CN113912680B

CN113912680B - 具有高抗菌活性的抗菌肽及其应用

Info

Publication number: CN113912680B
Application number: CN202111310755.8A
Authority: CN
Inventors: 顾月清; 韩智豪; 尚乾; 许昊然; 耿轩
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2021-11-08
Filing date: 2021-11-08
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2041-11-08
Also published as: CN113912680A; CN116239655A; CN116143885A

Abstract

本发明公开了四种具有高抗菌活性的抗菌肽及其应用，所述多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO.1‑SEQID NO.4之一所示的氨基酸序列。本发明的四种抗菌肽均具有抑菌活性，其中AMP1、AMP2、AMP3表现出强抑菌活性，初步的毒性分析显示其在50g/mL的作用浓度下无溶血性，且对293T细胞的增殖以及细胞形态无显著影响。

Description

具有高抗菌活性的抗菌肽及其应用

技术领域

本发明属于生物医学工程技术领域，具体涉及四种具有高抗菌活性的抗菌肽及其应用。

背景技术

青霉素首次发现于1928年，与磺胺类物质共同作为治疗药物，使得用于治疗微生物感染的药物库逐渐丰富起来。1940年至1960年是抗菌药物发展的黄金时代，目前使用的绝大多数抗生素都是在这段时期被发现的。到目前为止，抗生素已经成为最常用的处方药，其对降低由微生物感染所引起的死亡率以及发病率做出了巨大的贡献。然而，由于抗生素的不规范使用，细菌逐渐对其产生耐药性，很多细菌如金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)，鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumanii)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等进化为多重耐药细菌，对人类的健康带来极大的威胁。除了微生物感染疾病不能得到有效治疗、病情加重、死亡率上升等直接的影响外，抗生素耐药性还会提高治疗以及医疗服务的成本，导致国家以及全球的经济损失，有研究预计到2050年，抗生素耐药性每年会引发一千万人死亡，还会造成全球100万亿的经济损失。此外耐药微生物及其基因可以跨地域、跨物种进行传播，一个地区或物种出现的耐药性可轻易扩散到其他地区或影响其他物种，发达国家和发展中国家均是如此，因此抗生素耐药性是一个全球性的问题。如果继续滥用抗生素作为抑菌药物，将会对全球的公共卫生、食品安全、粮食安全等造成极大的威胁。在这样的情况下，寻找新型抗菌药物迫在眉睫。同传统抗生素相比，抗菌肽表现出更为广谱的抗细菌活性，对革兰氏阴性菌以及革兰氏阳性菌都有灭杀作用，杀菌速度快且不易产生耐药性，因此被当做潜在的抗生素替代物，在抗微生物药物研发方面有着广阔的开发前景。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供了四种具有高抗菌活性的抗菌肽，这些多肽能够有效抑制细菌活性，从而达到杀死细菌的效果，上述多肽或其衍生的产品可以用于制备抗菌药物。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

具有抗菌活性的抗菌肽，，其特征在于选自以下任意一条氨基酸序列所示多肽：

AMP1：APEPRWKIFKRIEKVGRNVRDGVIKAGPAVAVLGQAKALGK(SEQ ID NO.1)

AMP2：KWKFGKKLERIGQNVFRAAEKVLPVATGYAQLPATLAG(SEQ ID NO.2)；

AMP3：RWKFGKKLERMGKRIFKATEKGLPVATGVAALARG(SEQ ID NO.3)；

AMP4：PRWKGWKKIEKAGQRVFKAAEKTLPVAVGYVALAGK(SEQ ID NO.4)。

本发明所述的抗菌肽在制备抗菌药物中的应用；优选在制备针对革兰氏阴性细菌的抗菌药物中的应用。

作为本发明的一种优选，所述的革兰氏阴性细菌包括大肠杆菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌中的一种或多种。

本发明所述的抗菌肽在制备医学显像试剂、防腐剂、饲料添加剂、日化洗涤用品、具有抗菌作用的医疗器械中的应用。

一种医学显像试剂组合物，包含本发明所述的任意一种或多种多肽和显像剂。

一种生物抗菌剂，包含本发明所述的任意一种或多种多肽，及其他药学上允许的辅料。

一种防腐剂，其特征在于包含本发明所述的任意一种或多种多肽。

一种动物饲料，其特征在于包含本发明所述的任意一种或多种多肽，以及基础日粮。

一种日化洗涤用品，其特征在于包含本发明所述的任意一种或多种多肽，以及一种或多种表面活性剂。

所述的日化洗涤用品还包含相应的活性物质、香精、色素等。

一种医用敷料，其特征在于包含本发明所述的任意一种或多种多肽，以及基质。

有益效果：

本发明的多肽具有良好的细菌活性，可抑制、杀伤细菌从而用于细菌感染的治疗，也可应用于多种需要杀灭或抑制细菌的场景，比如用于制备医学显像试剂、化妆品或食品防腐剂、饲料添加剂、日化洗涤用品、具有抗菌作用的医疗器械等。

本发明抗菌肽不仅抑菌效果显著，且在体外细胞毒性实验中未表现出对细胞的毒性，具有极高安全性。

本发明抗菌肽制备工艺成熟，获取渠道方便。

附图说明

图1为实施例1中试验菌株生长曲线。

图2为实施例2中抗菌肽抑菌圈结果。A、B、C、D分别表示抗菌肽以及氨苄青霉素对大肠杆菌(Escherichia coli K-12)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa CGMCC1.10712)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC6538)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis 168)的抑菌圈结果。1、2、3、4、A、C分别代表AMP1,AMP2,AMP3,AMP4,氨苄青霉素(Ampicillin)、天蚕素B(cecropin-B)制成的含药量为50g的药敏纸片，B带表空白药敏纸片，出现抑菌圈则代表该类物质对相应的细菌具有抑菌效果。

图3为实施例3中抗菌肽PI染色结果。

图4为实施例4中抗菌肽AMP1对293T细胞形态学改变的影响。

图5为实施例4中抗菌肽AMP2对293T细胞形态学改变的影响。

图6为实施例4中抗菌肽AMP3对293T细胞形态学改变的影响。

图7为实施例4中抗菌肽AMP4对293T细胞形态学改变的影响。

图8为实施例4中对照组抗菌肽天蚕素B(cecropin-B)对293T细胞形态学改变的影响。

图9为实施例4中四种抗菌肽及对照组对293T细胞增殖的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明。

本发明的多肽序列具体如下：

AMP1：APEPRWKIFKRIEKVGRNVRDGVIKAGPAVAVLGQAKALGK(SEQ ID NO.1)

AMP2：KWKFGKKLERIGQNVFRAAEKVLPVATGYAQLPATLAG(SEQ ID NO.2)

AMP3：RWKFGKKLERMGKRIFKATEKGLPVATGVAALARG(SEQ ID NO.3)

AMP4：PRWKGWKKIEKAGQRVFKAAEKTLPVAVGYVALAGK(SEQ ID NO.4)

本发明的多肽均采用固相合成方法制得。

具体步骤如下：

(1)称量适量取代度为0.35mmol/g的Fmoc-Gly Wang Resin，放置于中号反应柱中，DMF浸泡120min；

(2)抽干DMF,加树脂体积3倍量的20％Pip/DMF,鼓氮气30min，用以脱除Fmoc,DMF洗5遍，茚三酮检测现深蓝色；

(3)按比例投入原料，加入适量DMF，鼓氮气反应,直到茚三酮检测透明；

(4)重复步骤2-3，完成序列的合成；

(5)抽干DMF,加树脂体积3倍量的20％Pip/DMF，鼓氮气30min，用以脱除Fmoc，DMF*2，MeOH*2，DCM*2，MeOH*2；

(6)抽干反应器内树脂，转移至切割管中，加入40mL F液，摇床控温2.5h；

(7)抽滤，将切割滤液收集至离心管中，加入6倍体积冰乙醚，低速离心机沉淀；

(8)将沉淀的粗品用乙醚洗3遍，得最后粗品；

(9)将粗品放置干燥锅中，真空干燥过夜，送纯化部门纯化，获得目标纯度多肽。

(10)利用高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)对多肽分子量和纯度进行鉴定。

为了检测本发明多肽的抑菌活性，体外通过抑菌圈大小判断其抑菌活性。在抑菌圈实验中，本发明的抗菌肽AMP1、AMP2、AMP3、AMP4均展现出了良好的抑菌效果。且在体外细胞毒性实验中未表现出对细胞的毒性。

通过对大肠杆菌(Escherichia coli K-12)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa CGMCC 1.10712)等革兰氏阴性菌以及金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus ATCC6538)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)等革兰氏阳性菌(Bacillussubtilis 168)的抑菌圈实验验证所发明的抗菌肽抗菌活性，结果表明所有抗菌肽对E.coli K-12都有抑菌作用，AMP1、AMP2、AMP3对P.aeruginosa CGMCC 1.10712和B.subtilis 168均有抑菌作用，而所有抗菌肽对S.aureus ATCC6538无抑菌活性均无抗菌活性。通过采用微量肉汤稀释法进行抗菌肽最小抑菌浓度的测定，结果表明，四种抗菌肽对革兰氏阴性菌表现出较高的抑菌活性，尤其是对E.coli K12。除抗菌肽AMP4外，其余抗菌肽对E.coli K12的最小抑菌浓度均小于2g/mL，表现出强抑菌效果。此外从表中可以看到AMP2、AMP3以及对照组Cecropin-B对B.subtilis 168也有较强的抑菌活性，但所有抗菌肽均对S.aureus ATCC6538以及S.cerevisiae无抑菌作用。综合比较五种抗菌肽对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的整体抑菌效果，发现五种抗菌肽对革兰氏阴性菌的敏感性更高,与目前已有的对Cecropin抗菌肽的研究结果一致。通过PI染色实验探究所发明抗菌肽的抑菌机制,根据结果推测这些抗菌肽极有可能是通过破坏细胞膜的完整性来发挥抑菌、杀菌活性的。通过分析AMP1、AMP2、AMP3、AMP4四种抗菌肽以及对照组Cecropin-B(H.cecropia)对绵羊红细胞的溶血性、对HEK293T细胞增殖和细胞形态变化等方面的的影响初步评估了这些抗菌肽的细胞毒性作用，结果表明所有抗菌肽在测试浓度下溶血率均低于5％，因此可以判断在测试浓度下，所有抗菌肽对绵羊红细胞无溶血作用。且抗菌肽在作用时间以及作用浓度范围内对293T细胞的形态变化没有产生显著影响。结合细胞形态改变的数据和生长曲线数据，可以确定在50g/mL的作用浓度下，所有抗菌肽对293T细胞没有表现出细胞毒性作用。

实施例1

实验菌株生长曲线测定

采用比浊法进行实验菌株生长曲线测定，具体步骤如下：

(1)菌株活化：取20L保存于甘油管中的菌液加入到100mL的MHB培养基中37℃培养18h。

(2)编号：取11支盛有肉膏蛋白胨液体培养基的大试管，用记号笔标明培养时间，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16小时。

(3)接种：用移液枪准确吸取200L大肠杆菌培养液，分别接种到已编号的11支肉膏蛋白胨液体培养基大试管中，接种后振荡，使菌体混匀。

(4)培养：将接种后的11支试管置于摇床上，37℃振荡培养。分别在0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16小时将编号为对应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，最后一同比浊测定光密度值。

(5)比浊测定：以未接种的肉膏蛋白胨培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。从最稀浓度的菌悬液开始依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的肉膏蛋白胨液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.1-1.0以内，记录OD值时，注意乘上所稀释的倍数。

结果如图1所示，从结果上可以看到培养5-6h之后所有菌株都处于对数生长期，14h之后菌落个数急剧下降，步入衰亡期。此外从图中也可以看到E.coli K12和B.subtilis168生长较迅速，而S.aureus ATCC6538生长最缓慢。

实施例2

1、抗菌肽抑菌圈实验

采用纸片琼脂扩散法进行抗菌肽抑菌圈直径的测定，合成Cecropin-B抗菌肽和氨苄青霉素为阳性对照，方法参考美国临床和实验室标准协会(CLSI)，具体实验步骤如下：

(1)制作含药量为50g的抗菌肽药敏纸片。

(2)试验菌株的分离纯化；

(3)接种菌液制备：从纯化后的试验菌平板上部分挑取3个直径约为1mm左右的菌落接种于3mL MH肉汤培养基中，35℃培养5-6h,使试验菌达到对数生长期。随后将处于对数生长期的菌液用生理盐水校正浓度至0.5麦氏标准，校正后菌液在15min内接种。

(4)菌液接种至平板：用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后在MH琼脂培养基表面均匀涂布3次，每次旋转平板60°，最后沿平板内缘涂抹一周。

(5)平板在室温下干燥3min后用镊子将含药纸片紧贴于平板琼脂表面，37℃孵育18h后查看结果，用精度为0.01mm的游标卡尺测量抑菌圈直径。

在本实验中我们以氨苄青霉素以及Cecropin-B作为阳性对照，空白药敏纸片为负对照，将含药量为50g的抗菌肽以及氨苄青霉素药敏纸片作用于两种革兰氏阴性菌以及两种革兰氏阳性菌，18h之后观察抑菌效果并测量其抑菌圈直径。有抑菌圈出现则判定该类抗菌肽对相应的细菌具有抑菌活性。抑菌圈结果如图2、表1所示，结果表明所有抗菌肽对E.coli K-12都有抑菌作用，AMP2、AMP3、AMP4对P.aeruginosa CGMCC 1.10712和B.subtilis 168均有抑菌作用，而所有抗菌肽对S.aureus ATCC6538无抑菌活性均无抗菌活性。

表1抗菌肽抑菌圈直径结果

2、抗菌肽最小抑菌浓度测定

采用微量肉汤稀释法进行抗菌肽最小抑菌浓度的测定，方法参考美国临床和实验室标准协会(CLSI)[127]，具体实验步骤如下：

(1)抗菌肽储备液的配置：用pH＝7.4的PBS缓冲溶液作为溶剂，配制浓度为5mg/mL的抗菌肽储备液。储备液配置好之后用孔径为0.25μm的微孔滤膜过滤除菌，小量分装备用-20℃保存。

(2)试验用菌的分离纯化

(3)将抗菌肽原液用MH肉汤培养基对倍稀释成一系列浓度，其中最高浓度为拟测浓度的二倍。然后用移液器按照浓度从高到低的顺序从第1孔到第10孔依此加入50μL稀释好的抗菌肽溶液，第11孔加入50μL MHB培养基，第12孔加入100μL MHB培养基。

(4)接种菌液制备：从分离纯化后的试验菌平板上部分挑取3个直径约为1mm左右的菌落接种于3mL MH肉汤培养基中，35℃培养5-6h,使试验菌达到对数生长期。随后将处于对数生长期的菌液用生理盐水校正浓度至0.5麦氏标准，随后用MH肉汤培养基稀释100倍，使接种菌液含菌量约为106CFU/mL。

(5)接种：给上述有不同浓度的抗菌肽的孔中分别加入50μL配制好的菌液。不加抗菌肽、只含有50μl MH肉汤培养基的孔中也加入50μL配制好的菌液，作为阳性对照。只含有100μL MHB培养基的孔作为空白对照。

(6)在37℃的恒温培养箱中培养18h,培养结束后用多功能微孔板测定各个孔的OD600。显著抑制微生物生长的作用浓度即为抗菌肽的最小抑菌浓度。

抗菌肽对试验菌株的最小抑菌浓度结果如表2所示。从表中可以看到，五种抗菌肽对革兰氏阴性菌表现出较高的抑菌活性，尤其是对E.coli K12。除抗菌肽AMP1外，其余抗菌肽对E.coli K12的最小抑菌浓度均小于2g/mL，表现出强抑菌效果。此外从表中可以看到AMP3、AMP4以及对照组Cecropin-B对B.subtilis 168也有较强的抑菌活性，但所有抗菌肽均对S.aureus ATCC6538以及S.cerevisiae无抑菌作用。综合比较五种抗菌肽对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的整体抑菌效果，发现五种抗菌肽对革兰氏阴性菌的敏感性更高,与目前已有的对Cecropin抗菌肽的研究结果一致。

表2抗菌肽最低抑菌浓度结果

实施例3

PI染色试验

荧光染料PI(碘化丙啶)是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测。它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。基于这个原理，我们以Cecropin-B(H.cecropia)为阳性对照，利用PI染色的方法观察了经抗菌肽作用后E.coli K-12的细胞膜破损情况，以此来初步探究其可能的抑菌机制。具体操作方法如下：

(1)菌株纯化。

(2)从纯化后的试验菌平板上部分挑取3个直径约为1mm左右的菌落接种于3mL MH肉汤培养基中，35℃培养5-6h,使试验菌达到对数生长期。

(3)将处于对数生长期的菌液以10000rpm/min的转速离心3min,收集菌体。

(4)用PBS缓冲溶液洗涤菌体，重复3次，随后用MH肉汤培养基重悬菌体，使其浓度为1×106CFU/mL。

(5)向重悬后的菌液中加入抗菌肽，使每种抗菌肽的最终浓度分别为为2μg/mL、4μg/mL，轻微震荡混匀，空白对照组则向重悬后的菌液加入等体积的PBS缓冲溶液，37℃孵育1h。

(6)孵育结束后，以10000rpm/min的转速离心3min,离心结束弃去上清液，细菌沉淀用800μL的细胞染色缓冲液重悬。

(7)向细菌重悬液中加入5μL的PI染液，混匀，4℃孵育30min。

(8)孵育结束，以10000rpm/min转速离心3min,弃去上清液，随后用PBS缓冲液洗涤菌体沉淀一次，制作涂片，倒置荧光显微镜观察染色结果。

我们利用PI染色的方法初步探究了三种抑菌活性较高的抗菌肽AMP1、AMP2以及AMP3对E.coli K12的抑菌机制，Cecropin-B抗菌肽为阳性对照组。PI染色结果如图5所示，从图上可以看到，孵育1h之后，空白对照组只有少量的细胞发出红色荧光，2g/mL实验组除Cecropin-B抗菌之外，其于抗菌肽组均只有少量细胞发生红色荧光，而4g/mL实验组则有较多的细胞发出红色荧光，表明此时有大量的细菌细胞膜发生破损，因此我们推测这些抗菌肽极有可能是通过破坏细胞膜的完整性来来发挥抑菌、杀菌活性。

实施例4

1、抗菌肽红细胞溶血试验

本实验中以PBS缓冲溶液为阴性对照，0.1％Trion X-100为阳性对照，采用氰化高铁血红蛋白法检测不同浓度抗菌肽对绵羊红细胞的溶血性。具体操作如下：

(1)取脱纤维绵羊血4mL,在低温高速离心机中以800rpm/min的转速离心10min，离心结束后弃去上清液获得红细胞沉淀。

(2)用PBS缓冲液洗涤红细胞沉淀物，以800rpm/min转速离心10min，弃去上层液体。重复洗涤2-3次直至上清液不再出现红色。

(3)将洗涤干净的红细胞用PBS缓冲液稀释至红细胞浓度为2％(v/v)。

(4)配制浓度为1μg/mL、5μg/mL、20μg/mL、50μg/mL的抗菌肽溶液。

(5)取200μL抗菌肽与200μL稀释好的红细胞悬浮液置于1mL EP管中，轻微震荡混匀，37℃孵育1h。

(6)孵育结束，将混合溶液以800rpm/min转速离心10min。离心结束，用移液枪吸取200L上清液于96孔细胞培养板中，随后用多功能微孔板测定各个加样孔在540nm波长下的吸光值。

(7)根据公式：溶血率＝(Apeptide-APBS)/(A0.1％Trion X-100-APBS)x 100％计算抗菌肽的溶血率。

结果表明所有抗菌肽在测试浓度下溶血率均低于5％，如表3。因此可以判断在测试浓度下，所有抗菌肽对绵羊红细胞无溶血作用。

表3四种抗菌肽对红细胞溶血实验结果

2、抗菌肽细胞毒性试验

抗菌肽细胞毒性主要通过观察抗菌肽对HEK293T的细胞增殖情况以及细胞形态变化情况来评估的。具体操作如下：

①.细胞复苏(HEK293T细胞系)

(1)实验前准备：将水浴锅预热至37℃，用医用消毒酒精擦拭超净工作台，并在超净台中按次序摆放好已消毒的离心管、吸管、培养皿,开启紫外灯，紫外灭菌15min；

(2)解冻细胞：从液氮罐中取出细胞，用止血钳夹住冻存管迅速在预热的水浴锅中按一个方向不断的摇动冻存管，使管中的液体迅速融化。待冻存管内液体完全溶解(约2min)，用酒精擦拭冻存管的外壁，随后将冻存管放入超净台内；

(3)稀释细胞：将冻存管中的细胞缓慢加入到装有5mL完全培养液(DMEM培养基+10％FBS+1％双抗)的离心管中，轻轻吹打混匀。随后以1000rpm转速离心5min，得到细胞沉淀；

(4)重悬细胞：弃去上清液，加入1mL细胞培养液重悬细胞；

(5)铺板：将细胞加入装有培养基的培养皿中，将培养皿放入37℃，5％CO2的培养箱中进行细胞培养。

②.传代培养

(1)细胞传代前将细胞培养基、PBS缓冲液和胰蛋白酶消化液在37℃水浴锅中预热，酒精喷壶喷洒超净台并紫外灭菌15min，从培养箱内取出细胞培养皿并在显微镜下观察细胞密度，待细胞汇合度达到80％-90％即可进行传代；

(2)真空泵吸出细胞培养液，PBS清洗两次，加入适量0.25％胰蛋白酶消化液(用量以刚刚覆盖住细胞单层为好)，放入细胞培养箱消化1-2min，显微镜下观察细胞。当观察到胞质回缩、细胞变圆,细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度，可进行下一步操作(切忌过度消化,以免对细胞造成伤害)；

(3)加入与消化液等量的含有血清的细胞培养基终止消化；

(4)用枪吹打细胞,使还未消化下来的细胞脱落，随后将消化好的细胞转移到15mL离心管中，以1000rpm转速离心5min；

(5)真空泵吸弃上清液，加1mL细胞培养基吹打细胞沉淀成细胞悬液；

(6)按照适当比例接种细胞至新的培养皿中，放入培养箱继续培养，传代完成。

③.细胞冻存

(1)选取处于指数生长期的细胞(汇合度70％-80％左右)进行冻存；

(2)按照细胞传代步骤消化、离心、收集细胞后,弃去上清液,加入1mL冻存液(DMEM:FBS:DMSO＝6:3:1)重悬细胞；

(3)按照细胞量补充适量的冻存液后吹打混匀,之后按每管1mL分装到冻存管中；

(4)冻存管侧壁需注明细胞名称、代数、冻存日期和冻存人,然后防入冻存盒中；

(5)冻存盒于4℃放置10min，-20℃放置30min，-80℃放置16h后，将冻存的细胞保存存于液氮中。

④.抗菌肽对HEK293T细胞生长情况影响的测定

(1)当HEK293T细胞的汇合度达到传代时，按照细胞传代培养步骤对细胞进行消化、离心以及重悬培养基。

(2)取出10μL细胞加入到390μL PBS缓冲液，充分混匀。再取出10μL稀释后的细胞与台盼蓝1：1充分混匀后，并取出10μL加入到血球计数板上进行计数。

(3)根据细胞计数结果，调整细胞浓度，并加入不同浓度的抗菌肽，24孔培养板中每孔铺5×104细胞，终体积为1mL，共设置24h，48h和72h三个时间梯度。同时，设置一个只添加PBS缓冲液不加抗菌肽的空白对照组。铺板结束后，将培养皿放入37℃，5％CO2的培养箱培养。

(4)在对应的时间点，首先对细胞进行拍照，观察抗菌肽是否影响了细胞生长。随后，消化细胞进行计数。

细胞毒性通常可以从细胞形态、细胞生长情况及其生化改变等指标进行评价。在本章的工作中，我们通过分析抗菌肽对293T细胞的细胞形态以及细胞生长情况的影响初步评估了抗菌肽的细胞毒性作用。四种抗菌肽作用于HEK293T细胞后，其细胞形态学的变化如图4-8所示。比较实验组和对照组的细胞形态，可以发现在培养期间实验组293T细胞均为典型的上皮细胞样，细胞较为伸展，没有表现出明显的皱缩。比较不同培养时间内，实验组和对照组的细胞生长密度，可以看到随着培养时间的增加，293T细胞的密集程度也在增加。比较在培养时间内，不同浓度的抗菌肽实验组之间其细胞形态变化和细胞密集程度的变化，可以看到彼此之间有相同的变化趋势，由此说明抗菌肽在作用时间以及作用浓度范围内对293T细胞的形态变化没有产生显著影响。四种抗菌肽作用于293T细胞后，其生长曲线如图9所示。从图中可以看到，在细胞培养初始，实验组和对照组的细胞数量均发生减少，24h细胞数量达到最低，此后随着培养时间的增加，细胞逐渐进入对数生长期，细胞个数急剧增加，且72h后所有细胞仍处于对数生长期状态。此外，实验组和对照组之间在细胞生长方面也没有出现显著性差异(p>0.05)，不同浓度的实验组之间也没有显著性差异(p>0.05)。从这个结果可以得出所有抗菌肽均在当前测试浓度下，不会对293T细胞的增殖带来影响。结合细胞形态改变的数据和生长曲线数据，我们可以确定在50g/mL的作用浓度下，所有抗菌肽对293T细胞没有表现出细胞毒性作用。

综上所述，本发明的抗菌肽AMP1、AMP2、AMP3、AMP4均展现出了良好的抑菌效果。且在体外细胞毒性实验中未表现出对细胞的毒性。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 具有高抗菌活性的抗菌肽及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Pro Glu Pro Arg Trp Lys Ile Phe Lys Arg Ile Glu Lys Val Gly

1 5 10 15

Arg Asn Val Arg Asp Gly Val Ile Lys Ala Gly Pro Ala Val Ala Val

20 25 30

Leu Gly Gln Ala Lys Ala Leu Gly Lys

35 40

<210> 2

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Lys Trp Lys Phe Gly Lys Lys Leu Glu Arg Ile Gly Gln Asn Val Phe

1 5 10 15

Arg Ala Ala Glu Lys Val Leu Pro Val Ala Thr Gly Tyr Ala Gln Leu

20 25 30

Pro Ala Thr Leu Ala Gly

35

<210> 3

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Arg Trp Lys Phe Gly Lys Lys Leu Glu Arg Met Gly Lys Arg Ile Phe

1 5 10 15

Lys Ala Thr Glu Lys Gly Leu Pro Val Ala Thr Gly Val Ala Ala Leu

20 25 30

Ala Arg Gly

35

<210> 4

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Pro Arg Trp Lys Gly Trp Lys Lys Ile Glu Lys Ala Gly Gln Arg Val

1 5 10 15

Phe Lys Ala Ala Glu Lys Thr Leu Pro Val Ala Val Gly Tyr Val Ala

20 25 30

Leu Ala Gly Lys

35

Claims

1.具有抗菌活性的抗菌肽，其特征在于选自以下氨基酸序列所示多肽：

AMP1：SEQ ID NO.1。

2.权利要求1所述的抗菌肽在制备抗大肠杆菌药物中的应用。

3.权利要求1所述的抗菌肽在制备防腐剂、日化洗涤用品、具有抗菌作用的医疗器械中的应用。

4.一种生物抗菌药物组合物，其特征在于包含权利要求1中所述的多肽，及其他药学上允许的辅料。

5.一种防腐剂，其特征在于包含权利要求1所述的多肽。

6.一种日化洗涤用品组合物，其特征在于包含权利要求1所述的多肽，以及一种或多种表面活性剂。

7.一种医用敷料，其特征在于包含权利要求1所述的多肽，以及基质。