CN113916995A - 一种测定玉米黄质原料中玉米黄质含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种测定玉米黄质原料中玉米黄质含量的方法，包括以下步骤：溶解玉米黄质原料，以破除玉米黄质的包埋剂，得到玉米黄质溶液；采用复合溶剂对所述玉米黄质溶液中的玉米黄质进行提取，取上清液；用液相色谱法对所述上清液进行玉米黄质的测定；其中所述液相色谱法采用流动相A二丁基羟基甲苯‑甲醇溶液和流动相B二丁基羟基甲苯‑甲基叔丁基醚溶液进行梯度洗脱。本发明的方法能够有效地消除包埋剂和杂质对测定结果的干扰，从而准确地测定玉米黄质的含量。
Description
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种玉米黄质原料中玉米黄质的测定方法。
背景技术
玉米黄质，又称玉米黄素，属于异戊二烯类化合物，是一种含氧的类胡萝卜素。玉米黄质是一种强抗氧化剂，可通过猝灭单线态氧、清除自由基等抗氧化行为来保护机体组织细胞免受由过量氧化反应所产生的潜在危害，具有减少癌症的发生和增强免疫功能的作用。除此之外，玉米黄质还被报道可以预防心血管疾病，能够通过有效阻止蓝光达到保护眼睛的作用等等。
然而，人体无法自身合成玉米黄质，必须通过食物或补充剂获得。根据《食品安全法》和《新食品原料安全性审查管理办法》，国家卫生计生委依照法定程序，组织专家对玉米黄质安全性评估材料进行了审查，认为玉米黄质可作为新食品原料，按照公告内容生产和使用，即符合食品安全要求。
目前，玉米黄质作为新食品原料已在食品行业中有很多应用。然而，对其原料中玉米黄质含量的检测，国家暂未制定相关检测方法。现有文献资料针对玉米黄质提取方法的报道较多，也有部分对黄玉米、万寿菊、苹果皮等中的玉米黄质的测定方法报道，而对玉米黄质原料中玉米黄质含量的测定方法暂无报道。玉米黄质原料作为一种新食品原料其本身玉米黄质含量的多少直接影响着产品中玉米黄质的含量。因此，开发一种玉米黄质原料中玉米黄质含量的测定方法对添加玉米黄质功能食品领域研究是迫切需要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种测定玉米黄质原料中玉米黄质含量的方法，通过采用复合溶剂对玉米黄质进行提纯除杂，并采用二丁基羟基甲苯-甲醇溶液和二丁基羟基甲苯-甲基叔丁基醚溶液两种流动相进行梯度洗脱，从而消除干扰，准确地测定玉米黄质的含量。
根据本发明的一个方面，提供一种测定玉米黄质原料中玉米黄质含量的方法，包括以下步骤：
溶解玉米黄质原料，以破除玉米黄质的包埋剂，得到玉米黄质溶液；
采用复合溶剂对所述玉米黄质溶液中的玉米黄质进行提取，取上清液；
用液相色谱法对所述上清液进行玉米黄质的测定；
其中，所述液相色谱法采用流动相A二丁基羟基甲苯-甲醇溶液和流动相B二丁基羟基甲苯-甲基叔丁基醚溶液进行梯度洗脱。
优选地，所述流动相A为0.1％的二丁基羟基甲苯-甲醇溶液，所述流动相B为0.1％的二丁基羟基甲苯-甲基叔丁基醚溶液。
优选地，所述梯度洗脱条件为：0-18min：100％A-10％A，0％B-90％B；18.1-25min：100％A，0％B，流速为1mL/min。
优选地，所述液相色谱法采用4.6mm×250mm，5μm的C30色谱柱，或具有同等柱效的色谱柱。
优选地，所述复合溶剂为醇和卤代烷烃。
优选地，所述复合溶剂为乙醇和三氯甲烷或二氯甲烷。
优选地，所述玉米黄质原料中玉米黄质为水溶性包埋。
优选地，溶解玉米黄质原料步骤包括：将玉米黄质原料和水在58～62℃水浴中超声至完全溶解。
优选地，采用复合溶剂对所述玉米黄质溶液中的玉米黄质进行提取步骤包括：
向所述玉米黄质溶液中加入醇，溶解后加入卤代烷烃，摇匀后静置，取上清液；
再用所述醇对所述上清液进行溶解、定容，得到醇溶液；
对所述醇溶液进行过滤，得到过滤后的醇溶液用于液相色谱测定。
优选地，根据本发明的方法包括以下步骤：
1)向玉米黄质原料加入水溶解，充分震荡后放入58～62℃水浴中超声直到未见沉淀，制得玉米黄质水溶液；
2)将步骤1)得到的玉米黄质水溶液冷却至室温后加入乙醇，涡旋溶解后加入三氯甲烷，并用乙醇定容；
3)摇匀后静置，取上清液用乙醇溶解定容，得到乙醇溶液；
4)对步骤3)得到的乙醇溶液进行过滤，得到过滤后的乙醇溶液；
5)采用液相色谱法对步骤4)过滤后的乙醇溶液进行玉米黄质的测定。
根据本发明的测定方法采用水将原料中玉米黄质的包埋剂破除，用乙醇将玉米黄质溶解，用三氯甲烷沉淀杂质，有效地消除包埋和杂质对测定结果的干扰，从而准确地测定玉米黄质的含量。
附图说明
参考随附的附图，本发明更多的目的、功能和优点将通过本发明实施方式的如下描述得以阐明，其中：
图1示出了根据实施例1测定的玉米黄质原料中的玉米黄质的液相色谱图；
图2示出了根据对比例1测定的玉米黄质原料中的玉米黄质的液相色谱图。
具体实施方式
为了更加清楚地理解本发明的技术特征、目的和有益效果，现对本发明的技术方案进行进一步的详细说明。应理解，以下具体实施方式仅是示例性的，本发明的技术方案不限于以下所列举的具体实施方式。
本发明提供了一种测定玉米黄质原料中玉米黄质含量的方法，包括以下步骤：
溶解玉米黄质原料，以破除玉米黄质的包埋剂，得到玉米黄质溶液；
采用复合溶剂对所述玉米黄质溶液中的玉米黄质进行提取，取上清液；
用液相色谱法对所述上清液进行玉米黄质的测定；
其中，溶解玉米黄质原料步骤包括：将玉米黄质原料和水在58～62℃水浴中超声至完全溶解。
具体地，可向玉米黄质原料中加入去离子水，充分震荡后放入58～62℃热水浴中超声至玉米黄质原料完全溶解，制得玉米黄质水溶液。
通过该溶解步骤，可去除玉米黄质表面的水溶性包埋剂，有利于消除包埋对测定结果的干扰。
可用于本发明的玉米黄质原料指来源于植物的玉米黄质和水溶性包埋剂的玉米黄质混合物。作为本发明玉米黄质来源的植物例如可为选自万寿菊、玉米、羽衣甘蓝、甜菜、蒲公英、芥菜、花椰菜、紫苏、鲜香菜中的一种或多种，优选万寿菊。
根据一个具体实施方式，将上述玉米黄质水溶液冷却至室温，用于提纯和除杂。
具体地，上述玉米黄质溶液加入醇溶剂，优选乙醇，使得玉米黄质溶入醇溶剂中，即将玉米黄质提取到上清液中，实现对玉米黄质的提纯。该溶解过程优选为涡旋溶解。
随后，在上述提纯溶液中继续加入卤代烷烃，优选二氯甲烷或三氯甲烷，用于沉淀玉米黄质中的杂质，从而消除杂质对测定结果的干扰。将加入卤代烷烃的溶液摇匀后静置，例如约30min后，取上清液。此时，该上清液中浓缩了溶解的玉米黄质，同时杂质沉淀在三氯甲烷相中，从而对玉米黄质实现了提纯和除杂。
将上述上清液溶解在醇溶剂，例如乙醇中，定容(例如定容至100ml)。
优选地，在进行液相色谱测定之前，对上述上清液的醇溶液进行过滤，优选采用0.45μm的滤膜进行，得到过滤后的乙醇溶液，用于后续的液相色谱测定步骤。
上述液相色谱法采用4.6mm×250mm，5μm的C30色谱柱，或具有同等柱效的色谱柱，采用流动相A二丁基羟基甲苯(BHT)-甲醇溶液和流动相B二丁基羟基甲苯(BHT)-甲基叔丁基醚溶液进行梯度洗脱，优选用流动相A 0.1％的二丁基羟基甲苯-甲醇溶液和流动相B0.1％的二丁基羟基甲苯-甲基叔丁基醚溶液进行梯度洗脱。
具体地，梯度洗脱条件为：0-18min：100％A-10％A，0％B-90％B；18.1-25min：100％A，0％B，流速为1mL/min。
优选地，采用复合溶剂对所述玉米黄质溶液中的玉米黄质进行提取步骤包括：
向所述玉米黄质溶液中加入醇，溶解后加入卤代烷烃，摇匀后静置，取上清液；
再用所述醇对所述上清液进行稀释、定容，得到醇溶液；
对所述醇溶液进行过滤，得到过滤后的醇溶液用于液相色谱测定。
根据一个具体实施方式，根据本发明的方法包括以下步骤：
1)向玉米黄质原料加入水溶解，充分震荡后放入58～62℃水浴中超声直到未见沉淀；
2)将步骤1)得到的水溶液冷却至室温后加入乙醇，涡旋溶解后加入三氯甲烷，并用乙醇定容；
3)摇匀后静置，取上清液用乙醇溶解定容，得到乙醇溶液；
4)对步骤3)得到的乙醇溶液进行过滤，得到过滤后的乙醇溶液；
5)采用液相色谱法对步骤4)过滤后的乙醇溶液进行玉米黄质的测定。
在本发明的方法中，采用醇溶剂(例如乙醇)和卤代烷烃(例如三氯甲烷)混合溶剂对玉米黄质原料中的玉米黄质进行提取和净化，使用C30色谱柱将玉米黄质进行分离，有效地消除杂质对测定结果的干扰，从而准确地测定玉米黄质的含量，为原料中玉米黄质的测定提供一种快速、准确的检测方法。
此外，使用硅胶基质上键合了C30功能团的反相色谱柱-YMC-C30色谱柱进行玉米黄质分离，由于类胡萝卜素同分异构体结构相似和复杂多样，需要合适的梯度洗脱条件和流动相才能将其完全分离，故本发明采用：流动相A为0.1％BHT甲醇溶液，流动相B为0.1％BHT甲基叔丁基醚，梯度洗脱条件，0-18min:100％A-10％A，0％B-90％B；18.1-25min：100％A，0％B，流速为1mL/min，来对乙醇中的玉米黄质与杂质和异构体进行分离，配有紫外检测器的高效液相色谱仪在检测波长为450nm下进行检测。综上所述，本发明提供了一种玉米黄质原料中玉米黄质的测定方法，操作过程简便、检验成本低、检测结果准确、实验再现性好，具有较强的应用价值。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的详细说明。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试剂如无特别说明均为可商购的试剂。
实施例
实施例1
1、玉米黄质原料中玉米黄质的分离步骤，具体如下：
1)称取市售玉米黄质原料0.2g于100mL棕色容量瓶中，加入5mL水溶解，充分震荡后放入58～62℃水浴中超声5min，若有少许沉淀，继续超声直到未见沉淀；
2)冷却至室温后加入40mL乙醇，涡旋溶解后加入50mL三氯甲烷，用乙醇定容；
3)摇匀后静置30min；
4)取上清液0.5mL至50mL棕色容量中，用乙醇溶解定容；
5)过滤：采用0.45μm的滤膜对步骤4)中的乙醇溶液进行过滤，得到过滤后的乙醇溶液。
2、液相色谱法的测定：
1)采用液相色谱法对以上过滤后的乙醇溶液进行玉米黄质含量的测定，得到如图1所示的玉米黄质的色谱图。其中，保留时间为9.5min是玉米黄质，8.9min是叶黄素，其余为杂质峰。
2)液相色谱的测定条件：色谱柱：C30，4.6mm×250mm，5μm；检测波长：450nm，柱温：25℃；进样体积50uL；流动相A为0.1％BHT-甲醇溶液，流动相B为0.1％BHT-甲基叔丁基醚，梯度洗脱条件，0-18min:100％A-10％
A，0％B-90％B；18.1-25min：100％A，0％B，流速为1mL/min。
3、结果计算：
式中：
X—样品的含量，g/100g；
C—样品浓度，μg/mL；
V—样品处理液定容体积，mL；
D—样品处理液稀释倍数；
m—样品质量，g。
4、效果评价以及性能检测
(1)线性范围
标准工作液的制备：用5μg/mL的玉米黄质标准溶液配制0，0.1μg/mL，0.2μg/mL，0.5μg/mL，1μg/mL，2μg/mL的玉米黄质标准曲线。采用液相色谱仪进行测定，结果表明：玉米黄质浓度范围0μg/mL-2μg/mL内，与其峰面积呈现良好的线性关系，其相关系数r均大于0.999。以标准溶液的浓度为X轴，标准品峰面积为Y轴，进行线性回归分析，得出线性回归方程为Y＝617.0X+2.3888。均符合国家标准要求(其中，根据GB/T 27417-2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》，至少具有6个校准点(包括空白)，线性范围覆盖一个或多个数量级，线性回归方程的相关系数不低于0.99)。
(2)重复性
本实施选用市售某品牌玉米黄质原料，进行玉米黄质含量的检测。具体结果如表1。符合国标GB/T 27417-2017的要求(其中，根据GB/T 27417-2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》，含量1％时，RSD≦2.7％；含量10％时，RSD≦2.0％，精密度符合要求)。
表1玉米黄质含量和相对标准偏差(n＝7)
(3)定量限
按照方法原料上机处理液再稀释50倍时的信噪比为10:1，所以此时对应的原料含量为0.1％为此方法的定量限。
(4)选择性
根据《中国药典》2015年版通则0512高效液相色谱法分离度要求，分离度大于1.5，实际目标物与相邻峰分离度为2.46，满足选择性要求。
对比例1
以与实施例1相同的方法进行玉米黄质分离，不同之处在于液相色谱法测定时，流动相A为甲醇/甲基叔丁基醚/水＝80/15/5，流动相B为甲醇/甲基叔丁基醚＝1/10。得到如图2所示的玉米黄质的色谱图。图2中9.921min处出峰为叶黄素，10.759min处为玉米黄质。
比较图1和图2所述的色谱图可看出，根据本发明的方法采用组成更简单的流动相和特定的洗脱机制，实现了良好的出峰分离度，但是本发明仅使用液相色谱法就能实现对玉米黄质含量的定量检测，流动相配制更简单、洗脱时间更短，仪器使用率更高。此外，本发明的流动相避免使用水相，从而避免了对色谱柱可能造成的潜在损坏。
以上所述仅仅是本发明的优选实施方式。应当指出的是，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，本领域技术人员可对本发明的细节和特征进行各种修改、组合、变更或替换。这些修改、组合、变更或替换也应理解为包括在本发明要求保护的范围之内。
Claims (10)
1.一种测定玉米黄质原料中玉米黄质含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
溶解玉米黄质原料，以破除玉米黄质的包埋剂，得到玉米黄质溶液；
采用复合溶剂对所述玉米黄质溶液中的玉米黄质进行提取，取上清液；
用液相色谱法对所述上清液进行玉米黄质的测定；
其中，所述液相色谱法采用流动相A二丁基羟基甲苯-甲醇溶液和流动相B二丁基羟基甲苯-甲基叔丁基醚溶液进行梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述流动相A为0.1％的二丁基羟基甲苯-甲醇溶液，所述流动相B为0.1％的二丁基羟基甲苯-甲基叔丁基醚溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，所述梯度洗脱条件为：0-18min：100％A-10％A，0％B-90％B；18.1-25min：100％A，0％B，流速为1mL/min。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述液相色谱法采用4.6mm×250mm，5μm的C30色谱柱，或具有同等柱效的色谱柱。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述复合溶剂为醇和卤代烷烃。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述复合溶剂为乙醇和三氯甲烷或二氯甲烷。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述玉米黄质原料中玉米黄质为水溶性包埋。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，溶解玉米黄质原料步骤包括：将玉米黄质原料和水在58～62℃水浴中超声至完全溶解。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，采用复合溶剂对所述玉米黄质溶液中的玉米黄质进行提取步骤包括：
向所述玉米黄质溶液中加入醇，溶解后加入卤代烷烃，摇匀后静置，取上清液；
再用所述醇对所述上清液进行溶解、定容，得到醇溶液；
对所述醇溶液进行过滤，得到过滤后的醇溶液用于液相色谱测定。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，包括以下步骤：
1)向玉米黄质原料加入水溶解，充分震荡后放入58～62℃水浴中超声直到未见沉淀；
2)将步骤1)得到的水溶液冷却至室温后加入乙醇，涡旋溶解后加入三氯甲烷，并用乙醇定容；
3)摇匀后静置，取上清液用乙醇稀释定容，得到乙醇溶液；
4)对步骤3)得到的乙醇溶液进行过滤，得到过滤后的乙醇溶液；
5)采用液相色谱法对步骤4)过滤后的乙醇溶液进行玉米黄质的测定。
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