CN104341277A - 一种从虎杖中提取白藜芦醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从虎杖中提取白藜芦醇的方法。所述方法包括灭酶、一次酶解、一次提取、二次酶解、二次提取和纯化六个步骤。本发明所述方法操作简便，提取效率高，适用于生产实际。
Description
技术领域
本申请涉及一种从虎杖中提取白藜芦醇的方法。
背景技术
虎杖系蓼科属多年生草本植物，其根茎和根具有祛风利湿、散瘀定痛、止咳化痰的药效。虎杖中主要含蒽醌类和芪类化合物，其中具有芪类结构的非黄酮类多酚化合物白藜芦醇具有重要的生理活性，研究表明白藜芦醇具有抗菌、抗癌、抗炎、抗过敏、降血脂和抗氧化等多方面的药理活性，是目前研究较热门而有希望的抗癌药剂之一。
目前现有技术中常见的白藜芦醇提取的方法主要有：1. 原料中加入植物酶，将白藜芦醇苷水解为白藜芦醇，再用有机溶剂提取；2. 采用有机溶剂提取原料，浓缩得到的浸膏再加入植物酶，将白藜芦醇苷水解后用有机溶剂萃取；3. 采用有机溶剂提取原料，浓缩、除杂、精制得到白藜芦醇苷纯品，再将其水解为白藜芦醇。上述方法均各自有其利弊。
首先，现有技术中对于酶解的处理均为一步酶解，一般先进行酶解，然后提取纯化，其原理为使用纤维素酶等促进细胞破壁，从而促进白藜芦醇和白藜芦醇苷的溶出，并促进白藜芦醇苷转化为白藜芦醇；而先提取，然后提取液中加入水解酶酶解，其原理也是为促进白藜芦醇苷转化为白藜芦醇。但一步酶解存在以下弊端：使用纤维素酶破壁提取的方法因为在酶解时酶解液为水，而白藜芦醇苷不溶于水，因此，在酶解阶段纤维素酶等水解酶促进白藜芦醇苷转化为白藜芦醇的作用得不到发挥，而先提取后酶解的方法，由于在提取阶段缺少纤维素酶等水解酶的破壁作用，导致了白藜芦醇和白藜芦醇苷的溶出不足。
其次，虎杖中即存在促进白藜芦醇苷转化为白藜芦醇的水解酶，也存在促进白藜芦醇代谢的相关酶，该代谢相关酶会导致在酶解过程中白藜芦醇的分解，造成白藜芦醇的损失。一些文献中公开了使用虎杖自身酶进行酶水解的技术方案，不需要外加入水解酶。但此类技术方案必然也将导致白藜芦醇的损失。
发明内容
本申请旨在提供一种新的从虎杖中提取白藜芦醇的方法，以克服现有技术中的上述缺陷。
本发明所述方法包括以下步骤：
(1) 灭酶：将干燥虎杖粉碎至20～80目，紫外线照射40～60min；
(2) 第一次酶解：向灭酶后的虎杖粗粉中加入虎杖重量1.5～2倍的水，调节pH至4.5～5.5，加入纤维素酶，其中纤维素酶的用量为虎杖粗粉重量的0.1%～0.5%，在40～50℃下酶解3～4h，每隔30min超声处理酶解液10min，超声频率为20～100kHz，超声功率为200～300W，得酶解液I；
(3) 第一次提取：酶解液I中加入其体积3～5倍的75～95%乙醇，提取2～3次，合并提取液后过滤，滤液浓缩得到稠膏状提取物I；
(4) 第二次酶解：在稠膏状提取物I中加入其体积10～20倍的水，并加入稠膏状提取物I重量0.1%～0.5%的酶，搅拌，在40～50℃下酶解3～4h，每隔30min超声处理酶解液10min，得酶解液II；
(5) 第二次提取：酶解液II中加入其体积3～5倍的75～95%乙醇，提取2～3次，合并提取液后过滤，滤液浓缩得到稠膏状提取物II；
(6) 纯化：将稠膏状提取物II用水分散，上大孔吸附树脂，先用50℃纯净水洗至无色，再使用树脂体积1～2倍量的5%乙醇洗脱，洗脱液弃去，最后使用75～95%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液加入活性炭脱色，减压回收溶剂，得白藜芦醇粗晶体，再使用乙醇重结晶2～3次，干燥得到纯度为98%以上的白藜芦醇。
进一步地，本发明所述步骤(2)中，优选调节pH至5，纤维素酶的用量优选为虎杖粗粉重量的0.2%～0.3%。
进一步地，本发明所述步骤(4)中，所述酶为纤维素酶、β-葡萄糖苷酶或两者的混合物。
本发明技术方案首次采用紫外线灭酶，使白藜芦醇代谢相关酶分解后再进行酶解，尽可能减少白藜芦醇的损失。另外，本发明还采用了二次酶解的方法，使白藜芦醇和白藜芦醇苷最大限度地保留，以提高白藜芦醇的收率。综合本发明所述的各个步骤来看，本发明所述方法操作简便，提取效率高，适用于生产实际。
附图说明
图1为白藜芦醇标准品HPLC谱图
图2为实施例1中白藜芦醇终产物HPLC谱图。
具体实施方式
实施例1
将100g干燥虎杖粉碎至50目，紫外线照射灭酶60min。之后向虎杖粗粉中加入200g水，调节pH=5，再加入0.2g纤维素酶，在45℃下酶解4h，每隔30min超声处理酶解液10min，超声频率为80kHz，超声功率为200W，得酶解液I；向酶解液I中加入75%乙醇，提取2～3次，合并提取液后过滤，滤液浓缩得到稠膏状提取物I；向稠膏状提取物I中加入其体积10倍量的水和其质量0.2%的纤维素酶，搅拌，在45℃下酶解4h，每隔30min超声处理酶解液10min，得酶解液II；向酶解液II中加入75%乙醇，提取2～3次，合并提取液后过滤，滤液浓缩为稠膏状提取物II；使用大孔吸附树脂对稠膏状提取物II进行纯化。先用50℃纯净水洗脱至无色，再用树脂体积1～2倍量的5%乙醇洗脱，洗脱液弃去，最后使用80%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液加入活性炭脱色，减压回收溶剂，得白藜芦醇粗晶体，再使用乙醇重结晶2～3次，干燥得到纯度为98.12%的白藜芦醇1.13g。
实施例2
将500g干燥虎杖粉碎至60目，紫外线照射灭酶60min。之后向虎杖粗粉中加入1L水，调节pH=5，再加入*1.2g纤维素酶，在50℃下酶解4h，每隔30min超声处理酶解液10min，超声频率为60kHz，超声功率为300W，得酶解液I；向酶解液I中加入80%乙醇，提取2～3次，合并提取液后过滤，滤液浓缩得到稠膏状提取物I；向稠膏状提取物I中加入其体积10倍量的水和其质量0.2%的β-葡萄糖苷酶，搅拌，在50℃下酶解4h，每隔30min超声处理酶解液10min，得酶解液II；向酶解液II中加入80%乙醇，提取2～3次，合并提取液后过滤，滤液浓缩得到稠膏状提取物II；使用大孔吸附树脂对稠膏状提取物II进行纯化。先用50℃纯净水洗脱至无色，再用树脂体积1～2倍量的5%乙醇洗脱，洗脱液弃去，最后使用80%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液加入活性炭脱色，减压回收溶剂，得白藜芦醇粗晶体，再使用乙醇重结晶2～3次，干燥得到纯度为98.30%的白藜芦醇6.05g。
实施例3
将5000g干燥虎杖粉碎至60目，紫外线照射灭酶60min。之后向虎杖粗粉中加入8.5L水，调节pH=5，再加入12g纤维素酶，在50℃下酶解4h，每隔30min超声处理酶解液10min，超声频率为80kHz，超声功率为200W，得酶解液I；向酶解液I中加入90%乙醇，提取2～3次，合并提取液后过滤，滤液浓缩得到稠膏状提取物I；向该稠膏状提取物中加入其体积10倍量的水，再加入其质量0.3%的β-葡萄糖苷酶和纤维素酶的混合物（其中β-葡萄糖苷酶与纤维素酶质量之比为2:1），搅拌，在45℃下酶解4h，每隔30min超声处理酶解液10min，得酶解液II；向酶解液II中加入90%乙醇，提取2～3次，合并提取液后过滤，滤液浓缩得到稠膏状提取物II；使用大孔吸附树脂对稠膏状提取物II进行纯化。先用50℃纯净水洗脱至无色，再用树脂体积1～2倍量的5%乙醇洗脱，洗脱液弃去，最后使用95%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液加入活性炭脱色，减压回收溶剂，得白藜芦醇粗晶体，再使用乙醇重结晶2～3次，干燥得到纯度为98.41%的白藜芦醇58.52g。
Claims (3)
1.一种从虎杖中提取白藜芦醇的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1) 灭酶：将干燥虎杖粉碎至20～80目，紫外线照射40～60min；
(2) 第一次酶解：向灭酶后的虎杖粗粉中加入虎杖重量1.5～2倍的水，调节pH至4.5～5.5，加入纤维素酶，其中纤维素酶的用量为虎杖粗粉重量的0.1%～0.5%，在40～50℃下酶解3～4h，每隔30min超声处理酶解液10min，超声频率为20～100kHz，超声功率为200～300W，得酶解液I；
(3) 第一次提取：酶解液I中加入其体积3～5倍的75～95%乙醇，提取2～3次，合并提取液后过滤，滤液浓缩得到稠膏状提取物I；
(4) 第二次酶解：在稠膏状提取物I中加入其体积10～20倍的水，并加入稠膏状提取物I重量0.1%～0.5%的酶，搅拌，在40～50℃下酶解3～4h，每隔30min超声处理酶解液10min，得酶解液II；
(5) 第二次提取：酶解液II中加入其体积3～5倍的75～95%乙醇，提取2～3次，合并提取液后过滤，滤液浓缩得到稠膏状提取物II；
(6) 纯化：将稠膏状提取物II用水分散，上大孔吸附树脂，先用50℃纯净水洗至无色，再使用树脂体积1～2倍量的5%乙醇洗脱，洗脱液弃去，最后使用75～95%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液加入活性炭脱色，减压回收溶剂，得白藜芦醇粗晶体，再使用乙醇重结晶2～3次，干燥得到纯度为98%以上的白藜芦醇。
2.如权利要求1所述的一种从虎杖中提取白藜芦醇的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，调节pH至5，纤维素酶的用量为虎杖粗粉重量的0.2%～0.3%。
3.如权利要求1或2所述的一种从虎杖中提取白藜芦醇的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，所述酶为纤维素酶、β-葡萄糖苷酶或两者的混合物。
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