CN114042106A - 一种微波辅助提取土家族药物三百棒中总生物碱的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于总生物碱提取技术领域，提出了一种微波辅助提取土家族药物三百棒中总生物碱的方法，包括如下步骤：步骤一：原材料的前处理，取土家族药物三百棒的根皮，经洗净、烘干、粉碎，得粉末物料A；步骤二：微波提取，以稀盐酸调节pH2～6的乙醇水溶液浸泡粉末物料A30～60min后，微波提取10～30min，重复1～3次，合并滤液，得滤液B；步骤三：离子交换树脂住吸附，滤液B转移至装有离子交换树脂的吸附柱中，充分动态吸附，得吸附柱C；步骤四：碱化、洗脱，吸附柱C加入不同浓度和料液比的氨水，碱化一定时间，再用乙醚洗脱，得到洗脱液D；步骤五：浓缩、干燥，洗脱液D减压浓缩，回收溶剂，析出淡黄色结晶，即得所述的土家族药物三百棒总生物碱。

Description

一种微波辅助提取土家族药物三百棒中总生物碱的方法

技术领域

本发明属于总生物碱提取技术领域，具体涉及一种微波辅助提取土家族药物三百棒中总生物碱的方法。

背景技术

土家族药物三百棒为芸香科植物飞龙掌血[Toddalia asiatica(L.)Lam.]的根或根皮，最先记载于《植物名实图考》，又名黄椒根、血莲肠、血见飞、血见愁、大救驾、三百棒等,具有祛风通血止痛，主治风寒湿痹症，肢体关节肿痛，屈伸不利等。现代化学研究表明，其主要化学成分包括生物碱类、香豆素类、挥发油类等，还含有少量的甾醇、树脂和三萜类化合物。现代药理研究发现，三百棒具有良好的抗炎、镇痛、抗菌、抗心肌缺血、抑菌等作用，与其主要有效成分生物碱类有关。

三百棒中生物碱类成分种类极多，现代研究发现根、根皮和茎中分离出的生物碱就有8-丙酮基-二氢-白屈菜红碱、8-甲氧基-二氢-白屈菜红碱、去甲白屈菜红碱、二氢光叶花椒碱、去-N-甲基白屈菜红碱、氧化白屈菜红碱、氧化勒碱、勒碱、二氢勒碱、白鲜碱、白屈菜红碱、二氢白屈菜红碱、8-羟基二氢白屈菜红碱等10余种。

目前虽然有关于三百棒中生物碱的提取报道，但是多存在提取效率低、操作方法复杂、生产成本高等缺陷。

发明内容

本发明旨在提供一种微波辅助提取土家族药物三百棒中总生物碱的方法，以解决现在存在的土家族药物三百棒总生物碱提取操作复杂、提取效率低下的问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种微波辅助提取土家族药物三百棒中总生物碱的方法，包括如下步骤：

步骤一：原材料的前处理，取土家族药物三百棒的根皮，经洗净、烘干、粉碎，得粉末物料A；

步骤二：微波提取，以稀盐酸调节pH2～6的乙醇水溶液浸泡粉末物料A30～60min后，微波提取10～30min，重复1～3次，合并滤液，得滤液B；

步骤三：离子交换树脂住吸附，滤液B转移至装有离子交换树脂的吸附柱中，充分动态吸附，得吸附柱C；

步骤四：碱化、洗脱，吸附柱C加入不同浓度和料液比的氨水，碱化一定时间，再用乙醚洗脱，得到洗脱液D；

步骤五：浓缩、干燥，洗脱液D减压浓缩，回收溶剂，析出淡黄色结晶，即得所述的土家族药物三百棒总生物碱。

在本发明的一种优选实施方式中，步骤一中，粉末物料A的粒径为80～120目。

在本发明的一种优选实施方式中，步骤二中，稀盐酸浓度为1％～3％，乙醇水溶液浓度为50～90％。

在本发明的一种优选实施方式中，步骤二中，微波提取的功率为700～900W。

在本发明的一种优选实施方式中，步骤三中，离子交换树脂为阳离子型交换树脂，其活性官能团包括磺酸基和/或羧基。

在本发明的一种优选实施方式中，步骤三中，充分动态吸附时间≥12h。

在本发明的一种优选实施方式中,步骤四中，氨水浓度为5％～25％，加入量与粉末物料A的体积重量比为15～25L/kg。

在本发明的一种优选实施方式中，步骤四中，碱化时间为15～60min。

本发明的原理和有益效果：(1)本发明充分利用酸性试剂调节提取溶剂的pH值至酸性，加入三百棒浸泡，使提取溶剂充分渗透到物料颗粒中，与三百棒生物碱类成分生成溶解性更高的盐类，从而促进生物碱类成分的溶出，增加了提取效率。

(2)本发明采用微波辅助提取，利用萃取过程中高频电磁波穿透提取溶剂达到物料内部，激发溶剂碰撞产生热能使细胞内部迅速升温破裂，加速有效成分溶出，且其产热过程迅速科最大限度地保证生物碱类成分的质量；相较于传统的溶剂提取法具有高效节能、安全环保的特点。

(3)本发明的提取方法步骤简单、操作简便、安全性高，总生物碱的粗提取率高达1.23％。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是本申请实施例1中的微波辅助提取土家族药物三百棒中总生物碱的方法的流程示意图。

图2为实施例2中三百棒粉末的粒径对总生物碱提取率影响的比较图。

图3为实施例3中乙醇浓度对总生物碱提取率影响的比较图。

图4为实施例4中提取溶剂pH值对总生物碱提取率影响的比较图。

图5为实施例5中料液比对总生物碱提取率影响的比较图。

图6为实施例6中微波提取时间对总生物碱提取率影响的比较图。

图7为实施例7中微波提取次数对总生物碱提取率影响的比较图。

图8为实施例8中微波提取功率对总生物碱提取率影响的比较图。

图9为实施例11中氯化两面针碱的线性回归方程。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“纵向”、“横向”、“竖向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

在本发明的描述中，除非另有规定和限定，需要说明的是，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是机械连接或电连接，也可以是两个元件内部的连通，可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。

实施例1

基本如附图1所示，一种微波辅助提取土家族药物三百棒中总生物碱的方法，包括如下步骤：

步骤一：原材料的前处理，取土家族药物三百棒的根皮，经洗净、烘干、粉碎，得粉末物料A，粉末物料A的粒径为80～120目；

步骤二：微波提取，以浓度为1％～3％的稀盐酸调节pH2～6的乙醇水溶液浸泡粉末物料A30～60min后，微波提取10～30min，微波提取的功率为700～900W，重复1～3次，合并滤液，得滤液B，乙醇水溶液浓度为50～90％；

步骤三：离子交换树脂住吸附，离子交换树脂为阳离子型交换树脂，其活性官能团包括磺酸基和/或羧基，滤液B转移至装有离子交换树脂的吸附柱中，充分动态吸附，吸附时间≥12h，得吸附柱C；

步骤四：碱化、洗脱，吸附柱C加入不同浓度和料液比的氨水，氨水浓度为5％～25％，加入量与粉末物料A的体积重量比为15～25L/kg，碱化15～60min，再用乙醚洗脱，得到洗脱液D；

步骤五：浓缩、干燥，洗脱液D减压浓缩，回收溶剂，析出淡黄色结晶，即得所述的土家族药物三百棒总生物碱。

实施例2

取洗净干燥的土家族药物三百棒，采用盘式粉碎磨粉碎，分别精密称取60目、80目、100目、120目、150目药物粉末5.00g于具塞锥形瓶中，按1:10料液比，加入提前用2％盐酸调节pH至3.0的70％乙醇溶液，浸泡30min，在800W微波下提取10min，滤去不溶物，精密移取滤液1.0ml定容至50ml容量瓶中，测定吸光度，得出最佳物料粒径。根据回归方程：A＝0.316×C+0.019计算测定液中生物碱的含量，再根据公式总生物碱提取率(％)＝C×50×10-3/(称取的三百棒质量)×100％计算总生物碱的提取率。结果见表1和附图2。

表1 三百棒粉末的粒径对总生物碱提取率影响

由表1和附图2可以看出，60～120目范围内随着物料粒径的增大，总生物碱提取率也随之增大，在150目时总生物碱提取率反而降低，可能是由于粒径过小产生吸附作用导致部分生物碱类溶出减少，最佳的物料粒径为80～120目。

实施例3

取洗净干燥的土家族药物三百棒，采用盘式粉碎磨粉碎粉碎成100目，精密称取药物粉末5.00g于具塞锥形瓶中，按1:10料液比，分别加入提前用2％盐酸调节pH至3.0的50％、60％、70％、80％、90％的乙醇溶液，浸泡30min，在800W微波下提取10min，滤去不溶物，精密移取滤液1.0ml定容至50ml容量瓶中，测定吸光度，得出最佳提取溶剂。根据回归方程：A＝0.316×C+0.019计算测定液中生物碱的含量，再根据公式总生物碱提取率(％)＝C×50×10-3/(称取的三百棒质量)×100％计算总生物碱的提取率。结果见表2和附图3。

表2 乙醇浓度对总生物碱提取率影响

由表2和附图3可以看出，总生物碱提取率随着乙醇浓度的增加而增大，当乙醇浓度达到70％时，三百棒中总生物碱的提取率达到最大，之后随着乙醇浓度的增大其提取率反而降低，最佳的乙醇浓度为60％～80％。

实施例4

取洗净干燥的土家族药物三百棒，采用盘式粉碎磨粉碎，粉碎成100目，精密称取药物粉末5.00g于具塞锥形瓶中，按1:6、1:7、1:8、1:9、1:10料液比，分别加入提前用2％盐酸调节pH至3.0的70％的乙醇溶液，浸泡30min，在800W微波下提取10min，滤去不溶物，精密移取滤液1.0ml定容至50ml容量瓶中，测定吸光度，得出最佳料液比。根据回归方程：A＝0.316×C+0.019计算测定液中生物碱的含量，再根据公式总生物碱提取率(％)＝C×50×10-3/(称取的三百棒质量)×100％计算总生物碱的提取率。结果见表3和附图4。

表3 料液比对总生物碱提取率影响

由表3和附图4可以看出，总生物碱提取率随着料液比的增加而增大，考虑到料液比过大可能会造成生产成本增加，最佳的料液比为1:8～1:10。

实施例5

取洗净干燥的土家族药物三百棒，采用盘式粉碎磨粉碎粉碎成100目，精密称取药物粉末5.00g于具塞锥形瓶中，按1:10料液比，分别加入提前用2％盐酸调节pH至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的70％的乙醇溶液，浸泡30min，在800W微波下提取10min，滤去不溶物，精密移取滤液1.0ml定容至50ml容量瓶中，测定吸光度，得出最佳溶剂pH值。根据回归方程：A＝0.316×C+0.019计算测定液中生物碱的含量，再根据公式总生物碱提取率(％)＝C×50×10-3/(称取的三百棒质量)×100％计算总生物碱的提取率。结果见表4和附图5。

表4 溶剂pH值对总生物碱提取率影响

由表4和附图5可以看出，总生物碱提取率随着提取溶剂pH值的增加而降低，考虑到pH过低可能会造成生产设备损伤增加生产成本，最佳的溶剂pH值为3.0。

实施例6

取洗净干燥的土家族药物三百棒，采用盘式粉碎磨粉碎粉碎成100目，精密称取药物粉末5.00g于具塞锥形瓶中，按1:10料液比，加入提前用2％盐酸调节pH至3.0的70％的乙醇溶液，浸泡30min，分别在700W、750W、800W、850W、900W(对应功率1、2、3、4、5档)微波下提取10min，滤去不溶物，精密移取滤液1.0ml定容至50ml容量瓶中，测定吸光度，得出最佳提取功率。根据回归方程：A＝0.316×C+0.019计算测定液中生物碱的含量，再根据公式总生物碱提取率(％)＝C×50×10-3/(称取的三百棒质量)×100％计算总生物碱的提取率。结果见表5和附图6。

表5 溶剂pH值对总生物碱提取率影响

由表5和附图6可以看出，总生物碱提取率随着提取功率的增加而增大，达到800W后总生物碱的提取率增加极不明显，而过高的功率会增加生产成本甚至导致生物碱成分结构破坏，故最佳的提取功率为800W。

实施例7

取洗净干燥的土家族药物三百棒，采用盘式粉碎磨粉碎粉碎成100目，精密称取药物粉末5.00g于具塞锥形瓶中，按1:10料液比，加入提前用2％盐酸调节pH至3.0的70％的乙醇溶液，浸泡30min，在700W微波下提取10min、15min、20min、25min、30min，滤去不溶物，精密移取滤液1.0ml定容至50ml容量瓶中，测定吸光度，得出最佳提取时间。根据回归方程：A＝0.316×C+0.019计算测定液中生物碱的含量，再根据公式总生物碱提取率(％)＝C×50×10-3/(称取的三百棒质量)×100％计算总生物碱的提取率。结果见表6和附图7。

表6 提取时间对总生物碱提取率影响

由表6和附图7可以看出，总生物碱提取率随着提取时间的增加而增大，达到25min时总生物碱的提取率反而下降，可能与提取时间过长微波产热导致部分生物碱类成分水解，故最佳的提取时间为10～15min。

实施例8

取洗净干燥的土家族药物三百棒，采用盘式粉碎磨粉碎粉碎成100目，精密称取药物粉末5.00g于具塞锥形瓶中，按1:10料液比，加入提前用2％盐酸调节pH至3.0的70％的乙醇溶液，浸泡30min，在700W微波下提取10min，分别重复提取1次、2次、3次，滤去不溶物，合并滤液，精密移取滤液1.0ml定容至50ml容量瓶中，测定吸光度，得出最佳提取次数。根据回归方程：A＝0.316×C+0.019计算测定液中生物碱的含量，再根据公式总生物碱提取率(％)＝C×50×10-3/(称取的三百棒质量)×100％计算总生物碱的提取率。结果见表7和附图8。

表7 提取次数对总生物碱提取率影响

由表7和附图8可以看出，总生物碱提取率与提取次数的增加无明显相关性，提示微波提取效率较高，为减少生产成本，最佳提取次数为1次。

实施例9

以总生物碱提取率(％)为指标，根据实施例1～实施例7的研究结果，以物料粒径、料液比、乙醇浓度、提取时间为影响微波辅助提取为影响因素，设置不同的水平，采用L9(34)进行正交实验来确定最佳提取工艺。

操作方法为：取洗净干燥的土家族药物三百棒，采用盘式粉碎磨粉碎粉碎成不同粒径(因素A)的物料，精密称取药物粉末5.00g于具塞锥形瓶中，按不同料液比(因素B)加入提前用2％盐酸调节pH至3.0的不同浓度乙醇溶液(因素C)，浸泡30min，在800W微波下提取不同时间(因素D)，滤去不溶物，精密移取滤液1.0ml定容至50ml容量瓶中，测定吸光度，得出最佳提取时间。根据回归方程：A＝0.316×C+0.019计算测定液中生物碱的含量，再根据公式总生物碱提取率(％)＝C×50×10-3/(称取的三百棒质量)×100％计算总生物碱的提取率。因素水平表、正交实验结果见表8、表9。

表8 微波辅助法提取三百棒中总生物碱的因素水平表

表9 正交实验结果

根据极差R的大小进行因素影响的主次排序，R越大则该因素对总生物碱提取率的影响越大；K值越大则表明该因素条件下，总生物碱的提取率越高。由表可见，四个因素的主次关系是C＞D＞A＞B，即乙醇浓度＞微波提取时间＞物料粒径＞料液比；最佳组合为A2B2C2D2，即三百棒药材粉碎成100目，按1:9料液比加入提前用2％盐酸调节pH至3.0的70％乙醇溶液，浸泡30min，在800W微波下提取15min，滤去不溶物，所得滤液中总生物碱得提取率最高，可达1.35％。

实施例10

按照实施例8所筛选的最佳组合提取工艺进行验证。精密称取洗净干燥并粉碎至100目的土家族药物三百棒粉末5.00g5于具塞锥形瓶中，按1:9料液比加入提前用2％盐酸调节pH至3.0的70％乙醇溶液，浸泡30min，在800W微波下提取15min，精密移取滤液1.0ml定容至50ml容量瓶中，测定吸光度。根据回归方程：A＝0.316×C+0.019计算测定液中总生物碱的含量，再根据公式总生物碱提取率(％)＝C×50×10-3/(称取的三百棒质量)×100％计算总生物碱的提取率。重复上述操作5次，结果见表10。

表10 最优提取方案所制备提取液中总生物碱提取率测定结果

实施例11

按照实施例10方法称取12批次土家族药物三百棒粉末200.00g制备成提取液，分别转移至装有离子交换树脂的吸附柱中，在一定温度下充分动态吸附一定时间后，加入不同浓度和料液比的氨水，碱化一定时间，再用乙醚洗脱，洗脱液减压浓缩，回收溶剂，析出淡黄色结晶物，即得所述得土家族药物三百棒总生物碱，称定重量。根据公式总生物碱粗提取率＝析出黄色结晶物质量/称取的三百棒药材质量×100％计算总生物碱的粗提取率，结果见表11。

表11 土家族药物三百棒总生物粗提取率结果

实施例12

实施例2～实施例10均以氯化两面针碱为标准品，采用酸性染料比色法测定土家族药物三百棒提取液中总生物碱的含量，为总生物碱提取、精制过程中的跟踪监测提供简便可靠的检测。上述实施例均包括以下步骤：

(1)试液配制

①对照品溶液的配制：精密称取氯化两面针碱10mg，甲醇溶解并定容至100ml，即得100μg/ml的标准溶液。

②酸性染料的配制：精密称取溴甲酚绿0.10g置于研钵中，加入2.8ml NaOH溶液，研磨至粉末充分溶解后，加入200ml的蒸馏水稀释，移入具塞的广口瓶中备用。

(2)最大吸收波长的选择：精密移取对照品溶液2ml移入25ml容量瓶中，加入3ml溴甲酚绿显色溶液，加入pH＝5.0的磷酸二氢钾缓冲液4.5ml溶解，摇匀静置30min，加入氯仿5ml，振摇静置10min，取氯仿层，萃取两次，合并萃取液，定容至25ml，以无水甲醇作为空白对照，在200～800nm范围内进行全波长扫描，在330nm处有最大吸收，确定最大吸收波长为330nm。

(3)标准曲线的制作：精密移取氯化两面针碱标准溶液20、40、80、100、200、400μl，加甲醇稀释并定容至10ml，即得浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、4.0μg/ml的系列标准品溶液，以无水甲醇作为空白对照，在330nm处测定吸光度A，以吸光度A对浓度C进行线性回归，得回归方程为A＝0.316×C+0.019，相关系数R＝0.9994，提示氯化两面针碱在在2～40μg/ml范围内良好，结果见附图9。

(4)系统适用性试验：对其开展稳定性、加样回收、重复性实验，以吸光度计算RSD均小于5％，提示该方法精密度、重复性良好，氯化两面针碱在48h内稳定。

在本说明书的描述中，参考术语“优选的实施方式”、“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种微波辅助提取土家族药物三百棒中总生物碱的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：原材料的前处理，取土家族药物三百棒的根皮，经洗净、烘干、粉碎，得粉末物料A；

步骤二：微波提取，以稀盐酸调节pH2～6的乙醇水溶液浸泡粉末物料A30～60min后，微波提取10～30min，重复1～3次，合并滤液，得滤液B；

步骤三：离子交换树脂住吸附，滤液B转移至装有离子交换树脂的吸附柱中，充分动态吸附，得吸附柱C；

步骤四：碱化、洗脱，吸附柱C加入不同浓度和料液比的氨水，碱化一定时间，再用乙醚洗脱，得到洗脱液D；

步骤五：浓缩、干燥，洗脱液D减压浓缩，回收溶剂，析出淡黄色结晶，即得所述的土家族药物三百棒总生物碱。

2.如权利要求1所述的微波辅助提取土家族药物三百棒中总生物碱的方法，其特征在于，步骤一中，粉末物料A的粒径为80～120目。

3.如权利要求2所述的微波辅助提取土家族药物三百棒中总生物碱的方法，其特征在于，步骤二中，稀盐酸浓度为1％～3％，乙醇水溶液浓度为50～90％。

4.如权利要求3所述的微波辅助提取土家族药物三百棒中总生物碱的方法，其特征在于，步骤二中，微波提取的功率为700～900W。

5.如权利要求4所述的微波辅助提取土家族药物三百棒中总生物碱的方法，其特征在于，步骤三中，离子交换树脂为阳离子型交换树脂，其活性官能团包括磺酸基和/或羧基。

6.如权利要求5所述的微波辅助提取土家族药物三百棒中总生物碱的方法，其特征在于，步骤三中，充分动态吸附时间≥12h。

7.如权利要求6所述的微波辅助提取土家族药物三百棒中总生物碱的方法，其特征在于，步骤四中，氨水浓度为5％～25％，加入量与粉末物料A的体积重量比为15～25L/kg。

8.如权利要求7所述的微波辅助提取土家族药物三百棒中总生物碱的方法，其特征在于，步骤四中，碱化时间为15～60min。

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