CN113687007A - 一种色谱柱的序贯填充方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种色谱柱的序贯填充方法，先制备匀浆悬液；把制备的匀浆液倒入已连接好色谱柱管的匀浆罐中；然后以多种不同的顶替液形成序贯顶替液的方式依次输入匀浆罐中，经匀浆罐注入到色谱柱管中；所述序贯顶替液包括第一顶替液、中间替换液和第二顶替液，所述第一顶替液、中间替换液和第二顶替液分别选自乙腈、丙腈、丁腈、甲醇、乙醇、丁醇、纯化水、异丙醇中的一种或几种。本发明采用序贯顶替液的填装方式，能加工出不同类型的色谱柱，且装填紧密、稳定性好、柱效高，同时降低人工成本。
Description
技术领域
本发明涉及高效液相色谱技术领域，具体涉及一种色谱柱的序贯填充方法。
背景技术
色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。填充色谱柱的方法，根据固定相的大小有干法和湿法两种。微粒直径大于20μm的填料一般都用干法填充，直径10μm以下的填料，必须采用湿法填充(等密度匀浆装填法)。
专利201010250468中公开了C18高效液相色谱柱的填充方法，取环己醇和三氯甲烷以9∶11～13∶7的体积比混合，加入粒径为5um的C18硅胶制备成浓度为14.5％的匀浆液，将溶液充分搅拌混合，在超声波振荡器中振荡5～10分钟，匀浆呈无色透明液体；甲醇和异丙醇以1∶1混合作为顶替液；把制备的匀浆液倒入已连接好色谱柱管的匀浆罐中；将顶替液加入到顶替罐中，开动装柱机，在6000psi压力下，将顶替液输入匀浆罐中，经匀浆罐进入到色谱柱中，待色谱柱中流出顶替液70ml～100ml为止，关闭装柱机，停止加压，至系统压力降至常压时，静置20～40分钟，卸下色谱柱。
传统的湿法色谱柱填充填料通常采用单一顶替液填充，不能适应着床均一和高速挤压形成致密填充的问题，这样容易出现出峰拖尾、装填不紧密、一致性差的情况，从而导致柱效不佳；且传统的湿法填充色谱柱，大部分是针对常规的C18柱进行加工研究，对于一些特殊柱(如萘基柱、溴苯柱和离子柱等)，没有相关的加工工艺支撑。同时传统的湿法填充色谱柱还需要人为监控，增加人工成本。
因此需要设计一种带有序贯顶替液系统的色谱柱填充装置和方法来提高柱效，同时满足不同种类的填料生产，无需人为监控，节约时间，具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明目的是改变传统单一顶替液填充不能适应着床均一和高速挤压形成致密填充的问题，造成柱床不紧密，本发明采取多种不同的顶替液形成序贯顶替液的方式来进行填充，能加工出不同类型的色谱柱，且装填更紧密、稳定性好、柱效高，且满足不同填料的生产加工，同时降低人工成本。
为实现以上目的，本发明的技术方案是：
一种色谱柱的序贯填充方法，先制备匀浆悬液；把制备的匀浆液倒入已连接好色谱柱管的匀浆罐中；然后以多种不同的顶替液形成序贯顶替液的方式依次输入匀浆罐中，经匀浆罐注入到色谱柱管中；所述序贯顶替液包括第一顶替液、中间替换液和第二顶替液，所述第一顶替液、中间替换液和第二顶替液分别选自乙腈、丙腈、丁腈、甲醇、乙醇、丁醇、纯化水、异丙醇中的一种或几种；
所述序贯顶替液包括以下两种形式之一：
方式一：第一顶替液选自0.80mm2/s-1.30mm2/s粘度范围内的低粘度顶替液，所述第二顶替液选自2.00mm2/s-3.00mm2/s粘度范围内的高粘度顶替液，所述中间替换液选自与第一顶替液和第二顶替液相溶的顶替液，且相邻的低粘度顶替液与高粘度顶替液之间形成粘度差在1.2mm2/s-2.2mm2/s之间的粘度差；
方式二：第一顶替液选自可以减少填料表面电荷的顶替液；所述第二顶替液选自能让填料填充更加密实的顶替液，所述中间替换液选自与第一顶替液和第二顶替液相溶的顶替液。
进一步的，一种色谱柱的序贯填充方法，包括以下步骤：
a)制备匀浆悬液；按照上述原则准备第一顶替液、中间替换液和第二顶替液；
b)把制备的匀浆悬液倒入已连接至色谱柱填装机的匀浆罐中；将第一顶替液、中间替换液和第二顶替液分别加入到顶替液瓶中形成相关联的序贯顶替液的形式；同时设定三个顶替液的工作时间参数；所述色谱柱装柱机，包括气动增压泵、顶替液瓶、匀浆罐，以及用于连接的管路，所述气动增压泵上设有气体输入接口、介质输入接口、输出接口；所述气体输入接口与进气装置连接；所述输出接口与匀浆罐连接，所述介质输入接口通过管路与顶替液选择机构连接，所述顶替液选择机构的输出端设有至少三个顶替液管，每个顶替液管与顶替液瓶连接；
c)打开空气开关，气体开始进入气动液体泵中，推动液体运动实现增压，调节压力调节阀，当到达所需的压力时，停止调节，在60-80MPa压力下，将三种顶替液按照顺序和设定的时间依次输入匀浆罐中，经匀浆罐进入到色谱柱中；
d待加工结束时，关闭截止阀，使色谱柱自然降压，静置，待色谱柱下端无液体流出时，卸下色谱柱。
其中所述的“介质输入接口通过管路与顶替液选择机构连接，所述顶替液选择机构的输出端设有至少三个顶替液管，每个顶替液管与顶替液瓶连接”形成了序贯顶替液系统，实现不同顶替液之间的切换。
进一步的，所述制备匀浆悬液包括：将填料加入到装有匀浆液的容器中，超声1-5min后分散摇匀，形成匀浆悬液，匀浆悬液的料液比维持在1：10和1：20之间。
进一步的，所述匀浆液选自异丙醇、四氢呋喃、四氯化碳、溴代苯、二氧六环中的一种或几种。
进一步的，三个顶替液的工作时间根据所要填充的色谱柱略有不同，一般优选设定三个顶替液的工作时间参数分别为：第一顶替液工作时间5-15min；中间替换液液工作5-15min；第三顶替液工作15-25min。
进一步的，所述输出接口通过管路与管道分路机构连接，所述管道分路机构的输出端至少设有两个分支，分别与泄压阀、截止阀连接，所述截止阀后端与所述匀浆罐相连。
进一步的，所述气体输入接口通过管路与调压阀、通气开关串联。
进一步的，所述顶替液选择机构和所述管道分路机构均为不锈钢四通。
进一步的，所述气动增压泵内的介质输入接口和输出接口处均设有单向阀，使所述管路内的气体保持单向流动。
进一步的，所述调压阀上设有量程为0-1.6MPa的的第二压力表，用于检测管内压强。
进一步的，还包括用于放置气动增压泵、顶替液瓶、匀浆罐的机架。
进一步的，还包括第一压力表，所述第一压力表连接在所述管道分路机构的输出端，所述第一压力表的量程为0-160MPa。
方式一中：所述低粘度顶替液、替换液和高粘度顶替液均为现有常规顶替液中的一种或者几种，例如乙腈、丙腈、丁腈、甲醇、乙醇、丁醇、纯化水、异丙醇中的一种或几种等，此处顶替液的选择是根据所述要填充色谱柱的种类来选择的，均可以是常规顶替液，不同点在于控制粘度差，先低粘度顶替液填充(目的在于便于填料的着床)，再用替换液替换低粘度的顶替液(中间替换液与满足第一第二顶替液相溶这个条件即可)，接着用高粘度的顶替液填充(高粘度的顶替液可以使得在前面的基础上使得填料的填充更加密实)，形成一个序贯顶替液填充色谱柱的方式。
方式一优选的组合方式有：
A)填装C18柱时，选取乙腈和乙醇混合液作为低粘度的顶替液，其粘度为1.13mm2/s；选取乙醇作为替换液；选取异丙醇和纯化水的混合液作为高粘度的顶替液，其粘度为2.73mm2/s；
B)填装萘基柱时，选取乙醇和乙腈的混合液作为低粘度的顶替液，其粘度为1.15mm2/s；选取乙醇作为替换液；选取乙醇和纯化水的混合液作为高粘度的顶替液，其粘度为2.72mm2/s。
C)填装溴苯柱时，选取甲醇和纯化水作为低粘度的顶替液，其粘度为0.96mm2/s选取乙醇作为替换液；选取乙醇和纯化水作为高粘度的顶替液，其粘度为2.72mm2/s。
方式二中：第一顶替液选自可以减少填料表面电荷的顶替液，可以使得填料更容易着床；所述第二顶替液选自能让填料挤压得更加密实的顶替液，所述中间替换液选自与第一顶替液和第二顶替液相溶的顶替液。第一顶替液、中间替换液和第二顶替液均为现有常规顶替液中的一种或者几种，例如乙腈、丙腈、丁腈、甲醇、乙醇、丁醇、纯化水、异丙醇中的一种或几种等。
方式二优选的组合方式有：
填装阳离子柱时，选取甲醇和乙腈的混合液作为低粘度的顶替液，其粘度为1.14mm2/s；选取乙醇作为替换液；选取乙醇和纯化水的混合液作为高粘度的顶替液，其粘度为2.72mm2/s。
本发明粘度是用乌氏粘度计测试的，本发明写的是液体的运动粘度；运动粘度计算公式：v＝Ct(粘度标准液指定测试温度为20.0℃±0.1℃)，其中v——运动粘度(单位：mm2/s)，C——粘度计常数(每个乌氏粘度计都有一个常数，在合格证上。目前用的这个粘度计的规格是
常数为0.009786mm2/s2)，t——液体从a刻线流经至b刻线的时间(单位：s，一般取多次记录的平均值)。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明的核心技术点在于改变传统单一顶替液填充不能适应着床均一和高速挤压形成致密填充的问题，采取多种不同的顶替液形成序贯顶替液的方式来进行填充，能加工出不同类型的色谱柱，且装填更紧密、稳定性好、柱效高。
2、本发明的色谱柱装柱机便携式、结构简单、便于色谱柱的装填及拆卸、维修使用方便、增加自动化控制设备，实现顶替液切换和顶替时间的自动化控制，减少人工操作，节约成本。
附图说明
图1为本发明的连接关系图；
图2为本发明的结构示意图；
图3为本发明的主视图；
图4为本发明的侧视图；
图5为本发明的俯视图；
图6为本发明的原理框图；
图7为本发明实施例1的填充色谱柱的出峰谱图；
图8为对比例1填充色谱柱常规方法的出峰谱图；
图9为本发明实施例1的填充色谱柱与对比例1常规方法的柱效对比图。
图10为本发明实施例2的填充色谱柱的出峰谱图；
图11为对比例2填充色谱柱的的出峰谱图；
图12为实施例3填充色谱柱的出峰谱图；
图13为对比例3填充色谱柱的出峰谱图；
图14为实施例4填充色谱柱的出峰谱图；
图15为对比例4填充色谱柱的出峰谱图；
特别说明：图7-15下面的数据为仪器同时输出的一套图纸中的内容，一般一起阅读和使用，不拆开来放置；
图中所述文字标注表示为：1、机架；2、气动增压泵；4、调压阀；5、通气开关；6、顶替液选择机构；7、电磁阀；8、时间继电器；9、顶替液瓶；10、管道分路机构；11、第一压力表；12、泄压阀；13、截止阀；14、匀浆罐。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。
如图1-图6所示，一种色谱柱装柱机，包括气动增压泵2、顶替液瓶9、匀浆罐14，以及用于连接的管路，所述气动增压泵2上设有气体输入接口、介质输入接口、输出接口；气体输入接口通过管路与调压阀4、通气开关5串联；介质输入接口通过管路与顶替液选择机构6连接，所述顶替液选择机构6的输出端设有三个顶替液管，分别为装有低粘度顶替液的第一顶替液瓶、装有中粘度的第二顶替液瓶以及装有高粘度的第三顶替液瓶，每个顶替液管与顶替液瓶9连接，所述顶替液管上设有电磁阀7和时间继电器8，所述电磁阀7与所述时间继电器8电连接其中所述电磁阀7用于控制管路的通断，所述时间继电器8用于控制加工的时长；输出接口通过管路与管道分路机构10连接，所述管道分路机构10的输出端设有三个分支，分别与第一压力表11、泄压阀12、截止阀13连接，所述第一压力表11的量程为0-160MPa，所述截止阀13后端与所述匀浆罐14相连。
所述顶替液选择机构6和所述管道分路机构10均为不锈钢四通。
所述气动增压泵2内的介质输入接口和输出接口处均设有单向阀，使所述管路3内的气体保持单向流动。
所述调压阀4上还设有量程为0-1.6MPa的的第二压力表，用于检测管内压强。
还包括用于放置气动增压泵2、顶替液瓶9、匀浆罐14的机架1，所述机架1采用铝合金材料制作，铝合金质量轻，且拥有不错的强度，其中管路、气体输入接口、介质输入接口、输出接口均采用316不锈钢材料制作，增强其可靠性。
具体使用时，先将匀浆罐14与输出接口连接，拧紧，将三个流路的顶替液瓶9分别加上所需液体，即在第一顶替液瓶中装入第一顶替液，在第二顶替液瓶中装入替换液，在第三顶替液瓶中装入高粘度的第二顶替液，在时间继电器8上设置时间，由电磁阀7来控制通电和断电，实现多溶剂系统中的顶替液瓶9的切换，无需人为监控和手动切换，关闭气体输入接口上的通气开关5和输出接口上的泄压阀12，将气体输入接口上的调压阀4设定在0.2MPa。
启动增压系统：打开通气开关5，微调调压阀4，启动气动增压泵2，气动增压泵2输入气体，到达所需的输出压力后使气体产生动力，将顶替液瓶9中的顶替液导入到匀浆罐14内，使填料颗粒絮在匀浆罐14内进行着床，设定时间运行完，关闭截止阀13，关闭时间继电器8开关，缓慢开启泄压阀12，拆卸匀浆罐14。
实施例1
一种色谱柱的序贯填充方法，先制备匀浆悬液；把制备的匀浆液倒入已连接好色谱柱管的匀浆罐中；以多种不同的顶替液形成序贯顶替液的方式依次输入匀浆罐中，经匀浆罐注入到色谱柱管中；选取乙腈+乙醇混合液(低粘度的顶替液，粘度为1.13mm2/s)顶替10min+乙醇(替换液)10min+异丙醇和纯化水混合液(高粘度的顶替液，粘度为2.73mm2/s)顶替20min的方式进行填充。
以填装5μm硅胶4.6×250mm分析柱为例：称取填料3.0-3.5g(4.6×250mm分析柱标准需要干料2.8g，经验3.2g比较合适)；用50-60mL异丙醇匀浆液溶解填料，用玻璃棒搅拌均匀后用超声波超1分钟，以确保其分散性；迅速将上述混合液倒入匀浆罐(尽量短时间内完成该工序并确保匀浆罐内无气泡)，迅速将匀浆罐和柱子连接到泵上以70MPa的压力，乙腈+乙醇混合液(低粘度的顶替液，粘度为1.13mm2/s)顶替10min+乙醇(替换液)10min+异丙醇和纯化水混合液(高粘度的顶替液，粘度为2.72mm2/s)顶替20min的方式进行填充。开启装柱机，保持装柱机在70MPa压力下工作，三个流路工作时间：第一顶替液顶替10分钟、第二顶替液工作10分钟、第三顶替液工作20分钟后，关闭截止阀13，使色谱柱自然降压，直至色谱柱下端无液体流出为止，拆卸加工好的色谱柱，检查柱头是否平整，如不平整用顶针顶平。
将色谱柱接入到二维液相色谱仪中，用甲醇(色谱级)以1.0mL/min流速运行30分钟，开始检验色谱柱效。
对比例1
具体步骤同实施例1，不同点在于选取背景技术中所述“甲醇和异丙醇以1∶1混合作为顶替液”代替本发明的实施例1的序贯顶替液填充的方式。
经过多次试验，实施例1填充的色谱柱理论塔板数和分离度明显高于对比例1单一顶替液填充的色谱柱，峰宽则明显低于对比例1填充的色谱柱的峰宽，具体实验对比数据见图7-图9(图表是一套完整的数据)，以及表1和表2。
表1 实施例1的方法所加工色谱柱的数据表
表2 对比例1所加工色谱柱的数据表
| 保留时间 | 理论塔板数 | 拖尾因子 | 峰宽(宽度5％) | 分离度 |
| 9.054 | 8422 | 0.895 | 0.596 | -- |
| 11.201 | 8881 | 0.911 | 0.736 | 4.936 |
需要说明的是，理论塔板数为色谱的柱效参数之一,用于定量表示色谱柱的分离效率；拖尾因子为通过计算5％峰高处峰宽与峰顶点至前沿的距离比来评价峰形的参数，目的是为了保证色谱分离效果和测量精度；峰宽为在色谱峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点间的距离；分离度为判断分离物质在色谱柱中的分离情况，常用分离度作为色谱柱的总分离效能指标。
根据表1-表2以及图7-图9给出的出峰谱图和柱效的对比图，其中数据1为本申请的柱效，数据2为常规设备的柱效，可以得出本申请的柱效明显优于对比例1填装的色谱柱的柱效。
实施例2
机械结构同实施例1，不同点在于填充的色谱柱和序贯替换液不同，具体为：
填装萘基柱时(以4.6×125mm为例)，选取低粘度的顶替液(乙醇和乙腈混合)，粘度为1.15mm2/s顶替5min+乙醇(替换液)顶替10min+高粘度的顶替液(乙醇和水的混合液)，粘度为2.72mm2/s顶替5min的方式。
表3 实施例2的方法所加工色谱柱的数据表，柱效图请见图10
| 保留时间 | 理论塔板数 | 拖尾因子 | 峰宽(高度5％) |
| 6.730 | 5790 | 0.993 | 0.447 |
对比例2，具体步骤同实施例2，不同点在于选取“乙醇和乙腈以体积比1∶1混合作为顶替液”代替本发明的实施例2的序贯顶替液填充的方式。
表4 对比例2的方法所加工色谱柱的数据表，柱效图请见图11
| 保留时间 | 理论塔板数 | 拖尾因子 | 峰宽(高度5％) |
| 6.655 | 3926 | 1.187 | 0.584 |
可见，实施例2填充的色谱柱理论塔板数和分离度明显高于对比例2单一顶替液填充的色谱柱，峰宽明显低于对比例2填充的色谱柱的峰宽。
实施例3
机械结构同实施例1，不同点在于填充的色谱柱和序贯替换液不同，具体为：
填装溴苯柱时(以4.6×125mm为例)，选取低粘度的顶替液(甲醇和纯化水)，粘度为0.96mm2/s顶替5min+乙醇(替换液)顶替5min+高粘度的顶替液(乙醇和纯化水)，粘度为2.72mm2/s顶替10min的方式。
表5 实施例3的方法所加工色谱柱的数据表，柱效图请见图12
| 保留时间 | 理论塔板数 | 拖尾因子 | 峰宽(高度5％) |
| 6.637 | 5182 | 1.062 | 0.488 |
对比例3，具体步骤同实施例3，不同点在于选取“甲醇作为顶替液”代替本发明的实施例3的序贯顶替液填充的方式。
表6 对比例3的方法所加工色谱柱的数据表，柱效图请见图13
| 保留时间 | 理论塔板数 | 拖尾因子 | 峰宽(高度5％) |
| 6.511 | 5204 | 1.268 | 0.504 |
可见，实施例3填充的色谱柱理论塔板数和分离度明显高于对比例3单一顶替液填充的色谱柱，峰宽明显低于对比例3填充的色谱柱的峰宽。
实施例4
机械结构同实施例1，不同点在于填充的色谱柱和序贯替换液不同，序贯替换液采取方式二的方式进行选取，具体为：
填装阳离子柱时，选取甲醇和乙腈的混合液作为低粘度的顶替液，其粘度为1.14mm2/s；选取乙醇作为替换液；选取乙醇和纯化水的混合液作为高粘度的顶替液，其粘度为2.72mm2/s。
表7 实施例4的方法所加工色谱柱的数据表，柱效图请见图14
| 保留时间 | 理论塔板数 | 拖尾因子 | 峰宽(高度5％) |
| 3.902 | 2060 | 1.048 | 0.449 |
对比例4，具体步骤同实施例4，不同点在于选取“溴苯和异丙醇以体积比1∶1混合作为顶替液”代替本发明的实施例4的序贯顶替液填充的方式。
表8 对比例4的方法所加工色谱柱的数据表，柱效图请见图15
| 保留时间 | 理论塔板数 | 拖尾因子 | 峰宽(高度5％) |
| 4.673 | 1230 | 1.072 | 0.641 |
可见，实施例4填充的色谱柱理论塔板数和分离度明显高于对比例4单一顶替液填充的色谱柱，峰宽明显低于对比例4填充的色谱柱的峰宽。
本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，由于文字表达的有限性，而客观上存在无限的具体结构，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进、润饰或变化，也可以将上述技术特征以适当的方式进行组合；这些改进润饰、变化或组合，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种色谱柱的序贯填充方法，先制备匀浆悬液；把制备的匀浆悬液倒入已连接好色谱柱管的匀浆罐中；其特征是，然后以多种不同的顶替液形成序贯顶替液的方式依次输入匀浆罐中，经匀浆罐注入到色谱柱管中；所述序贯顶替液包括第一顶替液、中间替换液和第二顶替液，所述第一顶替液、中间替换液和第二顶替液分别选自乙腈、丙腈、丁腈、甲醇、乙醇、丁醇、纯化水、异丙醇中的一种或几种；
所述序贯顶替液包括以下两种形式之一：
方式一：第一顶替液选自0.80mm2/s-1.30mm2/s粘度范围内的低粘度顶替液，所述第二顶替液选自2.00mm2/s-3.00mm2/s粘度范围内的高粘度顶替液，所述中间替换液选自与第一顶替液和第二顶替液相溶的顶替液，且相邻的低粘度顶替液与高粘度顶替液之间形成粘度差在1.2mm2/s-2.2mm2/s之间的粘度差；
方式二：第一顶替液选自可以减少填料表面电荷的顶替液；所述第二顶替液选自能让填料填充更加密实的顶替液，所述中间替换液选自与第一顶替液和第二顶替液相溶的顶替液。
2.根据权利要求1所述一种色谱柱的序贯填充方法，其特征是，包括以下步骤：
a）制备匀浆悬液；按照权利要求1的原则准备第一顶替液、中间替换液和第二顶替液；
b)把制备的匀浆悬液倒入已连接至色谱柱填装机的匀浆罐中；将第一顶替液、中间替换液和第二顶替液分别加入到顶替液瓶中形成相关联的序贯顶替液的形式，同时设定三个顶替液的工作时间；所述色谱柱填装机包括气动增压泵（2）、顶替液瓶（9）、匀浆罐（14），以及用于连接的管路，所述气动增压泵（2）上设有气体输入接口、介质输入接口、输出接口；所述气体输入接口与进气装置连接；所述输出接口与匀浆罐（14）连接，所述介质输入接口通过管路与顶替液选择机构（6）连接，所述顶替液选择机构（6）的输出端设有至少三个顶替液管，每个顶替液管与顶替液瓶（9）连接，每个顶替液管上分别设有控制装置；
c)打开空气开关，气体开始进入气动液体泵中，推动液体运动实现增压，调节压力调节阀，当到达所需的压力时，停止调节，在60-80MPa压力下，将三种顶替液按照顺序和设定的时间依次输入匀浆罐中，经匀浆罐进入到色谱柱中；
d待加工结束时，关闭截止阀，使色谱柱自然降压，静置，待色谱柱下端无液体流出时，卸下色谱柱。
3.根据权利要求2所述一种色谱柱的序贯填充方法，其特征是，所述制备匀浆悬液包括：将填料加入到装有匀浆液的容器中，超声1-5min后分散摇匀，形成匀浆悬液，匀浆悬液的料液比维持在1：10和1：20之间。
4.根据权利要求2所述一种色谱柱的序贯填充方法，其特征是，所述匀浆液选自异丙醇、四氢呋喃、四氯化碳、溴代苯、二氧六环中的一种或几种。
5.根据权利要求2所述一种色谱柱的序贯填充方法，其特征是，同时设定三个顶替液的工作时间参数分别为：第一顶替液工作时间5-15min；中间替换液工作5-15min；第三顶替液工作15-25min。
6.根据权利要求2所述一种色谱柱的序贯填充方法，其特征是，所述控制装置包括电磁阀（7）和时间继电器（8），所述电磁阀（7）和所述时间继电器（8）电连接。
7.根据权利要求2所述的一种色谱柱的序贯填充方法，其特征在于：所述输出接口通过管路与管道分路机构（10）连接，所述管道分路机构（10）的输出端至少设有两个分支，分别与泄压阀（12）、截止阀（13）连接，所述截止阀（13）后端与所述匀浆罐（14）相连。
8.根据权利要求2所述的一种色谱柱的序贯填充方法，其特征在于：所述气体输入接口通过管路与调压阀（4）、通气开关（5）串联。
9.根据权利要求2所述的一种色谱柱的序贯填充方法，其特征在于：还包括第一压力表（11），所述第一压力表（11）连接在所述管道分路机构（10）的输出端，所述第一压力表（11）的量程为0-160MPa；所述调压阀（4）上设有量程为0-1.6MPa的的第二压力表。
10.根据权利要求1或2任意一项所述的一种色谱柱的序贯填充方法，其特征在于：方式一的组合方式包括：
A)填装C18柱时，选取乙腈和乙醇混合液作为低粘度的顶替液，其粘度为1.13mm2/s；选取乙醇作为替换液；选取异丙醇和纯化水的混合液作为高粘度的顶替液，其粘度为2.73mm2/s；
B)填装萘基柱时，选取乙醇和乙腈的混合液作为低粘度的顶替液，其粘度为1.15mm2/s；选取乙醇作为替换液；选取乙醇和纯化水的混合液作为高粘度的顶替液，其粘度为2.72mm2/s；
C)填装溴苯柱时，选取甲醇和纯化水作为低粘度的顶替液，其粘度为0.96mm2/s， 选取乙醇作为替换液；选取乙醇和纯化水混合液作为高粘度的顶替液，其粘度为2.72mm2/s；
方式二填装阳离子柱时，选取甲醇和乙腈的混合液作为低粘度的顶替液，其粘度为1.14mm2/s；选取乙醇作为替换液；选取乙醇和纯化水的混合液作为高粘度的顶替液，其粘度为2.72mm2/s。
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