CN108614046A

CN108614046A - 水产品中多西环素及代谢产物的快速提取及检测方法

Info

Publication number: CN108614046A
Application number: CN201810390452.3A
Authority: CN
Inventors: 胥宁; 艾晓辉; 董靖; 周伟; 刘永涛; 谌芳
Original assignee: Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2018-04-26
Filing date: 2018-04-26
Publication date: 2018-10-02
Anticipated expiration: 2038-04-26
Also published as: CN108614046B

Abstract

本发明公开了一种水产品中多西环素及代谢产物的快速提取及检测方法，其步骤是：1)称取水产品肌肉样品，加入Mcllvaine缓冲溶液，旋涡混合，再加入无水硫酸钠和氯化钠，提取溶剂3%甲酸的乙腈，旋涡混合并离心，取上清液，重复提取合并上清液；2)提取液中加入C18粉净化，漩涡并离心，取上清氮气吹干，复溶后过滤；3)滤液进行UPLC定量测定，采用外标法计算多西环素及代谢产物4‑差向多西环素、6‑差向多西环素的残留量。本方法处理样品简便快速，同时优选了提取溶剂、净化剂和液相色谱流动相，可同时测定水产品中多西环素及代谢产物，重复性好、准确度高。

Description

水产品中多西环素及代谢产物的快速提取及检测方法

技术领域

本发明属于水产品质量安全领域，具体涉及水产品中多西环素及代谢产物的快速提取及检测方法。

背景技术

多西环素主要治疗鱼虾类由弧菌、嗜水气单胞菌、爱德华氏菌等引起的细菌性疾病。由于不规范使用造成了多西环素在动物中的残留，从而危害人类健康。研究表明，四环素类抗生素用后对肝、肾有损害，因为四环素类要经肝脏浓缩，排入胆汁，进入肠道后再吸收，而排出时主要以四环素类原形经肾小球滤过排出，在尿液内浓度较高，故对肝、肾刺激性较大。临床上肝脏与肾脏功能较差时，特别对妊娠母畜，更易损害肝、肾功能，临床上呈现肝、肾功能障碍的症状。四环素类药物大多数的直接毒性作用是由其药物刺激性，蛋白合成抑制以及骨趋向性引起。使用不当或滥用，往往会加重或加速毒性反应的发生，马属动物静脉注射可导致心律不齐、虚脱，严重者可致死。四环素类药物抗菌谱广，进入肠道后敏感菌受到抑制，不敏感或耐药菌如真菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌，魏氏梭菌趁机繁衍，致使肠道菌群紊乱，产生新的感染菌源。

近些年来，多西环素的残留检测技术不断发展，主要方法有酶联免疫法、气相色谱法、液相色谱法等。目前这些检测方法中使用的提取方法大部分采用Mcllvaine缓冲溶液提取，过HLB小柱，之后淋洗洗脱的提取方法。此方法中采用的提取液量大，过柱时间长，而且HLB小柱的成本非常高。另外多西环素(DOX)与其代谢产物4-差向多西环素(4-EPI)和6-差向多西环素(6-EPI)，为差向异构体，分子量完全相同，很难完全分离。为了缩短处理时间和经费成本，本发明采用简便快速的分散固相萃取方法，提供了一整套样品处理方法。为了使DOX与4-EPI和6EPI完全分离，本方法采用了超高效液相色谱，粒径低的色谱柱，优化流动相，使三者完全分离。本方法中样品量大约是以前方法的二分之一，提取时间大大减少，成本约是原来的十分之一。而且方法中优化选取了最佳的流动相，达到了良好的分离度，得到了良好的精密度和准确度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水产品中多西环素及代谢产物的快速提取及检测方法，采用简便快速的分散固相萃取方法提取样品，选取了最佳的流动相和检测条件，检测结果精密度和准确度良好。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：水产品中多西环素及代谢产物的快速提取及检测方法，其步骤是：

水产品中多西环素及代谢产物的快速提取及检测方法，其步骤是：

1)提取：称取水产品肌肉样品，加入Mcllvaine缓冲溶液，旋涡混合；再加入无水硫酸钠和氯化钠，提取溶剂3％甲酸的乙腈，进行漩涡，离心后取上清液；然后采用相同体积的提取溶剂再提取一遍，合并上清液；

2)净化：在上清液加入分散固相萃取试剂C18粉，漩涡后离心，取上清氮气吹干，再加入体积比为1:9的甲醇和0.1％甲酸水的混合液进行复溶，经0.22μm的有机滤膜过滤，滤液供UPLC检测；

3)UPLC测定：液相色谱流动相的水相为5mmol/L乙酸铵水溶液含0.1％甲酸(v/v)，有机相为甲醇及乙腈(3:1，v/v)的混合液，含5mmol/L乙酸铵和0.1％(v/v)甲酸；待测样品的混合标准品上机测定，绘制标准工作曲线，采用外标法计算水产品中多西环素及其代谢产物4-差向多西环素、6-差向多西环素的浓度。

优选的，上述方法中称取肌肉样品2g，加入Mcllvaine缓冲溶液5mL，无水硫酸钠和氯化钠分别为2.0g、2.0g，提取液5.5mL。

优选的，所述步骤2)中，氮气吹干时的温度为30℃。

优选的，所述步骤3)中采用的色谱柱为C18柱，150mm×2.1mm，粒径1.7μm。

优选的，所述步骤3)中流动相的流速为0.35mL/min，进样量5μL，流动相梯度如下：

时间min	有机相％	水相％
			0	90	10
1	90	10
			7	85	15
11	85	15
			13	90	10

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

1、本方法快速简便，提取和净化步骤少，缩短了时间，节约了成本：在提取方法中采用样品量更少，仅为2g；采用两步有机试剂提取，得提取液，优化了无水硫酸钠和氯化钠的量，选取了最佳的提取溶剂。

2、比较了不同固体分散净化剂的净化效果，选取了最佳的净化剂及加入量(C18粉)，化合物的回收率都在62.3-85.1％之间，日内和日间变异系数都在10％之内。

3、选取了合适的色谱柱，最佳的水相和流动相，增加了每个化合物分离度和选择性，尤其使4-EPI与DOX完全分离。

附图说明

图1为不同提取溶液对斑点叉尾鮰肌肉中DOX、4-EPI和6-EPI的提取效果比较。

图2为不同净化剂对DOX、4-EPI和6-EPI的净化效率的影响。

图3为斑点叉尾鮰肌肉中添加50μg/kg DOX、4-EPI和6-EPI的色谱图。

具体实施方式

实施例1：不同提取溶剂的效果比较

(1)提取：称取斑点叉尾鮰肌肉空白样品2g于15mL离心管中，空白样品中分别添加待测化合物混合标准溶液，使各个待测化合物(DOX、4-EPI和6-EPI)的终浓度分别达到50、100和150μg/kg，加入Mcllvaine缓冲溶液5mL，加入2g硫酸钠(提取样品中分别加入2g硫酸镁与2g硫酸钠进行对比，发现硫酸镁易发生鳌合，降低回收率)和2g氯化钠，加入5.5mL提取溶剂，旋涡1min，8000rpm离心5min，取上清液，重复提取，合并上清液；

在本实施例中提取溶剂分别选用了乙腈(ACN)、乙腈+0.1％氨水(氨水的终浓度v/v，下同)、乙腈+0.3％氨水、乙腈+0.5％氨水、乙腈+0.1％甲酸(甲酸的终浓度v/v，下同)、乙腈+0.3％甲酸、乙腈+0.5％甲酸、乙腈+1.0％甲酸、乙腈+3.0％甲酸、乙腈+5.0％甲酸、乙腈+7.0％甲酸、乙腈+9.0％甲酸。

(2)净化：将上述提取液放入离心管中，加入分散固相萃取试剂(200mg C18粉，40μm)，旋涡1min，8000rpm离心5min，30℃水浴下，氮气吹干，1mL甲醇-0.1％甲酸水(1:9，v/v)复溶，8000rpm离心10min，过0.22μm的有机滤膜，供UPLC检测。

(3)色谱条件

仪器：ACQUITY UPLC超高效液相色谱配TUV双通道紫外检测器及Empower2色谱工作站

色谱柱：Waters Acquity C18(2.1mm×50mm，1.7μm)

流动相洗脱条件：

水相中加入乙酸铵5mmol/L，甲酸0.1％(v/v)

有机相为甲醇及乙腈(3:1，v/v)的混合液，含5mmol/L乙酸铵和0.1％(v/v)甲酸

表1流动相梯度

时间min	有机相％	水相％
			0	90	10
1	90	10
			7	85	15
11	85	15
			13	90	10

流速：350μL/min

进样量：5μL

标准工作曲线是采用混合标准品，浓度分别为50、100、500、1000和2000μg/L；测定化合物的的峰面积，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

(4)计算回收率

R＝A_i/A_s×100％

R为回收率，A_i为加标样品中目标化合物的峰面积，As为目标化合物标准品的峰面积。

本实施例选用不同的提取溶剂，包括乙腈(ACN)、乙腈+0.1％氨水(0.1％AA)、乙腈+0.3％氨水(0.3％AA)、乙腈+0.5％氨水(0.5％AA)、乙腈+0.1％甲酸(0.1％FA)、乙腈+0.3％甲酸(0.3％FA)、乙腈+0.5％甲酸(0.5％FA)、乙腈+1.0％甲酸(1％FA)、乙腈+3.0％甲酸(3％FA)、乙腈+5.0％甲酸(5％FA)、乙腈+7.0％甲酸(7％FA)、乙腈+9.0％甲酸(9％FA))，采用外标法进行测定，结果见图1，综合各种因素最终发现3％甲酸的乙腈的提取效果是最佳的。

实施例2：不同净化剂的效果比较

按照实施例1所述的方法，以3％甲酸乙腈为提取溶剂，分别选取C18粉(十八烷基硅烷，40μm)、PSA粉(乙二胺-N-丙基硅烷，40μm)、AL-N粉(中性氧化铝，40μm)、NH₂粉((氨丙基)硅胶基质，40μm)、GCB粉(石墨化碳黑，40μm)各200mg作为净化剂，比较不同净化剂对DOX、4-EPI和6-EPI的测定效果。

如图2所示，最终经比较发现C18粉(200mg)净化效果最佳，多西环素及其代谢产物4-差向多西环素、6-差向多西环素都能达到较好的回收率。

实施例3：水产品中多西环素及代谢产物的快速提取及检测方法

根据实施例1-2优选的实验条件，采用UPLC检测方法测定多西环素及代谢产物在斑点叉尾鮰肌肉中的残留量，以其回收率及精密度作为检测效果的衡量指标，其步骤是：

1、样品处理方法

(1)提取

称取斑点叉尾鮰肌肉空白样品2g于15mL离心管中，空白样品中分别添加不同浓度的待测化合物(DOX、4-EPI和6-EPI)混合标准溶液，使各个待测化合物的终浓度分别达到50、100和150μg/kg，加入Mcllvaine缓冲溶液5mL，加入2g硫酸钠和2g氯化钠，加入5.5mL提取溶剂(含3％甲酸的乙腈)，旋涡1min，8000rpm离心5min，取上清液，重复提取，合并上清液。

(2)净化：将上述提取液放入离心管中，加入分散固相萃取试剂(200mg C18粉)，旋涡1min，8000rpm离心5min，30℃水浴下，氮气吹干，1mL甲醇-0.1％甲酸水(1:9，v/v)复溶，8000rpm离心10min，过0.22μm的有机滤膜，供UPLC检测。

(3)色谱条件

色谱柱：Waters Acquity C18(2.1mm×50mm，1.7μm)

流动相洗脱条件：

水相中加入乙酸铵5mmol/L，甲酸0.1％(v/v)

有机相为甲醇及乙腈(3:1，v/v)的混合液，含5mmol/L乙酸铵和0.1％甲酸

流动相梯度同表1所述

流速：350μL/min

进样量：5μL

(4)计算回收率

R＝A_i/A_s×100％

精密度：选定三个浓度，每个浓度3个平行，一天内测定3次，计算回收率的变异系数为日内变异系数；选定三个浓度，每个浓度3个平行，连续测定3天，计算回收率的变异系数为日间变异系数。

空白样品中分别添加三个不同浓度的待测化合物的混合标准溶液，添加浓度为50、100和150ug/kg，按照操作方法制备样品，获得了良好的回收率和变异系数(见表2)，回收率都在62.3-85.1％之间，日内和日间变异系数都在10％以内。

表2斑点叉尾鮰肌肉中不同化合物的回收率和精密度

Claims

1.水产品中多西环素及代谢产物的快速提取及检测方法，其步骤是：

3)UPLC测定：液相色谱流动相的水相为5mmol/L乙酸铵水溶液含0.1％甲酸，有机相为甲醇和乙腈混合液含5mmol/L乙酸铵、0.1％甲酸，甲醇及乙腈的体积比为3:1；待测样品的混合标准品上机测定，绘制标准工作曲线，采用外标法计算水产品中多西环素及其代谢产物4-差向多西环素、6-差向多西环素的浓度。

2.根据权利要求1所述的水产品中多西环素及代谢产物的快速提取及检测方法，其特征在于：称取肌肉样品2g，加入Mcllvaine缓冲溶液5mL，无水硫酸钠和氯化钠分别为2.0g、2.0g，提取液5.5mL。

3.根据权利要求1所述的水产品中多西环素及代谢产物的快速提取及检测方法，其特征在于：所述步骤2)中，氮气吹干时的温度为30℃。

4.根据权利要求1所述的水产品中多西环素及代谢产物的快速提取及检测方法，其特征在于：所述步骤3)中采用的色谱柱为C18柱，150mm×2.1mm，粒径1.7μm。

5.根据权利要求1所述的水产品中多西环素及代谢产物的快速提取及检测方法，其特征在于：所述步骤3)中流动相梯度如下：

流速为0.35mL/min，进样量5μL。