CN114010528B

CN114010528B - 一种重组人源胶原蛋白冻干粉及其制备方法

Info

Publication number: CN114010528B
Application number: CN202111564328.2A
Authority: CN
Inventors: 薛永永; 雷登凤; 高合意; 曾飒; 刘岸洪; 汤杰
Original assignee: Guangzhou Ridgepole Biological Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Ridgepole Biological Technology Co ltd
Priority date: 2021-12-20
Filing date: 2021-12-20
Publication date: 2023-09-15
Anticipated expiration: 2041-12-20
Also published as: CN114010528A

Abstract

本发明涉及一种重组人源胶原蛋白冻干粉及其制备方法。所述重组人源胶原蛋白冻干粉包括重组人源胶原蛋白、稳定剂、辅助剂和缓冲剂，所述缓冲剂包括EDTA‑2Na、牛血清白蛋白、磷酸盐、氯化钠和吐温80。其中稳定剂、辅助剂和缓冲剂均起到维持重组人源胶原蛋白的稳定性的作用，特别地，EDTA‑2Na、牛血清白蛋白、磷酸盐、氯化钠和吐温80各组分相互配合，协同增效，显著提高了重组人源胶原蛋白的稳定性，使其生物学活性可以长期保持。利用本发明提供的重组人源胶原蛋白冻干粉可常温保藏12个月同时保持其良好的生物学活性，能够显著促进细胞增殖与迁移，具有改善皮肤红值，减少皮肤的经皮水分流失，修复受损的皮肤屏障的效果。

Description

一种重组人源胶原蛋白冻干粉及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种重组人源胶原蛋白冻干粉及其制备方法。

背景技术

胶原蛋白是生物高分子，动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％-30％，某些生物体甚至高达80％以上。胶原蛋白因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，因此在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用。但是胶原蛋白在临床应用中还存在许多问题，主要障碍是所用胶原的来源，来源于动物或者人体的胶原蛋白主要缺点是可能会传播疾病，过敏反应，病原体污染等。因此，制备一种能等效且安全替代胶原蛋白的重组人源胶原蛋白是目前亟待完成的任务。

重组人源胶原蛋白结构跟人体来源的胶原蛋白一模一样，同时在此基础上进行优化，提高胶原蛋白的亲水性以及活性。并且其含有丰富的亲水基团，具有良好的成膜性，保持皮肤角质层水分。另一方面可以增加成纤维细胞的粘附和增殖，补充伤口创面的胶原蛋白并促进其沉积，降低瘢痕的发生几率。它的趋向性引导作用可引导上皮细胞快速进入受损部位，有效提高皮肤再生速度，缩短创伤愈合时间，从而恢复皮肤屏障功能。

例如CN104667335公开了一种重组人源蛋白用于皮肤屏障功能损伤的医用皮肤胶原修复再生功能敷料，该敷料包括重组人源胶原蛋白、透明质酸钠、甘油、凡士林等，对于皮炎湿疹患者具有较好的治愈率。

CN106902381公开了一种重组人源胶原蛋白原液，该重组人源胶原蛋白原液由重组人源胶原蛋白、黄原胶、乳酸钠、苯甲酸钠、透明质酸钠、甘油等组成。该重组人源胶原蛋白原液具有良好的安全性和一定的促新陈代谢作用，可使用在医美产品中。

虽然重组人源胶原蛋白这一重要的功能性因子在护肤产品领域有着广阔的应用前景，但是由于重组人源胶原蛋白本身是蛋白质类生物大分子，其稳定性差，生物学活性难以长期保持，从而导致其护肤效果不持久。

因此如何开发一种稳定性好，护肤效果持久的重组人源胶原蛋白冻干粉成为了本领域目前迫切需要解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种重组人源胶原蛋白冻干粉及其制备方法。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种重组人源胶原蛋白冻干粉，所述重组人源胶原蛋白冻干粉包括重组人源胶原蛋白、稳定剂、辅助剂和缓冲剂，所述缓冲剂包括EDTA-2Na、牛血清白蛋白、磷酸盐、氯化钠和吐温80。

本发明创造性地将牛血清白蛋白、吐温-80、NaCl、磷酸盐和EDTA-2Na进行组合成为缓冲剂，各组分相互配合，使冻干前的混合液能保持稳定，防止重组人源胶原蛋白的析出，在促进冻干粉中重组人源胶原蛋白的活性保持方面具有显著地的协同增效作用。所述重组人源胶原蛋白冻干粉可常温保藏12个月同时保持其良好的生物学活性，能够显著促进细胞增殖与迁移，具有改善皮肤红值，减少皮肤的经皮水分流失，修复受损的皮肤屏障的效果。

优选地，所述重组人源胶原蛋白冻干粉以质量份数计包括重组人源胶原蛋白1-4份、稳定剂40-120份、辅助剂1-10份和缓冲剂20-100份。

上述1-4份中的具体数值可选择1份、1.2份、1.5份、1.7份、2份、2.2份、2.5份、2.7份、3份、3.2份、3.5份、3.7份、4份等。

上述40-120份中的具体数值可选择40份、45份、50份、55份、60份、65份、70份、75份、80份、85份、90份、95份、100份、105份、110份、115份、120份等。

上述1-10份中的具体数值可选择1份、2份、3份、4份、5份、6份、7份、8份、9份、10份等。

上述20-100份中的具体数值可选择20份、25份、30份、35份、40份、45份、50份、55份、60份、65份、70份、75份、80份、85份、90份、95份、100份等。

上述各项数值范围内的其他具体点值均可任意选择。

优选地，所述稳定剂包括蔗糖、甘氨酸、甘露糖醇、葡萄糖、葡聚糖、麦芽糖、果糖或海藻糖中的任意一种或至少两种的组合。

所述至少两种的组合例如蔗糖和甘氨酸的组合、甘露糖醇和葡萄糖的组合、葡萄糖和葡聚糖的组合等，其他任意的组合方式均可选择，优选甘露糖醇、海藻糖和葡聚糖的组合。

以甘露糖醇、海藻糖和葡聚糖作为稳定剂，三者相互配合，协同增效，进一步促进了冻干粉中重组人源胶原蛋白活性的长期保持。

优选地，所述辅助剂包括透明质酸、透明质酸钠、尿囊素、神经酰胺、黄原胶、甘油中的任意一种或至少两种的组合。

所述至少两种的组合例如透明质酸和透明质酸钠的组合、尿囊素和黄原胶的组合、神经酰胺和黄原胶的组合等，其他任意的组合方式均可选择，优选透明质酸、神经酰胺和黄原胶的组合。

与其他选择相比，以透明质酸、神经酰胺和黄原胶作为辅助剂，具有良好的保湿增稠的效果，进一步促进了重组人源胶原蛋白活性的长期保持，并有助于增强冻干粉改善肌肤的效果。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的重组人源胶原蛋白冻干粉的制备方法，所述重组人源胶原蛋白冻干粉的制备方法包括将重组人源胶原蛋白、牛血清白蛋白、稳定剂、辅助剂和缓冲溶液混合，冻干，得到所述重组人源胶原蛋白冻干粉；

所述缓冲溶液包括EDTA-2Na、牛血清白蛋白、磷酸盐缓冲溶液、氯化钠和吐温80。

优选地，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为15-25mM，例如15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM等，该数值范围内的其他具体点值均可任意选择。

优选地，所述氯化钠在缓冲溶液中的浓度为0.15-0.25M，例如0.15M、0.16M、0.17M、0.18M、0.19M、0.2M、0.21M、0.22M、0.23M、0.24M、0.25M等，该数值范围内的其他具体点值均可任意选择。

优选地，所述牛血清白蛋白在缓冲溶液中的质量百分含量为0.03-0.08％，例如0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％等，该数值范围内的其他具体点值均可任意选择。

优选地，所述吐温80在缓冲溶液中的质量百分含量为0.03-0.08％，例如0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％等，该数值范围内的其他具体点值均可任意选择。

优选地，所述缓冲溶液的pH范围为5.7-6.3，例如5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3等，该数值范围内的其他具体点值均可任意选择。

当缓冲溶液中各组分的浓度以及溶液pH在上述范围内时，缓冲溶液对重组人源胶原蛋白的保护效果更好，更利于重组人源胶原蛋白活性的长期保持。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供一种重组人源胶原蛋白冻干粉，所述重组人源胶原蛋白冻干粉包括重组人源胶原蛋白、稳定剂、辅助剂和缓冲剂，所述缓冲剂包括EDTA-2Na、牛血清白蛋白、磷酸盐、氯化钠和吐温80。其中稳定剂使重组人源胶原蛋白能稳定存在于多糖中，保证冻干粉成型和活性因子的维持，若稳定剂搭配不当或者不添加稳定剂，会导致粉末形态塌陷。辅助剂和缓冲剂也均起到维持重组人源胶原蛋白的稳定性的作用。特别地，缓冲剂中的牛血清白蛋白、吐温-80、NaCl、磷酸盐和EDTA-2Na各组分相互配合，使冻干前的混合液能保持稳定，防止重组人源胶原蛋白的析出，各组分在促进冻干粉中重组人源胶原蛋白的活性保持方面具有显著地的协同增效作用。此外，以海藻糖、甘露糖醇和葡聚糖的组合作为稳定剂，三者相互配合，协同增效，进一步促进了冻干粉中重组人源胶原蛋白活性的长期保持。利用本发明提供的方法制备得到的重组人源胶原蛋白冻干粉可常温保藏12个月同时保持其良好的生物学活性，能够显著提高细胞活力，显著促进细胞增殖与迁移，具有改善皮肤红值，减少皮肤的经皮水分流失，修复受损的皮肤屏障的效果。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

下述实施例、对比例中涉及的重组人源胶原蛋白的制备方法为：

在发酵罐中配制培养基并灭菌，培养基配方为胰蛋白胨25g/L、酵母粉25g/L、葡萄糖2g/L、椰油1g/L、氯化钠5g/L、硫酸镁1g/L、硫酸铵0.5g/L、氯化钙0.02g/L和10mmol/LPB。将保藏在甘油管中的大肠杆菌工程菌体BL21(DE3)/pET28a(+)/Recombinant humancollagen(实验室构建保存)在含有卡那霉素的平板划线，挑取单菌落摇瓶培养，以5％接种量接种到种子罐扩大培养制备种子液，以5％接种量将种子液在上述培养基中发酵，培养条件为pH 6.8、通氧量40％、温度37℃，当长至对数生长中期时，调pH至7.2、通氧量降至30％、温度降至35℃，使用终浓度为0.4mmol/L的IPTG诱导4h，得发酵液。以40L/h的速度、15000rpm的转速、在4℃下离心，收集沉淀，900bar高压破碎菌体3次，以14000rpm的转速在4℃下离心40min，收集上清液，过0.45μm膜，得目的蛋白，依次过Ni-NTA柱和G25柱纯化后，即得。

下述实施例、对比例中涉及的冻干粉组分“缓冲剂”是指冻干粉的制备方法中所述的“缓冲溶液”经冻干除去水分后剩余的成分。

实施例1

本实施例提供一种重组人源胶原蛋白冻干粉，其制备方法如下：

将重组人源胶原蛋白2重量份、稳定剂、辅助剂与缓冲溶液混合均匀，冻干，即得重组人源胶原蛋白冻干粉。

稳定剂为：海藻糖10重量份、甘露糖醇40重量份和葡聚糖10重量份。

辅助剂为：透明质酸1重量份、黄原胶0.8重量份、尿囊素0.2重量份。

缓冲溶液为：牛血清白蛋白0.05wt％、EDTA-2Na 2mM、NaCl 0.2M、吐温-800.05wt％、20mM PBS，pH 6.0。

实施例2

稳定剂为：海藻糖20重量份、甘露糖醇30重量份和葡聚糖10重量份。

辅助剂为：透明质酸1重量份和黄原胶0.8重量份。

缓冲溶液为：牛血清白蛋白0.03wt％、EDTA-2Na 1.5mM、NaCl 0.25M、吐温-800.08wt％、15mM PBS，pH 6.3。

实施例3

辅助剂为：黄原胶0.8重量份和甘油1重量份。

缓冲溶液为：牛血清白蛋白0.08wt％、EDTA-2Na 2.5mM、NaCl 0.15M、吐温-800.03wt％、25mM PBS，pH 5.7。

实施例4

本实施例提供一种重组人源胶原蛋白冻干粉，其制备方法与实施例1的区别仅在于将稳定剂“海藻糖10份、甘露糖醇40份、葡聚糖10份”替换为“海藻糖30份、葡聚糖30份”，其他参照实施例1。

实施例5

本实施例提供一种重组人源胶原蛋白冻干粉，其制备方法与实施例1的区别仅在于将稳定剂“海藻糖10份、甘露糖醇40份、葡聚糖10份”替换为“甘露糖醇48份、葡聚糖12份”，其他参照实施例1。

实施例6

本实施例提供一种重组人源胶原蛋白冻干粉，其制备方法与实施例1的区别仅在于将稳定剂“海藻糖10份、甘露糖醇40份、葡聚糖10份”替换为“海藻糖12份、甘露糖醇48份”，其他参照实施例1。

实施例7

本实施例提供一种重组人源胶原蛋白冻干粉，其制备方法与实施例1的区别仅在于将稳定剂“海藻糖10份、甘露糖醇40份、葡聚糖10份”替换为“海藻糖60份”，其他参照实施例1。

实施例8

本实施例提供一种重组人源胶原蛋白冻干粉，其制备方法与实施例1的区别仅在于将稳定剂“海藻糖10份、甘露糖醇40份、葡聚糖10份”替换为“甘露糖醇60份”，其他参照实施例1。

实施例9

本实施例提供一种重组人源胶原蛋白冻干粉，其制备方法与实施例1的区别仅在于将稳定剂“海藻糖10份、甘露糖醇40份、葡聚糖10份”替换为“葡聚糖60份”，其他参照实施例1。

对比例1

本对比例提供一种重组人源胶原蛋白冻干粉，其制备方法与实施例1的区别仅在于不添加稳定剂，即不添加海藻糖、甘露糖醇和葡聚糖，缺少的量用缓冲溶液补足，其他参照实施例1。

对比例2

本对比例提供一种重组人源胶原蛋白冻干粉，其制备方法与实施例1的区别仅在于不添加辅助剂，即不添加透明质酸、黄原胶和尿囊素，缺少的量用缓冲溶液补足，其他参照实施例1。

对比例3

本对比例提供一种重组人源胶原蛋白冻干粉，其制备方法与实施例1的区别仅在于缓冲溶液中缺少牛血清白蛋白，缺少的量用水补足，其他参照实施例1。

对比例4

本对比例提供一种重组人源胶原蛋白冻干粉，其制备方法与实施例1的区别仅在于缓冲溶液中缺少EDTA-2Na，缺少的量用水补足，其他参照实施例1。

对比例5

本对比例提供一种重组人源胶原蛋白冻干粉，其与实施例1的区别仅在于缓冲溶液中缺少吐温-80，缺少的量用水补足，其他参照实施例1。

对比例6

本对比例提供一种重组人源胶原蛋白冻干粉，其制备方法与实施例1的区别仅在于缓冲溶液中缺少磷酸盐，缺少的量用水补足，其他参照实施例1。

对比例7

本对比例提供一种重组人源胶原蛋白冻干粉，其制备方法与实施例1的区别仅在于缓冲溶液中缺少NaCl，缺少的量用水补足，其他参照实施例1。

对比例8

本对比例提供一种重组人源胶原蛋白冻干粉，其制备方法与实施例1的区别仅在于缓冲溶液中同时缺少“牛血清白蛋白、EDTA-2Na、NaCl和吐温-80”，缺少的量用水补足，其他参照实施例1。

对比例9

本对比例提供一种重组人源胶原蛋白冻干粉，其制备方法与实施例1的区别仅在于缓冲溶液中同时缺少“牛血清白蛋白、EDTA-2Na、磷酸盐和吐温-80”，缺少的量用水补足，

对比例10

本对比例提供一种重组人源胶原蛋白冻干粉，其制备方法与实施例1的区别仅在于缓冲溶液中同时缺少“牛血清白蛋白、NaCl、磷酸盐和吐温-80”，缺少的量用水补足，其他参照实施例1。

对比例11

本对比例提供一种重组人源胶原蛋白冻干粉，其制备方法与实施例1的区别仅在于缓冲溶液中同时缺少“牛血清白蛋白、NaCl、磷酸盐和EDTA-2Na”，缺少的量用水补足，其他参照实施例1。

对比例12

本对比例提供一种重组人源胶原蛋白冻干粉，其制备方法与实施例1的区别仅在于缓冲溶液中同时缺少“吐温-80、NaCl、磷酸盐和EDTA-2Na”，缺少的量用水补足，其他参照实施例1。

测试例1

评估实施例1-9和对比例1-12的重组人源胶原蛋白冻干粉在常温放置12个月后对细胞增殖和迁移的影响，从而反映重组人源胶原蛋白冻干粉的生物活性的保持能力，测试方法如下：

分别将实施例1-9和对比例1-12的重组人源胶原蛋白冻干粉常温放置12个月后，加入等量的水复溶后，分别取1mL加入到培养基中，混合均匀，即得含有重组人源胶原蛋白冻干粉的培养基。

(1)对细胞增殖的影响：

取生长状态良好的HaCaT/3T3细胞铺96孔板培养17h后，更换无血清的基础培养基培养7h后，弃去旧培养基，加入配置好的含有重组人源胶原蛋白冻干粉的培养基，空白组的培养基中不含重组人源胶原蛋白冻干粉，但含有与实施例1等量的牛血清白蛋白。培养48h后用CCK8法检测OD₄₅₀和OD₆₃₀值，得出受试样品对HaCaT/3T3细胞活力的影响，从而得出受试样品对细胞增殖的影响。

细胞活力(指细胞增殖的活力)的计算方法为：

A1：具有细胞、CCK8溶液和重组人源胶原蛋白的孔的吸光度；

A2：具有细胞和CCK8溶液，而没有重组人源胶原蛋白的孔吸光度；

A0：具有培养基和CCK8溶液，而没有细胞和重组人源胶原蛋白的孔的吸光度。

(2)对细胞迁移的影响：

取生长状态良好的HaCaT/3T3细胞铺24孔板培养17h后，更换无血清的基础培养基培养7h后，弃去旧培养基，使用10μL枪头划线，之后加入配置好的含有重组人源胶原蛋白冻干粉的培养基，空白组的培养基中不含重组人源胶原蛋白冻干粉，但含有与实施例1等量的牛血清白蛋白。分别于开始培养时、培养48h后进行拍照计数，得出受试样品对HaCaT/3T3细胞迁移的影响。

测定细胞迁移距离：采用Image J软件测量各定点划痕面积。

结果见表1。

表1

结果显示：实施例1-9的重组人源胶原蛋白冻干粉在12个月后均能提高HaCaT和3T3细胞活力，促进HaCaT和3T3细胞增殖与迁移，说明采用本发明方法制得的冻干粉中重组人源胶原蛋白的活性保持时间长。对比例1-2的冻干粉的重组人源胶原蛋白活性较不易长期保持，说明在制备冻干粉时添加稳定剂与辅助剂，有利于冻干粉中重组人源胶原蛋白活性的长期保持。实施例4-9的冻干粉在重组人源胶原蛋白活性保持方面相较于实施例1较差，说明海藻糖、甘露糖醇和葡聚糖这三种稳定剂相互配合，在促进冻干粉中重组人源胶原蛋白的活性保持方面比任意单一组分或任意两者的组合的效果更好，证明了三者的协同增效作用。对比例3-12的冻干粉在重组人源胶原蛋白活性的活性保持方面相较于实施例1较差，说明制备冻干粉时使用的缓冲溶液中的牛血清白蛋白、吐温-80、NaCl、磷酸盐和EDTA-2Na各组分相互配合，使冻干前的混合液能保持稳定，防止重组人源胶原蛋白的析出，各组分在促进冻干粉中重组人源胶原蛋白的活性保持方面比任意单一组分或任意四者的组合的效果更好，证明了五种组分的协同增效作用。

测试例2

对实施例1-9的重组人源胶原蛋白冻干粉进行安全性评估，方法如下：

选取符合要求的社会志愿者90名，年龄20-45岁，随机分为9组，每组10名，按组分别试用实施例1-9的重组人源胶原蛋白冻干粉(用生理盐水溶解成5mg/mL溶液)，分别取受试样品溶液0.020-0.025mL，放入斑试器小室内，对照孔不做任何处理。将加有受试物的斑试器用低致敏胶带贴敷于受试者的背部或前臂由侧，用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，持续48h。分别于去除受试物斑器后30min(待压痕消失后)和48h按表2标准观察皮肤反应。

表2

结果显示：本发明的实施例1-9都是阴性反应，说明本发明所涉及的冻干粉产品安全性有保证，不会产生皮肤刺激性、致敏性(易过敏人群或对本品过敏的人群除外)等不良反应。

测试例3

对放置12个月后的实施例1的重组人源胶原蛋白冻干粉对皮肤的保湿效果和炎症修复效果进行评价，方法如下：

选取34名志愿者，皮肤状况为因过敏、晒伤或有炎症而泛红，年龄20-45岁，随机分为2组，每组17人，其中第1组为对照组，不使用受试产品。第2组试用放置12个月后的实施例1的重组人源胶原蛋白冻干粉(用生理盐水溶解成5mg/mL的冻干粉溶液)，每人每天使用等量的冻干粉溶液，早晚各一次，分别于使用前和使用4周后测试皮肤经皮水分流失值(皮肤水分流失测试仪，德国C&K,Tewameter TM300)和皮肤红值(皮肤颜色测试探头，德国C&K,Colorimeter CL400)。测试结果见表3(所有志愿者在测试期间均不使用其他护肤产品)。

表3

结果显示：实施例1的重组人源胶原蛋白冻干粉在12个月后仍具有较好的肌肤保湿和炎症修复的效果，说明本发明制得的冻干粉中重组人源胶原蛋白的活性保持时间长，护肤效果持久，具有重要的应用价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种重组人源胶原蛋白冻干粉及其制备方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims

1.一种重组人源胶原蛋白冻干粉，其特征在于，所述重组人源胶原蛋白冻干粉以质量份数计由重组人源胶原蛋白1-4份、稳定剂40-120份、辅助剂1-10份和缓冲剂20-100份组成；

所述稳定剂为甘露糖醇、海藻糖和葡聚糖的组合；

所述稳定剂中甘露糖醇、海藻糖与葡聚糖的质量比为(3-4):(1-2):1；

所述缓冲剂由EDTA-2Na、牛血清白蛋白、磷酸盐、氯化钠和吐温80组成。

2.如权利要求1所述的重组人源胶原蛋白冻干粉，其特征在于，所述辅助剂包括透明质酸、透明质酸钠、尿囊素、神经酰胺、黄原胶、甘油中的任意一种或至少两种的组合。

3.如权利要求2所述的重组人源胶原蛋白冻干粉，其特征在于，所述辅助剂包括透明质酸、尿囊素和黄原胶的组合。

4.一种如权利要求1-3中任一项所述的重组人源胶原蛋白冻干粉的制备方法，其特征在于，所述重组人源胶原蛋白冻干粉的制备方法包括将重组人源胶原蛋白、稳定剂、辅助剂与缓冲溶液混合，冻干，得到所述重组人源胶原蛋白冻干粉；

所述缓冲溶液由EDTA-2Na、牛血清白蛋白、磷酸盐缓冲溶液、氯化钠和吐温80组成。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为15-25mM。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述氯化钠在缓冲溶液中的浓度为0.15-0.25M。

7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述EDTA-2Na在缓冲溶液中的浓度为1-5mM。

8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述EDTA-2Na在缓冲溶液中的浓度为1.5-2.5mM。

9.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述牛血清白蛋白在缓冲溶液中的质量百分含量为0.03-0.08％。

10.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述吐温80在缓冲溶液中的质量百分含量为0.03-0.08％。

11.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液的pH范围为5.7-6.3。