CN110437040A - 一种虎杖中白藜芦醇的提取方法 - Google Patents

一种虎杖中白藜芦醇的提取方法 Download PDF

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陈鸿平
陈林
胡媛
陶明宝
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Abstract

本发明提供了一种酶解法提取虎杖中白藜芦醇的方法。本发明采用酶解法提取虎杖中的白藜芦醇，具有耗能少、高效、绿色环保、操作简便易行、生产成本低的优势，为酶解法提取虎杖中白藜芦醇的工艺产业化提供基础。

Description

一种虎杖中白藜芦醇的提取方法
技术领域
本发明具体涉及一种虎杖中白藜芦醇的提取方法。
背景技术
虎杖为蓼科多年生草本植物虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.)的干燥根及根茎，药用历史悠久。具有利湿退黄，清热解毒，散瘀止痛，止咳化痰的功效，主治湿热黄疸，淋浊，带下，风湿痹痛，痈肿疮毒，水火烫伤，经闭，癥瘕，跌打损伤，肺热咳嗽。现阶段虎杖中的化学成分研究已经比较深入，虎杖中的化学成分主要有茋类化合物、蒽醌类化合物、黄酮类化合物、水溶性多糖、鞣质等成分。以白藜芦醇为代表的茋类化合物具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗血栓、抗高血脂及抗氧化等活性，被广泛用于药品、保健品、化妆品及食品添加剂等行业。
目前常用于白藜芦醇提取的方法有有机溶剂提取法、超声波提取法、微波辅助提取、超临界CO2萃取技术、酶解法等。王利洁,李建利,施明毅,等.星点设计-效应面法优化虎杖中白藜芦醇的提取工艺[J].世界科学技术-中医药现代化,2014,16(05):1193-1200.，采用乙醇温水浴浸提虎杖中的白藜芦醇，白藜芦醇含量为0.280％，有机溶剂提取法操作简便易行、生产成本低，但溶剂消耗量较大、受热时间较长且提取效率不高。常永芳,刘志强,冯俊霞,等.虎杖中白藜芦醇的超声提取条件优化[J].江苏农业科学,2012,40(3),241-242.，采用超声波提取法提取虎杖中的白藜芦醇，白藜芦醇含量为0.261％；Chen BY,Kuo CH,LiuYC,et al.Ultrasonic-Assisted Extraction of the Botanical Dietary SupplementResveratrol and Other Constituents of Polygonum cuspidatum[J].Journal ofNatural Products,2012,75(10):1810-1813.的提取含量为0.350％；宋宏新,刘静,柏红梅,等.酶法转化制备虎杖中的白藜芦醇[J].食品科技,2009,34(9):202-205.，采用酶法超声提取，产物含量由1.44mg·g-1提高到14.16mg·g-1。超声波产生的空化现象能够加速药材中有效成分的溶出，但超声波提取法尚处于实验室小规模研究阶段，不能用于工业化大规模生产。Shengjiu GU,Meibo LI,Tinting ZHAO,et al.Microwave-assistedExtraction of Resveratrol from Polygonum cuspidatum[J].Medicinal Plant,2014,5(01):1-4.，采用微波辅助提取虎杖中的白藜芦醇，白藜芦醇的含量为0.915％，微波萃取具有选择性高、操作时间短等优点，但微波萃取具有明显的热效应且微波泄漏对工作者的身体危害较大。方耀平等采用超临界CO2流体萃取虎杖中的白藜芦醇，萃取率为0.096％，超临界CO2萃取技术有高效、耗能少、绿色环保等优势，但技术含量要求较高，设备运行成本大，故很难投入大工业化生产。采用酶解法提取虎杖中的白藜芦醇，王林等采用漆酶、纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶酶解，白藜芦醇的提取含量为0.592％；而叶秋雄等采用纤维素酶酶解，白藜芦醇的提取含量为0.942％，周炳贤采用纤维素酶酶解，白藜芦醇的提取含量为1.389％，孙勇民等采用复合酶(纤维素酶+阿魏酸酯酶)酶解，白藜芦醇的提取含量为1.513％，酶解法提取效率较高，但目前的酶解提取工艺中提取药材多为过筛虎杖细粉，工业化生产成本较高，提取溶剂为甲醇、丙酮等毒性较大的溶剂，易造成污染。
综上，工业上对虎杖中的白藜芦醇开发力度较大，但现行的工艺和方法存在着含量低、生产周期长、生产成本相对较高、易造成资源浪费和环境污染等问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种虎杖中白藜芦醇的提取方法，它包括如下步骤：
1)酶解：取虎杖药材，加入药材质量0.1～1.0％的提取酶，按料液比1:(2～6)w/v加入pH为4.0～5.5的盐酸水溶液，30～60℃酶解1～48h；
2)醇提：酶解后样品加入8～12倍量的65～85％乙醇溶液，50～85℃提取1～3h，提取次数为1～3次，合并提取液，过滤，即得。
进一步地，步骤1)所述提取酶为纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、虎杖提取用酶中的一种或几种的组合物；优选地，所述提取酶为纤维素酶。
进一步地，步骤1)所述提取酶加入量为药材质量的0.6％。
进一步地，步骤1)所述盐酸水溶液加入量为料液比1:4w/v。
进一步地，步骤1)所述盐酸水溶液的pH为5.0。
进一步地，步骤1)所述酶解温度为50℃。
进一步地，步骤1)所述酶解时间为36h。
进一步地，步骤2)所述乙醇溶液为80％的乙醇溶液；和/或，乙醇溶液加入量为酶解后样品的8倍量。
进一步地，步骤2)所述醇提温度为85℃。
进一步地，步骤2)所述醇提时间为每次2h；和/或，所述提取次数为3次。
本发明采用酶解法提取虎杖中的白藜芦醇，具有耗能少、高效、绿色环保、操作简便易行、生产成本低的优势，为酶解法提取虎杖中白藜芦醇的工艺产业化提供基础。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1、虎杖中白藜芦醇的提取
1)酶解：取虎杖粗粉(药材)50g，加入药材质量的0.3％的纤维素酶，加入200mL用盐酸调pH＝5.0的盐酸水溶液，50℃水浴酶解36h，酶解后的样品进行醇提；
2)醇提：酶解后的样品加入8倍量80％乙醇，85℃水浴提取2h，重复提取3次，合并提取液，粗过滤，再离心(3000r·min-1，10min)，离心后得提取液。
实施例2、虎杖中白藜芦醇的提取
1)酶解：取虎杖粗粉(药材)50g，加入药材质量的0.1％的纤维素酶，加入200mL用盐酸调pH＝4.0的盐酸水溶液，30℃水浴酶解1h，酶解后的样品进行醇提；
2)醇提：酶解后的样品加入10倍量65％乙醇，50℃水浴提取1h，先粗过滤，再离心(3000r·min-1，10min)，离心后得提取液。
实施例3、虎杖中白藜芦醇的提取
1)酶解：取虎杖粗粉(药材)50g，加入药材质量的1.0％的纤维素酶，加入300mL用盐酸调pH＝5.5的盐酸水溶液，60℃水浴酶解48h，酶解后的样品进行醇提；
2)醇提：酶解后的样品加入12倍量85％乙醇，70℃水浴提取3h，重复提取2次，合并提取液，粗过滤，再离心(3000r·min-1，10min)，离心后得提取液。
以下通过实验例说明本发明的有益效果。
1、白藜芦醇的含量测定
(1)色谱条件：色谱柱：Kromasil-C18(200*4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-0.05％磷酸水溶液(30:70)；检测波长：305nm；流速：1mL·min-1；柱温：30℃；进样量：10μL。
(2)对照品溶液配制：取白藜芦醇对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.1004mg的溶液，即得。
(3)白藜芦醇含量测定：取虎杖粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇40mL，称定重量，在920W下超声1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，滤渣重复提取1次，合并提取液，取续滤液，即得。按“(1)”色谱条件测得白黎芦醇的含量为0.459％，虎杖苷的含量为3.541％。
(4)标准曲线的制备：精密吸取白藜芦醇对照品溶液1，5，10，15，20μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行分析，记录色谱峰面积的积分值，以白藜芦醇进样量(μg)为横坐标(X)，以测得峰面积积分值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。回归方程为Y＝7488.2X+28.986，r＝0.9996，线性范围为0.1004～2.0080μg。
(5)精密度实验：在上述色谱条件下精密吸取同一浓度的白藜芦醇对照品溶液10μL，连续进样6次，测定峰面积积分值，计算精密度。RSD为0.056％，表明进样精密度良好。
(6)稳定性实验：取同一样品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12h测含量，结果样品在12h内基本稳定，RSD为0.13％。
(7)重复性实验：精密称取同一批虎杖粉末6份，每份0.5g，按“(3)”所述制备方法和“(1)”所述色谱条件进行测定，RSD为1.2％。
(8)加样回收率：精密称取已知白藜芦醇含量的虎杖粉末6份，每份0.25g，精密加入浓度为0.4200mg·mL-1白藜芦醇对照品溶液4mL，按“(3)”所述制备方法和“(1)”所述色谱条件进行测定，计算回收率。白藜芦醇的平均回收率为103.1％，RSD为2.3％。
2、计算
1)白藜芦醇的含量计算
白藜芦醇的含量(％)＝(白藜芦醇的质量/虎杖的质量)*100％
2)浸膏得率计算
浸膏得率(％)＝(浸膏的质量/虎杖的质量)*100％
3)虎杖苷转移率计算
虎杖苷转移率(％)＝(被水解的虎杖苷的质量/虎杖药材中虎杖苷的质量)*100％
实验例1、酶种类的筛选
目前，用于提取白藜芦醇的酶主要有纤维素酶、β-葡萄糖苷酶及多种复合酶(如虎杖提取用酶)。故本试验主要比较纤维素酶、虎杖提取用酶和不加酶对白藜芦醇含量的影响。取虎杖粗粉(药材)50g，依次为不加酶、加入药材质量的0.3％的纤维素酶、加入药材质量的0.3％的虎杖提取用酶，所有样品均分别加入200mL用盐酸调pH＝5.0的盐酸水溶液，50℃水浴酶解2h，酶解后的样品进行醇提。醇提部分：将酶解后的样品均分别加入8倍量80％乙醇，50℃水浴提取2h，先粗过滤，再离心(3000r·min-1，10min)，离心后得提取液。精密吸取2mL提取液用甲醇稀释定容至10mL，摇匀，滤过，取续滤液，即得，按“(1)”项下色谱条件测定白藜芦醇的含量，计算白藜芦醇的含量；精密吸取20mL提取液至已恒重的蒸发皿中，水浴挥干，105℃烘箱烘至恒重，即得浸膏重量，计算浸膏得率。结果见表1。
表1酶种类的筛选(n＝3)
由表1可知，酶解法白藜芦醇含量及浸膏得率明显高于不加酶的样品，故选择酶解法；其次，纤维素酶比虎杖提取用酶的白藜芦醇含量和浸膏得率高，故在此试验条件下，最佳的酶种类为纤维素酶。
实验例2、酶用量的筛选
取虎杖粗粉(药材)50g，依次加入药材质量的0.1％、0.3％、0.6％、1.0％的纤维素酶，所有样品均分别加入200mL用盐酸调pH＝5.0的盐酸水溶液，50℃水浴酶解2h，酶解后的样品按实验例1中“醇提部分”处理，并按实验例1所述方法测定白藜芦醇的含量和浸膏得率，结果见表2。
表2酶用量的筛选(n＝3)
由表2可知，白藜芦醇含量和浸膏得率随着酶用量的增加先增大后下降，当酶用量为0.6％时达到最大值，故在此试验条件下，最佳的酶用量为药材质量的0.6％。
实验例3、酶解温度的筛选
取虎杖粗粉(药材)50g，加入药材质量的0.6％的纤维素酶，所有样品均分别加入200mL用盐酸调pH＝5.0的盐酸水溶液，依次分别30、40、50、60℃水浴酶解2h，酶解后的样品按实验例1中“醇提部分”处理，并按实验例1所述方法测定白藜芦醇的含量和浸膏得率，结果见表3。
表3酶解温度的筛选(n＝3)
由表3可知，白藜芦醇含量和浸膏得率随着温度的升高先增大后下降，当温度为50℃时达到最大值，故在此试验条件下，最佳的酶解温度为50℃。
实验例4、酶解pH值的筛选
取虎杖粗粉(药材)50g，加入药材质量的0.6％的纤维素酶，依次分别加入200mL用盐酸调pH＝4.0、pH＝4.5、pH＝4.8、pH＝5.0、pH＝5.5的盐酸水溶液，50℃水浴酶解2h，酶解后的样品按实验例1中“醇提部分”处理，并按实验例1所述方法测定白藜芦醇的含量和浸膏得率，结果见表4。
表4酶解pH值的筛选(n＝3)
由表4可知，白藜芦醇含量和浸膏得率随着pH值的升高先增大后下降，当pH＝5.0时达到最大值，故在此试验条件下，最佳的酶解pH＝5.0。
实验例5、酶解时间的筛选
取虎杖粗粉(药材)50g，加入药材质量的0.6％的纤维素酶，所有样品均分别加入200mL用盐酸调pH＝5.0的盐酸水溶液，依次50℃水浴酶解1、2、4、6、12、24、36、42、48h，酶解后的样品按实验例1中“醇提部分”处理，并按实验例1所述方法测定白藜芦醇的含量和浸膏得率，结果见表5。
表5酶解时间的筛选(n＝3)
由表5可知，白藜芦醇的含量随酶解时间的增加先增大后下降，浸膏得率随酶解时间的增加逐渐增大，在12h至48h时，浸膏得率变化不大，当酶解时间为36h时，白藜芦醇含量达到最大值，故在此试验条件下，最佳的酶解时间为36h。
实验例6、白藜芦醇醇提工艺的优选研究
1)醇提温度的筛选
白藜芦醇为二苯乙烯类化合物，难溶于水，易溶于乙醚、氯仿、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂。乙醇与其他有机溶剂相比较，具有安全、廉价、绿色环保的优势，结合大工业生产的实际情况，故选择乙醇作为提取溶剂。取虎杖粗粉(药材)50g，加入药材质量的0.6％的纤维素酶，所有样品均分别加入200mL用盐酸调pH＝5.0的盐酸水溶液，50℃水浴酶解36h，酶解后的样品均分别加入8倍量80％乙醇，依次50、60、70、85℃(微沸状态)提取2h，先粗过滤，再离心(3000r·min-1，10min)，得提取液。取2mL提取液用甲醇稀释定容至10mL，摇匀，滤过，取续滤液，即得，按“(1)”项下色谱条件测定白藜芦醇的含量，计算白藜芦醇的含量；精密吸取20mL提取液至已恒重的蒸发皿中，水浴挥干，105℃烘箱烘至恒重，即得浸膏重量，计算浸膏得率。结果见表6。
表6醇提温度的筛选(n＝3)
由表6可知，当醇提温度为85℃药液呈微沸状态时，白藜芦醇的含量和浸膏得率达到最大值，故在此试验条件下，最佳的醇提温度为85℃。
2)其他醇提工艺的筛选
取虎杖粗粉(药材)50g，加入药材质量的0.6％的纤维素酶，所有样品均分别加入200mL用盐酸调pH＝5.0的酸水，50℃水浴酶解36h，酶解后的样品进行醇提工艺试验研究，醇提温度为85℃。其他醇提工艺为表7所示的1～10组，不同醇提工艺后，按照实施例6“1)”中所述方法测定各组白藜芦醇的含量和浸膏得率，结果见表8。
表7其他醇提工艺
表8其他醇提工艺的筛选(n＝3)
组别 白藜芦醇平均含量(％) 平均浸膏得率(％)
1 1.412 24.53
2 1.658 28.89
3 1.742 31.08
4 1.769 29.30
5 1.529 25.57
6 1.707 28.90
7 1.773 30.13
8 1.687 26.91
9 1.777 27.85
10 1.427 22.81
结合上述白藜芦醇平均含量、平均浸膏得率和大工业生产的实际情况，得到本发明本发明提取虎杖中的白藜芦醇的最佳方法为：
(1)酶解：取虎杖粗粉(药材)50g，加入药材质量的0.6％的纤维素酶，加入200mL用盐酸调pH＝5.0的酸水，50℃水浴酶解36h，酶解后的样品进行醇提；
(2)醇提：酶解后的样品加入8倍量80％乙醇，85℃水浴提取2h，重复提取3次，合并提取液，粗过滤，再离心(3000r·min-1，10min)，离心后得提取液。
综上，本发明采用酶解法提取虎杖中的白藜芦醇，具有耗能少、高效、绿色环保、操作简便易行、生产成本低的优势，为酶解法提取虎杖中白藜芦醇的工艺产业化提供基础。

Claims (10)

1.一种虎杖中白藜芦醇的提取方法，其特征在于：它包括如下步骤：
1)酶解：取虎杖药材，加入药材质量0.1～1.0％的提取酶，按料液比1:(2～6)w/v加入pH为4.0～5.5的盐酸水溶液，30～60℃酶解1～48h；
2)醇提：酶解后样品加入8～12倍量的65～85％乙醇溶液，50～85℃提取1～3h，提取次数为1～3次，合并提取液，过滤，即得。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤1)所述提取酶为纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、虎杖提取用酶中的一种或几种的组合物；优选地，所述提取酶为纤维素酶。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤1)所述提取酶加入量为药材质量的0.6％。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤1)所述盐酸水溶液加入量为料液比1:4w/v。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤1)所述盐酸水溶液的pH为5.0。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤1)所述酶解温度为50℃。
7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤1)所述酶解时间为36h。
8.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤2)所述乙醇溶液为80％的乙醇溶液；和/或，乙醇溶液加入量为酶解后样品的8倍量。
9.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤2)所述醇提温度为85℃。
10.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤2)所述醇提时间为每次2h；和/或，所述提取次数为3次。
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