CN113943400A

CN113943400A - 毛蕊异黄酮分子印迹材料、及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN113943400A
Application number: CN202111458698.8A
Authority: CN
Inventors: 谢静; 唐铭擎; 龚易昕悦
Original assignee: Chengdu Medical College
Current assignee: Chengdu Medical College
Priority date: 2021-12-01
Filing date: 2021-12-01
Publication date: 2022-01-18

Abstract

本发明提供了一种毛蕊异黄酮分子印迹材料、及其制备方法与应用，该方法步骤简单、反应条件不苛刻，容易实现，适合工业大生产。同时，本发明还提供该毛蕊异黄酮分子印迹材料在天然异黄酮类成分的整体分离上的应用。

Description

毛蕊异黄酮分子印迹材料、及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于天然药物化学领域，主要包括一种能特异性识别、分离异黄酮类天然产物的新材料制备及其在天然产物整体分离中的应用。

背景技术

以中药为代表的天然药物中含有大量的结构类似化合物，现有的分离一般是通过系统分离的方式进行逐一分离纯化，这一过程需要耗费大量的时间和成本。天然具有多成分协同起效的特点，尤其是结构类似活性成分具有相似的药效活性，因此目前天然产物研究越来越关注于结构类似成分的整体活性。目前，已有的一些基于“敲除”思想的结构类似物整体分离科研实践，主要通过“抗体法”和“色谱法”两种方式实现：①“抗体法”是指首先制备化合物的人工抗体，然后通过免疫亲和柱色谱法特异性地“敲除”(分离)与该化合物具有相同抗原决定簇的一类化合物(即有相同母核的结构类似物)；②“色谱法”则是指通过prep-HPLC、HSCCC等对样品进行色谱分离、分段收集，从而得到不含有某些特定组分的提取物。虽然上述成分“敲除”法为中药整体活性成分的研究提供了新的思路，但“抗体法”由于需要免疫动物制备抗体，因此其成本非常高；“色谱法”则只能针对药材中含量较高的几个单体成分，而忽略了有效部位中大量积少成多的其它成分。因此，如何低成本、高选择性的获取药材中相同母核结构的一类成分，就成为一个新的重要问题。

本发明采用的分子印迹聚合物技术作为一种高选择性的方法，常被用来通过模板分子的形状、大小和官能团从复杂的底物中识别/分离/富集特定的目标化合物，并且分子印迹聚合物通常有良好的化学稳定性和易制备等特点。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种毛蕊异黄酮分子印迹材料，用于实现天然产物中同类成分的整体分离。这种材料可以固相萃取的方式实现异黄酮苷元类天然产物的整体分离，操作简便、分离效率高。

本发明的第二目的在于提供一种毛蕊异黄酮分子印迹材料的制备方法，这种制备方法步骤简单、反应条件不苛刻，容易实现，适合工业大生产。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种毛蕊异黄酮分子印迹材料的制备方法，如图1所示，其包括：

步骤Ⅰ：0.5-1.5g毛蕊异黄酮和1-3g丙烯酰胺溶于25-100mL四氢呋喃溶液中，然后加入20-50mL乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.05-0.2g偶氮二异丁腈。振荡混合均匀后溶液通过超声波脱气10-30min。随后立即在用氮气密封，于40-80℃下热聚合12-36h得到粗聚合物；

步骤Ⅱ：将所得的粗聚合物研磨、过200目筛后，置于索氏提取器中用甲醇/乙酸(9∶1-8∶2，v/v)提取6-18h，然后用甲醇漂洗，最后干燥即得毛蕊异黄酮分子印迹聚合物。

一种毛蕊异黄酮分子印迹材料的在异黄酮苷元类化合物的整体分离上的应用，其包括：

步骤a(装柱)：取0.5-1.5g权利要求5所述的毛蕊异黄酮分子印迹聚合物材料，装入空的固相萃取柱中；

步骤b(上样)：将5-15mL的含异黄酮中药材提取液(A液，浓度为1-10mg/mL)上样于步骤a的固相萃取柱上；随后用5-10mL甲醇清洗，将过柱的上样液与清洗液合并收集为B液；

步骤c(洗脱)：用10-20mL甲醇-乙酸混合体系(9∶1-8∶1，v/v)洗脱，收集洗脱液为C液。

步骤d(检测)：通过高效液相色谱仪对步骤b和c中的A液、B液和C液进行检测。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明首次提出了一种以毛蕊异黄酮为模板合成相应分子印迹材料，利用其特异的分子识别性能，可操作简便、时间迅速、成本低、选择性高地从药材提取物中直接分离出模板分子的类似成分。

用毛蕊异黄酮分子印迹聚合物整体分离异黄酮类苷元的原理是：毛蕊异黄酮分子含有的两个酚羟基和一个羰基，可分别作为氢键供体和氢键受体。因此，功能单体(丙烯酰胺)和模板(毛蕊异黄酮)之间的供体-受体复合物形成了三个稳定的氢键，控制了印迹过程中的精确印迹位点。除去模板分子后，特定的印迹位点将被保留，并选择性地识别毛蕊异黄酮分子及其结构类似成分。图1示出了上述过程。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1毛蕊异黄酮分子印迹聚合物的制备示意图；

图2毛蕊异黄酮的红外光谱图(A)、除去模板分子前的毛蕊异黄酮-分子印迹聚合物的红外光谱图(B)和除去模板分子后的毛蕊异黄酮-分子印迹聚合物的红外光谱图(C)；

图3黄芪提取物的液相图(A)、特异性分离掉异黄酮苷元后所剩溶液的液相图(B)和整体分离出来的异黄酮苷元溶液的液相图(C)(峰1为毛蕊异黄酮苷，峰2为芒柄花素，峰3为毛蕊异黄酮，峰4为芒柄花素)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例一：本实施例提供了一种毛蕊异黄酮分子印迹聚合物的制备方法，其包括：

步骤Ⅰ：0.5g毛蕊异黄酮和1g丙烯酰胺溶于25mL四氢呋喃溶液中，然后加入20mL乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.05g偶氮二异丁腈。振荡混合均匀后溶液通过超声波脱气10min。随后立即在用氮气密封，于50℃下热聚合12h得到粗聚合物；

步骤Ⅱ：将所得的粗聚合物研磨、过200目筛后，置于索氏提取器中用甲醇/乙酸(9∶1，v/v)提取6h，然后用甲醇漂洗，最后干燥即得毛蕊异黄酮分子印迹聚合物。

为了确保毛蕊异黄酮分子印迹聚合物的成功合成，进行了的红外光谱分析。毛蕊异黄酮、除去模板分子前的毛蕊异黄酮-分子印迹聚合物和除去模板分子后的毛蕊异黄酮-分子印迹聚合物的红外光谱分别如图2A、图2B和图2C所示：图2A可见的858cm^-1(ν_C＝C)、1616cm^-1(ν_C＝C)、1513cm^-1(ν_C＝C)、1431cm^-1(ν_C＝C)、1654cm^-1(ν_C＝O)和3296cm^-1(ν_O–H)，图2C可见1733cm^-1(ν_C＝O)、2992cm^-1(ν_{–CH3,–CH2-})和3433cm^-1(ν_C–H)，在图2B中可以看到一些共同的特征峰，表明该材料的成功制备。

进一步，测定了毛蕊异黄酮分子印迹聚合物对不同化合物的选择性。首先采用相同的方式合成了非印迹材料。选择毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花素、芒柄花苷、环黄芪醇、黄芪皂苷I、黄芪皂苷II和黄芪甲苷8个化合物作为试验化合物。将8个毛蕊异黄酮分子印迹聚合物和8个每100mg的分子印迹聚合物分别与10g/mL的乙醇测试溶液(25mL)混合。然后，将这些混合物在20℃下轻轻摇动12h。高速离心后，取上清液测定含量。分别测定使用印迹材料(MIPs)和非印迹材料(NIPs)时化合物的前后游离浓度(C_ini、C_equ)，计算两种的静态吸附分布系数(Kd)及分离因子(β)，结果如表1所示。

表1使用毛蕊异黄酮分子印迹聚合物材料(MIPs)与非印迹材料(NIPs)对不同化合物的选择性考察结果

从Kd及β值可以看出，由于NIPs中没有识别位点，NIPs对毛蕊异黄酮和测试化合物的分子选择性非常接近。相反，MIPs对不同的化合物表现出不同程度的选择性。MIPs对芒柄花素(β1.17)也有较好的选择性，因为毛蕊异黄酮和芒柄花素的化学结构非常相似。对于毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷，虽然核心结构与毛蕊异黄酮相似，但大的取代基使它们不能补充MIPs的印迹腔。弱相互作用导致相对较高的选择性(β分别为2.86和4.61)。至于环黄芪醇、黄芪皂苷I、黄芪皂苷II和黄芪甲苷，由于毛蕊异黄酮对它们的结构完全不同，对它们的选择性最高(β8.27-11.57)。理论计算了范德华分子体积(密度泛函理论计算使用高斯09包进行，在B3LYP/6-31G**理论水平上进行)，进一步讨论了八种化合物的选择性机理：MIPs可以通过模板留下的三维空腔选择性富集模板化合物及其类似物。芒柄花素的分子体积略小于毛蕊异黄酮，因此芒柄花素可以进入毛蕊异黄酮-MIPs的空腔。毛蕊异黄酮黄酮苷的分子体积是毛蕊异黄酮的1.5倍，但它们可以通过其苷元基团部分进入空腔。黄芪皂苷的分子体积约为毛蕊异黄酮的3倍；更重要的是，它们没有共同的母核，所以它们完全无法进入材料的空腔。理论计算与实验现象一致。

实施例二：本实施例提供了一种毛蕊异黄酮分子印迹聚合物的制备方法，其包括：

步骤Ⅰ：1g毛蕊异黄酮和2g丙烯酰胺溶于60mL四氢呋喃溶液中，然后加入30mL乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.1g偶氮二异丁腈。振荡混合均匀后溶液通过超声波脱气20min。随后立即在用氮气密封，于60℃下热聚合24h得到粗聚合物；

步骤Ⅱ：将所得的粗聚合物研磨、过200目筛后，置于索氏提取器中用甲醇/乙酸(9∶1，v/v)提取12h，然后用甲醇漂洗，最后干燥即得毛蕊异黄酮分子印迹聚合物。

实施例三：本实施例提供了一种毛蕊异黄酮分子印迹聚合物的制备方法，其包括：

步骤Ⅰ：1.5g毛蕊异黄酮和3g丙烯酰胺溶于100mL四氢呋喃溶液中，然后加入50mL乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.2g偶氮二异丁腈。振荡混合均匀后溶液通过超声波脱气30min。随后立即在用氮气密封，于80℃下热聚合36h得到粗聚合物；

步骤Ⅱ：将所得的粗聚合物研磨、过200目筛后，置于索氏提取器中用甲醇/乙酸(8∶2，v/v)提取18h，然后用甲醇漂洗，最后干燥即得毛蕊异黄酮分子印迹聚合物。

实施例四：本实施例提供了一种毛蕊异黄酮分子印迹材料的在异黄酮苷元类化合物的整体分离上的应用，其包括：

步骤a(装柱)：取1g实施例一(或实施例二、三)中的毛蕊异黄酮分子印迹聚合物材料，装入空的固相萃取柱中；

步骤b(上样)：将10mL的黄芪提取液(A液，浓度为5mg/mL)上样于步骤a的固相萃取柱上；随后用8mL甲醇清洗，将过柱的上样液与清洗液合并收集为B液；

步骤c(洗脱)：用15mL甲醇-乙酸混合体系(9∶1，v/v)洗脱，收集洗脱液为C液。

步骤d(检测)：通过岛津高效液相色谱仪对步骤b和步骤c中的A液、B液和C液进行检测。色谱条件为：Agilent ZORBAX SB-C18分析柱(150×4.6mm,5μm)，乙腈/水梯度洗脱在0–15–30–40–50min乙腈的比例分别为20％–40％–80％–90％–90％，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长203nm，进样量10μL。检测结果如图3所示，通过比较获得的三个色谱图(图3A、3B和3C)，可以清楚地观察到毛蕊异黄酮(峰3)和芒柄花素(峰4)从黄芪提取物中被完全剔除；除了毛蕊异黄酮和芒柄花素，在图3C中也观察到了一些靠近它们的小峰，这可能是其他含量很低的黄酮类苷元；此外，通过比较固相萃取前后各峰的峰高来评估主要化合物的相对含量。目标峰和剩余峰的峰高变化不显著，表明本发明所制备的材料用于结构类似化合物的整体分离是可靠和有效的。

Claims

1.一种毛蕊异黄酮分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，其包括：

步骤Ⅰ：0.5-1.5g毛蕊异黄酮和1-3g功能单体溶于25-100mL四氢呋喃溶液中，然后加入20-50mL交联剂和0.05-0.2g引发剂。振荡混合均匀后溶液通过超声波脱气10-30min。随后立即在用氮气密封，于40-80℃下热聚合12-36h得到粗聚合物；

2.根据权利要求1所述的毛蕊异黄酮分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述功能单体为丙烯酰胺。

3.根据权利要求1所述的毛蕊异黄酮分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯。

4.根据权利要求1所述的毛蕊异黄酮分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述引发剂为偶氮二异丁腈。

5.一种根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法制得的毛蕊异黄酮分子印迹聚合物。

6.一种根据权利要求5所述的毛蕊异黄酮分子印迹聚合物的应用方法，其特征在于，所述毛蕊异黄酮分子印迹聚合物可用于异黄酮类天然产物的固相萃取法选择性整体分离：

步骤a：取0.5-1.5g所述毛蕊异黄酮分子印迹聚合物材料，装入空的固相萃取柱中；

步骤b：将5-15mL的含异黄酮中药材提取液作为A液上样于步骤a的固相萃取柱上；随后用5-10mL甲醇清洗，将过柱的上样液与清洗液合并收集为B液；

步骤c：用10-20mL甲醇-乙酸混合体系洗脱，收集洗脱液为C液。

步骤d：通过高效液相色谱仪对步骤b和步骤c中的A液、B液和C液进行检测。

7.根据权利要求6所述应用方法，其特征在于，所述异黄酮类天然产物为异黄酮苷元。

8.根据权利要求6所述的应用方法，其特征在于，所述含异黄酮中药材为黄芪。