CN113945652A - 一种高柱效附聚型离子色谱固定相的装填方法 - Google Patents
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Abstract
一种高柱效附聚型离子色谱固定相的装填方法：将固体填料在匀浆液中分散，超声，得到浆料；将所得浆料倒入匀浆罐，匀浆罐与色谱柱柱管连接，顶替液在液相高压泵的作用下进入匀浆罐，匀浆罐中的浆料在顶替液及重力的作用下被压入色谱柱柱管中，当顶替液流出色谱柱时，装填结束；之后，减小液相高压泵的压力，卸下色谱柱并进行冲洗以除去柱内杂质；本发明开发了一种分离7种常见阴离子的附聚型离子色谱固定相的装填方法，这种方法具有柱效高、峰形好的优点；本发明系统地探究了顶替液类型、装柱温度、装柱的梯度流速对于色谱柱柱效和背景压力的影响，这种固定相装填方法具有良好的重现性，这也为同种类型的聚附固定相填料的装填提供参考。
Description
技术领域
本发明涉及一种高柱效附聚型离子色谱固定相的装填方法。
背景技术
离子色谱法是一种广泛应用于检测无机离子、有机酸、胺类和糖类的方法。固定相是分离待测物质的主要场所，是离子色谱的核心组成部分。固定相填料是影响离子交换色谱分离性能的首要因素。然而，固定相填料装填技术对离子交换色谱分离性能也十分重要。填料装填技术会影响固定相色谱峰的峰形，不恰当的装填技术会产生不对称、峰形较宽或分裂的峰，降低分离度。因此，色谱固定相装填的方法成为近几年的热点研究。
常用的装填技术分为干法装柱和湿法装柱。干法装柱起初在气相色谱填充柱中使用较多，一般适合装填粒径大于20μm的大粒径填料。但干法装柱形成的床层结构疏松散乱会导致柱效降低，因此，干法装柱应用不多。采用湿法装柱能更好地发挥小颗粒基质在柱效方面的优势。随着粒径的减少，基质会因为静电作用产生聚集，悬浮基质在高压下被压入柱管中。实验发现湿法装柱相比于干法装柱显著提高了柱效。
湿法装柱可以分为三种方法：等密度法、高粘度法、低粘度法。前两种方法在早期使用较多，主要是因为早期填料基质粒径分布较大，如果浆液在色谱柱填充操作期间未保持颗粒完全悬浮，则填料的粒径会在整个色谱柱横截面上呈轴向变化，从而导致出现峰拖尾、柱效降低的现象。而现代色谱填料粒径分布较窄，一般使用低粘度浆料进行高压匀浆装柱。
因此开发一种使用低粘度浆料进行高压匀浆湿法装柱，且对于7种常规阴离子(F-、Cl-、NO2-、Br-、NO3-、PO43-、SO42-)具有高柱效，良好峰形的方法是十分有必要的。
发明内容
本发明目的是在高柱效附聚型离子色谱固定相的合成基础上，提供一种高柱效附聚型离子色谱固定相的装填方法，并探究了顶替液类型、装柱温度、装柱的梯度流速对于色谱柱柱效和背景压力的影响。
本发明的技术方案如下：
一种高柱效附聚型离子色谱固定相的装填方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将固体填料在匀浆液中分散，超声(5min)，得到浆料；
所述匀浆液的体积用量以固体填料的质量计为20～30mL/g；
所述固体填料为改性的PS-DVB微球；
所述匀浆液为改性的PS-DVB微球与水质量比1：20～30的混合液；
(2)将所得浆料倒入匀浆罐，匀浆罐与色谱柱柱管连接，顶替液在液相高压泵的作用下进入匀浆罐，匀浆罐中的浆料在顶替液及重力的作用下被压入色谱柱柱管中，当顶替液流出色谱柱时，装填结束；
所述顶替液选自去离子水、0.5～2mmol/L Al3+溶液或2mmol/L Na+溶液，优选去离子水；所述Al3+溶液由十二水合硫酸铝溶于去离子水中得到；所述Na+溶液由碳酸钠溶于去离子水中得到；
装填过程中，控制温度在10～80℃，优选20～30℃；
顶替液在0.7～3.5mL/min(优选2.1～2.8mL/min)的初始流速下装柱30min，之后通过调节液相高压泵的流量调节装柱压力为20MPa，在20MPa的压力下巩固色谱柱床层；
(3)装填结束之后，减小液相高压泵的压力，卸下色谱柱并进行冲洗以除去柱内杂质；
所述冲洗的方法为：用碳酸钠和碳酸氢钠的混合水溶液(其中碳酸钠、碳酸氢钠的浓度均为2mmol/L)为流动相，在流速为1mL/min的条件下，冲洗平衡6h以除去柱内杂质。
本发明具有如下优点：
1、开发了一种分离7种常见阴离子的附聚型离子色谱固定相的装填方法，这种方法具有柱效高、峰形好的优点，且具有良好的重现性。
2、系统地探究了顶替液类型、装柱温度、装柱的梯度流速对于色谱柱柱效和背景压力的影响，这种固定相装填方法具有良好的重现性，这也为同种类型的聚附固定相填料的装填提供参考。
附图说明
图1为高压匀浆湿法装柱示意图。
图2为不同顶替液装填色谱柱，对7种常见阴离子的色谱分离谱图；(a)Na+溶液为顶替液装填的固定相对7种常见阴离子的色谱分离图；(b)去离子水为顶替液的固定相对7种常见阴离子的色谱分离图；(c)Al3+溶液为顶替液装填的固定相对7种常见阴离子的色谱分离图；(1)氟离子；(2)氯离子；(3)亚硝酸根；(4)溴离子；(5)硝酸根；(6)磷酸根；(7)硫酸根。
图3为色谱柱装填不同温度(10℃、30℃、50℃、80℃)对色谱柱柱效(以SO4 2-计算)及背景压力的影响图。
图4为色谱柱装填不同初速度(0.7mL/min、1.4mL/min、2.1mL/min、2.8mL/min、3.5mL/min)对于色谱柱柱效(以SO4 2-计算)与背景压力的影响图。
图5为不同流动相配比及流速下，对7种常见阴离子的色谱分离谱图；(a)流动相：2.0mmol/L碳酸钠和2.0mmol/L碳酸氢钠；流速：1.0mL/min；抑制电流：25mA；(b)流动相：2.0mmol/L碳酸钠和2.0mmol/L碳酸氢钠；流速：1.6mL/min；抑制电流：35mA；(c)流动相：2.5mmol/L碳酸钠和2.0mmol/L碳酸氢钠；流速：2.0mL/min；抑制电流：45mA。
图6为7种常规阴离子混合标准液进行了100次分离测试，并每隔四针选取一针进样结果进行色谱图的叠加绘制。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步描述本发明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
高压匀浆湿法装柱示意图如图1所示，具体步骤如下：
将2.5g固体填料在60mL匀浆液中分散形成稀匀浆，超声5min后倒入匀浆罐。将匀浆罐接入流路，顶替液在液相高压泵的作用下进入流路，在顶替液及重力的作用下固体填料被压入色谱柱柱管(不锈钢柱，150×4.6mm)中，通过调节高压泵的流量调节装柱压力为20MPa，当顶替液流出体积为500mL时色谱柱装填结束。装填结束之后在30min内缓慢减小高压泵的压力。卸下色谱柱后用2.0mmol/L碳酸钠和2.0mmol/L碳酸氢钠的混合水溶液为流动相，在流速为1mL/min的条件下，冲洗平衡6h以除去柱内杂质。
其中，固体填料为改性的PS-DVB微球；PS-DVB微球是商购，厂家：苏州纳微科技有限公司；规格：10μm，
批号：H01M31RE；匀浆液由2.5g改性的PS-DVB微球溶于60ml水得到；
PS-DVB微球的改性方法如下：
①以甲胺与BDDE为原料制备阳离子聚电解质，其制备过程如下：在250mL的三口烧瓶中加入40mL 10％的BDDE溶液，水浴升温至60℃，用恒压漏斗滴加40mL 4％的甲胺溶液，滴加完成后自然冷却至室温。冷却完成后将制备的阳离子聚电解质以5000rpm的转速离心5min，弃去沉淀后备用。
②取2.5g的PS-DVB微球置于250mL的三口烧瓶中，加入15mL的冰醋酸润湿PS-DVB微球并搅拌10min，在30℃下加入3mL二氯甲烷溶胀搅拌30min，再缓慢滴加7mL浓硫酸，搅拌3min后将反应液倒入1mol/L冰稀硫酸中猝灭磺化反应。用G3漏斗过滤微球，将磺化微球用去离子水反复清洗至过滤液为中性。
③将微球超声分散于100mL的去离子水中，水浴至40℃后倒入80mL阳离子聚电解质，恒温搅拌附聚24h后过滤并使用去离子水洗涤至过滤液呈中性。
④将过滤后的微球超声分散于100mL去离子水中倒入250mL三口烧瓶，水热至60℃倒入20mL 10％BDDE水溶液反应30min后过滤，将微球重新分散于100mL去离子水后倒入250mL三口烧瓶，水浴至60℃后倒入20mL 4％甲胺水溶液，反应30min后过滤洗涤得到接枝一次的固定相。
⑤重复步骤④，接枝两次。
实施例1不同顶替液类型对于色谱柱柱效和背景压力的影响考察
称量1.1163g、0.8372g、0.5581g、0.2791g的十二水合硫酸铝分别定容至1L容量瓶中，得到2mmol/L、1.5mmol/L、1.0mmol/L、0.5mmol/L Al3+溶液。
称量0.21198g的碳酸钠定容至1L容量瓶中，得到2mmol/L Na+溶液。
以Al3+溶液为顶替液，起初使用2.0mmol/L的浓度，随着装填的进行，色谱柱压逐渐加大，因而不得不减小高压泵的流量，在装柱30min后，即使流量已经减小至1mL/min，系统仍然能够维持在20MPa的压力。减小Al3+溶液的浓度(1.5mmol/L、1.0mmol/L)所装填的色谱柱也因为压力过大而不能在离子色谱仪上使用。因此后续使用更小浓度的Al3+溶液(0.5mmol/L)完成了色谱柱的装填。在使用碳酸盐溶液冲洗除去柱内杂质时，碳酸盐溶液冲洗出Al3+后，色谱柱柱压在30min内由7.6MPa降至3.6MPa，后续色谱柱压达到稳定状态不再变化。
在以Na+溶液为顶替液时，实验使用了2.0mmol/L的碳酸钠溶液进行装柱。
使用Na+溶液、Al3+溶液、去离子水为顶替液所装填的色谱柱，通过分离7种常见阴离子的混合标准溶液，进行分离性能测试。
所有色谱性能测试均为同一色谱条件：不锈钢柱(150×4.6mm)；流动相：2.0mmol/L碳酸钠和2.0mmol/L碳酸氢钠混合溶液；流速：1.0mL/min；进样量：25μL；抑制电流：25mA；柱温：30℃；电导检测器。
实施例2不同装柱温度对于色谱柱柱效和背景压力的影响考察
实验尝试了在四个不同温度下(10℃、30℃、50℃、80℃)进行固定相的装填。在相同的色谱条件下进行色谱性能测试，以SO4 2-计算色谱柱柱效及背景压力。结果表明装填温度对柱效的影响不大，但在10℃的温度下所装填的色谱柱背景压力较大，而当温度升高时，背景压力降低，在30℃至80℃的温度变化内背景压力变化较小，考虑到本实验方法制备的色谱柱柱压较低，因此在20～30℃下进行色谱柱的装填的是合适的。
实施例3不同装柱的梯度流速对于色谱柱柱效和背景压力的影响考察
实验分别在不同初始流速下(0.7、1.4、2.1、2.8、3.5mL/min)装柱30min，然后在20MPa的压力下巩固色谱柱床层，当顶替液流出体积为500mL时色谱柱装填结束，在相同的色谱条件下进行色谱性能测试，以SO4 2-计算色谱柱柱效及背景压力。在初始流速为2.1～2.8mL/min时有较高的柱效；色谱柱背景压力随着初始流量的增加则呈现抛物线趋势，在2.1～2.8mL/min范围内有较低的背景压力。色谱柱效受顶替液初始流速影响较大，综合考虑柱效以及背景压力，将装填初速度设在2.1～2.8mL/min范围内较为合适。
实施例4色谱柱稳定性测试
(1)流动相浓度不同配比及流动相不同流速对于分析速度的影响考察
实验分别用2.0mmol/L碳酸钠和2.0mmol/L碳酸氢钠做流动相，1.0mL/min流速，25mA抑制电流；2.0mmol/L碳酸钠和2.0mmol/L碳酸氢钠，1.6mL/min流速，35mA抑制电流；2.5mmol/L碳酸钠和2.0mmol/L碳酸氢钠做流动相，2.0mL/min流速，45mA抑制电流探究是否能够提升色谱柱的分析速度。与常规流速相比，当提升流动相流速与淋洗强度以达到较快的分析速度时，阴离子仍能实现较好地实现分离。但分析速度的提升也使分离度与响应减少。因而，该种固定相在使用常规分离速度时对7种常见阴离子有较好的分离效果。
(2)本实验在上述优化条件下装填的几批色谱柱中随机挑选了一根色谱柱进一步测试色谱柱的稳定性。在相同的色谱条件下，进行100次分离7种常规阴离子的混合标准液，并每隔四针选取一针进样结果进行色谱图的叠加绘制。结果表明，各离子保留时间的RSD均不超过1.1％，峰高与峰面积的RSD均小于6％，说明该种固定相具有良好的稳定性与耐久性。
表1：不同类型顶替液所装填色谱柱通过7种常见阴离子的混合标准溶液进行分离性能测试
表2：7种常见阴离子的色谱分离参数
Claims (7)
1.一种高柱效附聚型离子色谱固定相的装填方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将固体填料在匀浆液中分散，超声，得到浆料；
(2)将所得浆料倒入匀浆罐，匀浆罐与色谱柱柱管连接，顶替液在液相高压泵的作用下进入匀浆罐，匀浆罐中的浆料在顶替液及重力的作用下被压入色谱柱柱管中，当顶替液流出色谱柱时，装填结束；
所述顶替液选自去离子水、0.5～2mmol/LAl3+溶液或2mmol/L Na+溶液；
装填过程中，控制温度在10～80℃；
顶替液在0.7～3.5mL/min的初始流速下装柱30min，之后通过调节液相高压泵的流量调节装柱压力为20MPa，在20MPa的压力下巩固色谱柱床层；
(3)装填结束之后，减小液相高压泵的压力，卸下色谱柱并进行冲洗以除去柱内杂质。
2.如权利要求1所述高柱效附聚型离子色谱固定相的装填方法，其特征在于，步骤(1)中，所述匀浆液的体积用量以固体填料的质量计为20～30mL/g。
3.如权利要求1所述高柱效附聚型离子色谱固定相的装填方法，其特征在于，步骤(1)中，所述固体填料为改性的PS-DVB微球。
4.如权利要求1所述高柱效附聚型离子色谱固定相的装填方法，其特征在于，步骤(1)中，所述匀浆液为改性的PS-DVB微球与水质量比1：20～30的混合液。
5.如权利要求1所述高柱效附聚型离子色谱固定相的装填方法，其特征在于，步骤(2)中，所述Al3+溶液由十二水合硫酸铝溶于去离子水中得到。
6.如权利要求1所述高柱效附聚型离子色谱固定相的装填方法，其特征在于，步骤(2)中，所述Na+溶液由碳酸钠溶于去离子水中得到。
7.如权利要求1所述高柱效附聚型离子色谱固定相的装填方法，其特征在于，步骤(3)中，所述冲洗的方法为：用碳酸钠和碳酸氢钠的混合水溶液为流动相，在流速为1mL/min的条件下，冲洗平衡6h以除去柱内杂质。
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