨酰胺、2.2~3.0份甲硫氨酸、1.75~2.25份谷氨酸、1.8~3.1份谷氨酸，得到肽树脂A。
优选地，在本发明的一些实施例中，步骤（2）中，缩合剂的制备方法为：将4-氨基邻苯二甲酸溶于无水乙醇中，然后缓慢滴加浓硫酸进行加热回流反应，旋蒸，抽滤，洗涤，干燥，用乙酸乙酯溶解，过滤，重结晶，得到4-氨基邻苯二甲酸二乙酯；将4-氨基邻苯二甲酸二乙酯置于盐酸、水、催化剂中溶解，在冰浴条件下，滴加亚硝酸钠溶液进行重氮化反应得到4-氨基邻苯二甲酸重氮盐；然后加入二甲基醌、碳酸氢钠在冰浴条件下进行反应得到反应物a；将反应物a与氯化亚砜置于容器中，在磁力搅拌作用下进行加热回流反应3~5 h，反应结束后，得到反应物b，将反应物b溶于二氯甲烷中，加入盐酸羟胺，在室温下搅拌反应8~12h，抽滤，水洗，干燥，得到缩合剂。
优选地，在本发明的一些实施例中，步骤（3）为：按重量份计，肽树脂A为0.5~1.5份、二氯甲烷为15~30份、乙酸酐为0.25~0.45份、吡啶为0.1~0.2份和缩合剂为0.15~0.25份。
优选地，在本发明的一些实施例中，步骤（3）中，缩合剂为TBTU、HOBt、PyBOP、HOAt、DIPCDI中的至少一种。
进一步优选地，在本发明的一些实施例中，步骤（3）中，Ac反应和肽的收缩：将0.5~1.5份肽树脂A置于反应柱中，然后加入15~30份二氯甲烷、0.25~0.45份乙酸酐、0.1~0.2份吡啶和0.15~0.25份缩合剂进行反应20~30min，用DMF洗涤3~5次，甲醇洗涤3~5次，干燥，得到肽树脂B。
优选地，在本发明的一些实施例中，步骤（4）中，裂解液为三氟乙酸、甲基苯基硫醚与间甲酚的体积比为95：3.5~4.5：0.5~1.5。
进一步优选地，在本发明的一些实施例中，步骤（4）中，肽链切割：将1~3份肽树脂B置于10~30份裂解液中裂解1.5~3 h，其中裂解液为三氟乙酸、甲基苯基硫醚与间甲酚的体积比为95：3.5~4.5：0.5~1.5，过滤，将滤液缓慢加入装有50~80份乙醚的容器中，以2500~4000 r/min离心5~10 min，重复操作2~4次，在空气中静置15~25 min，减压干燥，纯化，浓缩，冻干，得到乙酰基六肽-8。
进一步优选地，在本发明的一些实施例中，步骤（4）中，纯化条件为：采用C18柱；检测波长为210~215 nm；流动相：A相：0.1%三氟乙酸水溶液；B相：乙腈；A相与B相的体积比为50~80：20~50；流速：0.5~1.5 ml/min；进样量：5~15 μL。
本发明有益效果如下：
（1）采用对二甲基醌改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺制得缩合剂，其缩短了缩合反应的时间，提高了其对氨基酸的缩合效率，且不易发生消旋化反应；将改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺作为乙酰基六肽-8固相合成份缩合剂，其提高了乙酰基六肽-8的收率与纯度。
（2）将改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺与DIC作为复合缩合剂联合使用，其中改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺与DIC的重量比为1：1~2，其进一步提高了氨基酸的缩合效率，进而得到收率与纯度较高的乙酰基六肽-8。
因此，本发明是一种对氨基酸具有较高缩合效率，同时能够得到较高收率与纯度的乙酰基六肽-8的固相合成方法。
附图说明
图1为实施例2中乙酰基六肽-8的液相色谱图；
图2为实施例4中乙酰基六肽-8的液相色谱图。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明进行详细描述，但是应当理解，这些实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制，本发明的保护范围也不限于下述的实施例。
进一步优选地，在本发明的一些实施例中，步骤（2）中，缩合剂的制备方法为：按重量份计，将10~15份4-氨基邻苯二甲酸溶于20~40份无水乙醇中，然后在磁力搅拌作用下缓慢滴加3~7份浓硫酸，加热至60~75℃下回流反应20~24 h，旋蒸除去无水乙醇，然后加入5~10%碳酸钠溶液调节体系的pH至7.0~8.0，抽滤，用蒸馏水洗涤3~5次，干燥，并用15~25份乙酸乙酯溶解，过滤，重结晶，得到4-氨基邻苯二甲酸二乙酯；将1.75~2.5份4-氨基邻苯二甲酸二乙酯置于2.5~4.5份浓盐酸、5~10份蒸馏水中溶解，在冰浴条件下，滴加0.5~1份浓度为10~15wt%的亚硝酸钠溶液，在搅拌条件下进行重氮化反应1~2h，得到4-氨基邻苯二甲酸重氮盐；然后加入0.85~1.5份二甲基醌、1.5~3.5份乙酸钠、0.1~0.2份催化剂和20~50份蒸馏水，调节体系的pH至6.0~7.0，在0~4℃下反应20~24 h，然后升温至室温反应5~10 h，得到反应物a粗产物；将10~15份反应物a粗产物与80~100份乙酸、80~100份蒸馏水置于75~85℃下进行热过滤重结晶，抽滤，用蒸馏水洗涤3~5次，干燥，得到反应物a；将8~12份反应物a与40~60份氯化亚砜置于容器中，在磁力搅拌作用下加热至75~85℃回流反应3~5 h，反应结束后，减压蒸馏除去未反应的氯化亚砜，得到反应物b，将5.5~7.5份反应物b溶于60~80份二氯甲烷中，加入0.8~1.2份盐酸羟胺、3.5~6.5份吡啶，在室温下搅拌反应8~12 h，抽滤，用蒸馏水洗涤3~5次，干燥，得到改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺，即缩合剂。
以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：
实施例1：
一种缩合剂的制备方法为：按重量份计，将12.5份4-氨基邻苯二甲酸溶于30份无水乙醇中，然后在磁力搅拌作用下缓慢滴加4.5份浓硫酸，加热至70℃下回流反应24 h，旋蒸除去无水乙醇，然后加入10%碳酸钠溶液调节体系的pH至7.2，抽滤，用蒸馏水洗涤3次，干燥，并用20份乙酸乙酯溶解，过滤，重结晶，得到4-氨基邻苯二甲酸二乙酯；将1.85份4-氨基邻苯二甲酸二乙酯置于3.5份浓盐酸、10份蒸馏水中溶解，在冰浴条件下，滴加0.75份浓度为10wt%的亚硝酸钠溶液，在搅拌条件下进行重氮化反应1.5 h，得到4-氨基邻苯二甲酸重氮盐；然后加入1.2份二甲基醌、2.5份乙酸钠、0.14份十二烷基磺酸钠和40份蒸馏水，调节体系的pH至6.5，在3℃下反应24 h，然后升温至室温反应8h，得到反应物a粗产物；将13份反应物a粗产物与80份乙酸、100份蒸馏水置于75℃下进行热过滤重结晶，抽滤，用蒸馏水洗涤3次，干燥，得到反应物a；将10份反应物a与50份氯化亚砜置于容器中，在磁力搅拌作用下加热至75℃回流反应3 h，反应结束后，减压蒸馏除去未反应的氯化亚砜，得到反应物b，将6.5份反应物b溶于70份二氯甲烷中，加入0.95份盐酸羟胺、5份吡啶，在室温下搅拌反应10 h，抽滤，用蒸馏水洗涤3次，干燥，得到改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺，即缩合剂，其结构式如下：
Figure 725242DEST_PATH_IMAGE002
。
实施例2：
一种乙酰基六肽-8的固相合成方法，包括以下步骤：
（1）溶胀树脂、脱保护：按重量份计，将1.8份取代度为0.55 mmol/g的Rink AmideResin树脂置于反应柱中，用12份DMF洗涤1次，抽干，然后加入12份DMF溶胀，并用氮气吹拂搅拌35 min，抽干液体，再用12份DMF洗涤1次，抽干；加入6.5份15% 哌啶/DMF（v/v）溶液，脱保护8 min，抽干，用12份DMF洗涤1次，抽干，再加入7.5份15% 哌啶/DMF（v/v）溶液，脱保护8min，分别加入7份DMF、7份DCM洗涤树脂3次；
（2）固相接肽反应：将2.75份Fmoc-Arg(pdf)-OH与0.6份实施例1中的缩合剂溶解于8份DMF中，加入1.45份预处理的树脂，氮气吹拂搅拌反应1 h，抽滤除去反应液，用10份DMF洗涤1次，抽干，然后加入7份20% 哌啶/DMF（v/v）溶液，脱保护8 min，分别加入10份DMF、10份DCM洗涤树脂3次，得到接上第一个氨基酸的树脂；然后按上述方法依次偶联2.6份Fmoc-Arg(pdf)-OH、1.95份Fmoc-Gln(Trt)-OH、2.7份Fmoc-Met-OH、2.1份Fmoc-Glu(OtBu)-OH、2.4份Fmoc-Glu(OtBu)-OH，得到肽树脂A；
（3）Ac反应和肽的收缩：将1.05份肽树脂A置于反应柱中，然后加入20份二氯甲烷、0.25份乙酸酐、0.15份吡啶和0.2份HOBt进行反应25 min，用DMF洗涤3次，甲醇洗涤3次，干燥，得到肽树脂B；
（4）肽链切割：将2.4份肽树脂B置于20份裂解液中裂解2h，其中裂解液为三氟乙酸、甲基苯基硫醚与间甲酚的体积比为95：4.5：0.5，过滤，将滤液缓慢加入装有60份乙醚的容器中，以4000 r/min离心8 min，重复操作3次，在空气中静置20 min，减压干燥，纯化，浓缩，冻干，得到乙酰基六肽-8。
上述纯化条件为：采用Delta600 C18柱（4.6×250mm）；检测波长为215nm；流动相：A相：0.1%三氟乙酸水溶液；B相：乙腈；A相与B相的体积比为80：20；流速：1ml/min；进样量：10μL。
得到的乙酰基六肽-8氨基酸序列为：Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg。
实施例3：
一种乙酰基六肽-8的固相合成方法，与实施例2不同的是：步骤（1）中：按重量份计，将2.2份取代度为0.6 mmol/g的Rink Amide Resin树脂置于反应柱中，用10份DMF洗涤1次，抽干，然后加入10份DMF溶胀，并用氮气吹拂搅拌40 min，抽干液体，再用10份DMF洗涤1次，抽干；加入8份20% 哌啶/DMF（v/v）溶液，脱保护8 min，抽干，用10份DMF洗涤1次，抽干，再加入7.5份20% 哌啶/DMF（v/v）溶液，脱保护8 min，分别加入6份DMF、6份DCM洗涤树脂3次。
实施例4：
一种乙酰基六肽-8的固相合成方法，与实施例2不同的是：步骤（2）中：将2.75份Fmoc-Arg(pdf)-OH与0.6份缩合剂（其中缩合剂为实施例1中的改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺与DIC；其中改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺与DIC的重量比为1：1）溶解于8份DMF中，加入1.45份预处理的树脂，氮气吹拂搅拌反应1 h，抽滤除去反应液，用10份DMF洗涤1次，抽干，然后加入7份20% 哌啶/DMF（v/v）溶液，脱保护8 min，分别加入10份DMF、10份DCM洗涤树脂3次，得到接上第一个氨基酸的树脂；然后按上述方法依次偶联2.6份Fmoc-Arg(pdf)-OH、1.95份Fmoc-Gln(Trt)-OH、2.7份Fmoc-Met-OH、2.1份Fmoc-Glu(OtBu)-OH、2.4份Fmoc-Glu(OtBu)-OH，得到肽树脂A。
实施例5：
一种乙酰基六肽-8的固相合成方法，与实施例4不同的是：步骤（2）中：缩合剂为实施例1中的改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺与DIC；其中改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺与DIC的重量比为1：2。
实施例6：
一种乙酰基六肽-8的固相合成方法，与实施例4不同的是：步骤（2）中：缩合剂为实施例1中的改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺与EDC；其中改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺与EDC的重量比为1：1。
实施例7：
为了进一步提高了乙酰基六肽-8的收率与纯度，采取的优选措施还包括：在裂解液中添加2-叔丁基苯硫酚，其中裂解液中三氟乙酸、甲基苯基硫醚、间甲酚与2-叔丁基苯硫酚的体积比为90：3.5~4.5：0.5~1.5：4~6。各裂解液成分之间相互作用，缩短了粗肽的裂解时间，同时进一步提高了乙酰基六肽-8粗肽的纯度，进而得到收率与纯度较高的乙酰基六肽-8。
一种乙酰基六肽-8的固相合成方法，与实施例2不同的是：步骤（4）中：将2.4份肽树脂B置于20份裂解液中裂解1h，其中裂解液为三氟乙酸、甲基苯基硫醚、间甲酚与2-叔丁基苯硫酚的体积比为90：4.5：0.5：5，过滤，将滤液缓慢加入装有60份乙醚的容器中，以4000r/min离心8 min，重复操作3次，在空气中静置20 min，减压干燥，纯化，浓缩，冻干，得到乙酰基六肽-8。
实施例8：
一种乙酰基六肽-8的固相合成方法，与实施例7不同的是：步骤（4）中：将2.4份肽树脂B置于20份裂解液中裂解1 h，其中裂解液为三氟乙酸、甲基苯基硫醚、间甲酚与2-叔丁基苯硫酚的体积比为90：4.5：1.5：4，过滤，将滤液缓慢加入装有60份乙醚的容器中，以4000r/min离心8 min，重复操作3次，在空气中静置20 min，减压干燥，纯化，浓缩，冻干，得到乙酰基六肽-8。
实施例9：
一种乙酰基六肽-8的固相合成方法，与实施例8不同的是：步骤（2）中：缩合剂为N-羟基邻苯二甲酰亚胺。
实施例10：
一种乙酰基六肽-8的固相合成方法，与实施例8不同的是：步骤（2）中：缩合剂为N-羟基邻苯二甲酰亚胺与DIC，其中N-羟基邻苯二甲酰亚胺与DIC的重量比为1：1。
对比例1：
一种乙酰基六肽-8的固相合成方法，与实施例2不同的是：步骤（2）中：缩合剂为N-羟基邻苯二甲酰亚胺。
对比例2：
一种乙酰基六肽-8的固相合成方法，与实施例2不同的是：步骤（2）中：缩合剂为N-羟基邻苯二甲酰亚胺与DIC，其中N-羟基邻苯二甲酰亚胺与DIC的重量比为1：1。
结构与数据表征：
1.改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺的核磁数据表征
采用Bruker 400M核磁共振仪测定改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺的核磁结构。
1H NMR(CDCl3)：7.83(d, 1H, CH)，7.75(d, 1H, CH)，7.49(s, 1H, CH)，6.72(s,1H, CH)，2.45(s, 6H, CH3)，2.01(s, 1H, OH)。
2.缩合剂的缩合效果测试
实验样品：实施例2、实施例4、实施例5、实施例6、实施例9、实施例10中步骤（2）的缩合剂；将2.5份Fmoc-Arg(pdf)-OH与0.35份缩合剂实验样品溶解于10份DMF中，加入1.45份预处理的树脂（树脂的处理步骤同实施例2步骤（1）），氮气吹拂搅拌反应，观察反应溶液的颜色，若溶液呈现亮黄色，树脂透明，说明基本没有自由氨基的存在，缩合反应完成，进而得到缩合反应完成所需要的时间，其中实施例2、实施例4、实施例5、实施例6、实施例9、实施例10的缩合实验分别记为试验例1、试验例2、试验例3、试验例4、试验例5、试验例6。
表1 不同缩合试剂的缩合时间
Figure DEST_PATH_IMAGE003
由表1可以看出，试验例1-4的缩合时间低于25 min，对比试验例1与试验例5、试验例2与试验例6，试验例1的缩合时间低于试验例5，试验例2的缩合时间低于试验例6，说明采用对二甲基醌改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺制得缩合剂，其缩短了缩合反应的时间，提高了其对氨基酸的缩合效率，且不易发生消旋化反应；试验例2-3的缩合时间低于18 min，对比试验例2-3与试验例1、试验例4，试验例2-3的缩合时间低于试验例1、试验例4，说明将改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺与DIC联合使用，其缩合效果优于单独使用改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺，也优于改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺与EDC联合使用的效果，因此，本发明采用改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺与DIC作为复合缩合剂，进一步提高了氨基酸的缩合效率。
3.乙酰基六肽-8的收率与纯度测试
对实施例2-10、对比例1与对比例2步骤（4）中合成的乙酰基六肽-8收率与纯度进行检测，测试结果如表2所示。
表2乙酰基六肽-8的收率与纯度测试结果
Figure 442663DEST_PATH_IMAGE004
由表2可以看出，实施例2-6中乙酰基六肽-8的收率高于92.5%，纯度高于93.5%，对比实施例2与对比例1，实施例2中乙酰基六肽-8的收率与纯度高于对比例1，说明采用对二甲基醌改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺制得改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺，将其作为乙酰基六肽-8固相合成的缩合剂，其提高了乙酰基六肽-8的收率与纯度；对比实施例2与实施例4-5、实施例6，实施例4-5中乙酰基六肽-8的收率与纯度高于实施例2、实施例6，说明将改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺与DIC联合使用，得到的乙酰基六肽-8的收率与纯度高于单独使用改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺，也高于改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺与EDC联合使用的效果，因此，本发明采用改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺与DIC作为复合缩合剂，进一步提高了乙酰基六肽-8粗肽的收率与纯度。
从表2还可以看出，实施例7-8中乙酰基六肽-8的收率高于97.5%，纯度高于98%，对比实施例2与实施例7，实施例4与实施例8，实施例7中乙酰基六肽-8的收率与纯度高于实施例2，实施例8中乙酰基六肽-8的收率与纯度高于实施例4，说明在步骤（4）中的裂解液中添加2-叔丁基苯硫酚，进一步提高了乙酰基六肽-8的收率与纯度。
其中，图1、图2分别为实施例2与实施例4中乙酰基六肽-8的液相色谱图；经纯化后得到的乙酰基六肽-8分析得到面积最大峰，图1可以看出，实施例2中乙酰基六肽-8的纯度高于94.5%；由图2可以看出，实施例4中乙酰基六肽-8的纯度高于96%。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (10)

1.一种乙酰基六肽-8的固相合成方法，包括以下步骤：
（1）溶胀树脂、脱保护：将氨基树脂置于反应柱中溶胀，洗涤，干燥，脱保护，得到预处理后的树脂；
（2）固相接肽反应：将Fmoc-Arg(pdf)-OH与缩合剂溶解于溶剂中，加入所述预处理后的树脂，搅拌反应，抽滤，洗涤，脱保护，得到接上第一个氨基酸的树脂；然后依次偶联精氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、谷氨酸、谷氨酸，得到肽树脂A；
（3）Ac反应和肽的收缩：将所述肽树脂A置于反应柱中，然后加入二氯甲烷、乙酸酐、吡啶和缩合剂进行反应，洗涤，干燥，得到肽树脂B；
（4）肽链切割：将所述肽树脂B置于裂解液中进行裂解，过滤，离心，静置，减压干燥，纯化，浓缩，冻干，得到乙酰基六肽-8；
所述步骤（2）中缩合剂包括改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺；其结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
2.根据权利要求1所述的一种乙酰基六肽-8的固相合成方法，其特征是：所述改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺为对二甲基醌改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺。
3.根据权利要求1所述的一种乙酰基六肽-8的固相合成方法，其特征是：所述步骤（1）中，氨基树脂的取代度为0.45~0.65 mmol/g，溶胀20~40 min。
4.根据权利要求1所述的一种乙酰基六肽-8的固相合成方法，其特征是：所述步骤（2）中，缩合剂还包括HOBt、DCC、DIC、EDC中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的一种乙酰基六肽-8的固相合成方法，其特征是：所述步骤（2）中，缩合剂为改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺与DIC；其中改性N-羟基邻苯二甲酰亚胺与DIC的重量比为1：1~2。
6.根据权利要求1所述的一种乙酰基六肽-8的固相合成方法，其特征是：所述步骤（2）中，按重量份计，Fmoc-Arg(pdf)-OH为2.5~3.5份、缩合剂为0.5~0.8份、溶剂为5~10份。
7.根据权利要求1所述的一种乙酰基六肽-8的固相合成方法，其特征是：所述步骤（2）中，缩合剂的制备方法为：将4-氨基邻苯二甲酸溶于无水乙醇中，然后缓慢滴加浓硫酸进行加热回流反应，旋蒸，抽滤，洗涤，干燥，用乙酸乙酯溶解，过滤，重结晶，得到4-氨基邻苯二甲酸二乙酯；将所述4-氨基邻苯二甲酸二乙酯置于盐酸、水、催化剂中溶解，在冰浴条件下，滴加亚硝酸钠溶液进行重氮化反应得到4-氨基邻苯二甲酸重氮盐；然后加入二甲基醌、碳酸氢钠在冰浴条件下进行反应得到反应物a；将反应物a与氯化亚砜置于容器中，在磁力搅拌作用下进行加热回流反应3~5 h，反应结束后，得到反应物b，将反应物b溶于二氯甲烷中，加入盐酸羟胺，在室温下搅拌反应8~12 h，抽滤，水洗，干燥，得到缩合剂。
8.根据权利要求1所述的一种乙酰基六肽-8的固相合成方法，其特征是：所述步骤（3）为：按重量份计，肽树脂A为0.5~1.5份、二氯甲烷为15~30份、乙酸酐为0.25~0.45份、吡啶为0.1~0.2份和缩合剂为0.15~0.25份。
9.根据权利要求1所述的一种乙酰基六肽-8的固相合成方法，其特征是：所述步骤（3）中，缩合剂为TBTU、HOBt、PyBOP、HOAt、DIPCDI中的至少一种。
10.根据权利要求1所述的一种乙酰基六肽-8的固相合成方法，其特征是：所述步骤（4）中，裂解液为三氟乙酸、甲基苯基硫醚与间甲酚，其体积比为95：3.5~4.5：0.5~1.5。
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