CN113908263B

CN113908263B - 明胶类酶活保护剂的制备方法及其在降纤酶制剂中的应用

Info

Publication number: CN113908263B
Application number: CN202111532520.3A
Authority: CN
Inventors: 张庆宇
Original assignee: Beijing Sinai Ke Technology Development LLC
Current assignee: Zhang Qingyu
Priority date: 2021-12-15
Filing date: 2021-12-15
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2041-12-15
Also published as: CN114712491A; CN113908263A

Abstract

本发明涉及一种明胶类酶活保护剂的制备方法及其在降纤酶制剂中的应用，所述制备方法包括如下步骤：对明胶溶液进行物理剪切，然后过滤、灭菌、冻干，得到所述明胶类酶活保护剂。本发明提供的明胶类酶活保护剂不仅能够对降纤酶的酶活力提供有效的包裹性保护，在生产和长期储存过程中，提供紧密的保护骨架，阻止降纤酶分子之间的聚合；同时不具有酶活放大效应，能够实现对于中间体的有效监控；并且可以使冻干过程的吹干效应可以大大减少，进一步地保护了酶活的稳定性。

Description

明胶类酶活保护剂的制备方法及其在降纤酶制剂中的应用

技术领域

本发明涉及生物和生化技术领域，尤其涉及一种明胶类酶活保护剂的制备方法及其在降纤酶制剂中的应用。

背景技术

降纤酶是一种特定作用于纤维蛋白原的丝氨酸类蛋白水解酶，在人体内，其直接作用于血液系统的纤维蛋白原，使之转变为非交联的纤维蛋白碎片，激活人体内的纤溶系统，刺激血管内皮细胞，释放出组织型纤溶酶原激活剂，具有间接溶解血栓，抑制血栓形成，改善微循环的作用；用降纤酶原料经冻干工艺制成的注射用降纤酶（药物成分包括降纤酶、骨架赋形剂右旋糖酐和酶活力稳定剂）或降纤酶注射液，临床上可以用于血管栓塞性疾病的治疗和预防，目前市售药品按酶活力计量有5 BU/支和10 BU/支两种规格。

对于降纤酶制剂而言，降纤酶的酶活力稳定性是影响药品生产、药品质量、药品销售的重要因素，基本上贯穿于从药品生产、质量检验、存储、运输直至临床使用的各个环节。

目前，为了避免冻干过程中酶活损失，生产出符合要求的降纤酶制剂，部分生产者会经验性的按酶活力标示量的130%-180%超限投料，此种做法不仅会增加药品的原料消耗和生产成本，还会增加药品中相关杂质的含量以及增加实际药品含量的不确定性和临床使用风险，同时，在药品存储、运输等过程中，由于酶活力的降低，同样会严重影响按处方剂量合理用药的安全性。

或者，还可以添加酶活力保护剂确保酶活力稳定性。目前在降纤酶制剂中研究使用的酶活保护剂包括人血白蛋白、部分水解明胶或水解明胶等。经研究，人血白蛋白是人体中自然存在的一种药物结合蛋白，对降纤酶的活力有活化作用，容易导致降纤酶中间体药液和成品制剂酶活力虚高，影响了制剂装量的准确性；同时由于人血白蛋白存在潜在的血源性病毒污染、资源的稀缺性和较高的生产成本和社会成本，国家药监部门明确限制其作为药品辅料的应用。而部分水解明胶或水解明胶由明胶经酸、碱、或酶水解而得到，其中包括的小分子明胶多肽和多种氨基酸对降纤酶中间体定容灌装前的配制液的酶活力同样会产生酶活力放大效应，虽然冻干后的注射用降纤酶成品的酶活放大效应大大减少或消失，但是对于制剂生产过程中质量控制的关键步骤-中间体监测仍然具有质量控制的不确定性。

降纤酶从原料到制剂的生产过程，酶活稳定性有如下特点：降纤酶原液纯度越高酶活越不稳定，中间体药液浓度越稀或成品分布密度越小酶活越不稳定。纯化的降纤酶是高比活力的蛋白酶，符合药用标准的降纤酶比活根据纯度的提高，蛋白比活达到2500-3000BU/mg，而每支降纤酶药品中降纤酶的含量极少，通常为2-5μg，按药液质量占比计，降纤酶原料占比不超过每支药品内容物的二十万分之一，因此，药液配制、冻干以及成品的放置阶段，降纤酶极易损失活性，对降纤酶和部分失活的降纤酶利用高效液相色谱（HPLC）进行检测，由检测结果可知，在降纤酶部分失活后，降纤酶主峰前新产生一个大分子的杂质峰，因此推测上述过程中，降纤酶活性损失的主要原因可能是由于降纤酶分子的聚合。

综上所述，对降纤酶及高纯度降纤酶的研究表明，多种类型的保护剂例如氨基酸、蔗糖、多元醇等单独使用作为降纤酶的保护剂，起不到有效的酶活保护效果；多组分配合使用，对降纤酶的中间体溶液的含量测定产生显著的放大影响，进而对临床用药的安全性和生产的质量可控性产生潜在的负面影响，因此，为了解决上述问题，迫切需要提供一种对降纤酶具有高稳定性，同时不影响其生产质量监控的酶活稳定剂。

发明内容

为了解决上述技术问题或者至少部分地解决上述技术问题，本发明提供了一种明胶类酶活保护剂的制备方法及其在降纤酶制剂中的应用。

第一方面，本发明提供了一种明胶类酶活保护剂的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：对明胶溶液进行物理剪切，然后过滤、灭菌、冻干，得到所述明胶类酶活保护剂。

本发明选用物理剪切的方式对明胶进行处理，可以使得处理得到的明胶具有合适的分子量（40kD-100kD左右，主要集中在60kD-90kD），和粘度，能够对降纤酶的酶活力提供有效的包裹性保护（降纤酶分子量为36000±5000），在生产和长期储存过程中，提供紧密的保护骨架，阻止降纤酶分子之间的聚合。

与原料明胶、部分水解明胶和水解明胶相比，利用本发明提供的物理剪切的制备方法得到的明胶类酶活保护剂的分子量较为集中，分子量分布较窄，不含或几乎不含各类游离氨基酸和小分子明胶多肽，最大限度的给含酶制剂提供了一个干净的药用辅料背景，且可以避免在生产过程中对降纤酶的酶活放大效应。

同时，本发明发现，本发明提供的明胶类酶活保护剂对于冻干过程的吹干效应可以大大减少，进一步地保护了酶活的稳定性。

作为本发明的一种优选技术方案，所述明胶溶液的质量浓度为1-10 wt%，例如2wt%、3 wt%、4 wt%、5 wt%、6 wt%、7 wt%、8 wt%、9 wt%等。

作为本发明的一种优选技术方案，所述物理剪切的时间为10-30 min，例如11min、12 min、15 min、18 min、20 min、22 min、25 min、28 min等。

对于本发明提供的物理剪切的方法，本发明优选明胶溶液的浓度在1-10 wt%范围内，剪切时间在10-30 min范围内，在此范围内，能够使得到的明胶类酶活保护剂的分子量适宜，且制备时间以及后续处理能耗均较低。若是明胶浓度过低，则会导致明胶的处理各步骤及后续冻干等过程的能耗较高；若浓度过高，则会导致明胶充分溶胀时间过长，在溶胀过程中处理温度降低，则较高浓度的明胶溶液易于形成果冻状凝胶，进而导致整个工艺时间较长或处理过程无法继续进行；同样，若剪切时间较短，则明胶基本保持处理前的性质，高分子量部分占比大，分子量分布均一性差，粘度高，会严重影响明胶处理、过滤等生产和使用过程。

在本发明中，对于明胶溶液的制备方法本发明不进行限定，可以采用任何能够得到明胶溶液的制备方法，示例性的进行以下列举：

将明胶在水中充分溶胀得到明胶溶液，而溶胀的温度（水温）本发明同样不进行限定，为了使明胶在水中的溶解速度较快，通常使用60℃的热水使明胶快速且充分溶胀。

作为本发明的一种优选技术方案，所述物理剪切的方法包括利用组织捣碎机进行物理剪切。

本发明可以利用组织捣碎机对明胶溶液进行物理剪切，本发明所述的组织捣碎机为目前市售的处理生化材料的常用仪器，本发明并不进行过多限定。

同时，对于使用组织捣碎机进行物理剪切的温度，本发明同样不进行限定，使用目前对于生化材料常规采用的处理温度即可，示例性的，为了避免在物理剪切过程中小分子物质或者杂质的增加，本发明使用组织捣碎机在40℃以下进行物理剪切，优选在室温或室温以下的温度进行物理剪切，最优选在4-10℃的低温范围内进行物理剪切。

对于组织捣碎机的转速（物理剪切的速度），本发明不进行限定，本发明可以使用目前生化材料常用的满足应用要求的任何组织捣碎机，对于组织捣碎机的转速选择，为了保证转速的稳定性以及避免刀头的局部发热，一般选用中间转速进行处理，此为本领域常规操作，本发明不进行过多解释和限定。进一步地，对于本发明常用的组织捣碎机，本发明优选转速在8000-12000 rpm范围内对明胶进行物理剪切。

对于物理剪切时间，由于组织捣碎机通常为高速组织捣碎机，为了避免对仪器电机等部件的损伤，同时为了避免明胶溶液的局部过热，本发明优选利用间歇式对明胶溶液进行处理。

作为本发明的一种优选技术方案，所述灭菌的方法包括高压蒸汽灭菌。

对于灭菌方式，从工业化角度出发，高压蒸汽灭菌为最优选的灭菌方式，优选121℃高压蒸汽灭菌。此种灭菌方式既可以灭菌又可以除去可能产生的热原。

第二方面，本发明提供了第一方面所述的制备方法得到的明胶类酶活保护剂。

本发明提供的明胶类酶活保护剂分子量较为均一，且分子量范围适中，粘度适中，能够有效地对降纤酶进行包裹性保护，同时不含或几乎不含小分子氨基酸或小分子明胶多肽，对降纤酶中间体药液无酶活放大作用，能够有效地进行中间体效价监控。

作为本发明的一种优选技术方案，所述明胶类酶活保护剂的分子量为40kD-100kD，主要集中分布在60kD-90kD范围内。

第三方面，本发明提供了第二方面所述的明胶类酶活保护剂在含酶制剂中的应用。

作为本发明的一种优选技术方案，所述含酶制剂包括降纤酶制剂，所述降纤酶制剂包括降纤酶冻干制剂和降纤酶注射液。

第四方面，本发明提供了一种降纤酶冻干制剂，所述降纤酶冻干制剂的组成成分包括降纤酶、右旋糖酐和第一方面所述的明胶类酶活保护剂。

作为本发明的一种优选技术方案，以所述降纤酶冻干制剂的定容后的中间体药液的总体积为100%计，所述右旋糖酐的质量浓度为1-5 wt%，例如2 wt%、3 wt%、4 wt%等，所述明胶类酶活保护剂的质量浓度为0.001-0.5 wt%，例如0.002 wt%、0.005 wt%、0.01 wt%、0.02 wt%、0.05 wt%、0.1 wt%、0.2 wt%、0.3 wt%、0.4 wt%等。

第五方面，本发明提供了一种降纤酶注射液，所述降纤酶注射液由第四方面所述的降纤酶冻干制剂的中间体药液经过定容、过滤除菌、分装得到。

目前常规的制药工艺中，对于降纤酶制剂的制备，通常包括：保护助剂的溶解、其他辅料的溶解，活性炭处理除去热原，降纤酶的溶解，辅料溶液和降纤酶药液的混合，中间体效价的监测、定容得到降纤酶的中间体药液的过程；如果将定容好的中间体药液进行除菌、分装、冻干、压盖封口等工艺，则得到降纤酶冻干制剂，也称之为注射用降纤酶；如果将定容好的中间体药液进行过滤除菌、分装、封口等，则得到降纤酶注射液。

本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：

（1）本发明提供的制备方法能够制备得到具有合适的分子量和粘度的明胶类酶活保护剂，能够对降纤酶的酶活力提供有效的包裹性保护，在降纤酶制剂的生产和长期储存过程中，提供紧密的保护骨架，阻止降纤酶分子之间的聚合，从而保护降纤酶酶活力的稳定；

（2）本发明提供的制备方法能够使得到的明胶类酶活保护剂中不含或几乎不含各类游离氨基酸和小分子明胶多肽，最大限度的给含酶制剂提供了一个干净的药用辅料背景，且可以避免在生产过程中对降纤酶的酶活放大效应；

（3）本发明提供的制备方法得到的明胶类酶活保护剂对于冻干过程的吹干效应可以大大减少，进一步地保护了酶活的稳定性；

（4）本发明提供的制备方法操作简单易行，提高了中间体和成品的质量控制，降低了宝贵生物资源的消耗，且充分考虑了工业流程的易操作性并且有效降低了资源能源消耗。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为随机挑选的4个制备例样品的HPLC图；

图2为对比例1提供的样品的HPLC图；

图3为对比例2提供的样品的HPLC图；

图4为不同明胶样品的SDS-PAGE电泳图；

图5为HPLC分子量Marker图；

图6为制备例3提供的样品与原料明胶的HPLC图；

图7为物理剪切后的明胶溶液，成品明胶类酶活保护剂和原料明胶的HPLC图；

图8为对比例3-4提供的样品的HPLC图；

图9为氨基酸空白的HPLC图；

图10为氨基酸工具包的HPLC图；

图11为明胶氨基酸测定的HPLC图；

图12为制备例3提供的样品的氨基酸测定HPLC图；

图13为对比例4提供的样品的氨基酸测定HPLC图；

图14为对比例3提供的样品的氨基酸测定HPLC图；

图15为制备例5提供的明胶类酶活保护剂活性炭处理前后的HPLC对比图；

图16为对比例3提供的水解明胶活性炭处理前后的HPLC对比图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

下述实验部分所涉及的原料均为商购，部分涉及的原料信息发明如下：

药用明胶：购自罗赛洛（温州）明胶有限公司，型号为220SH；右旋糖酐40：购自四川新开元制药有限公司；降纤酶：从尖吻蝮蛇毒中自提；水解明胶和部分水解明胶用药用明胶自制，参考关云山酸法水解明胶的试制青海大学学报 2001 19（1）：32-34，具体制备方法见对比例3-4。

对于下述性能测试：

酶活力检测：按照国家药品标准降纤酶 WS1-031-2000效价测定项进行；

HPLC、SDS-PAGE电泳：按照国家药品标准降纤酶 WS1-031-2000纯度检查项1、项2进行；

粘度测定：按照2020版中国药典第四部通则粘度测定法（0631）第一法测定；

氨基酸分析及含量测定：按照Elite-AAK氨基酸分析系统进行。

制备例1

本制备例提供了一种明胶类酶活保护剂的制备方法，如下：

（1）取1.0 g明胶置于50 ml 60℃的热水中，使其充分溶胀；

（2）待明胶充分溶解后，定容至100 ml，搅拌均匀后转移至低温高速组织捣碎机中，设置工作转速为10000 rpm，工作时间为10 min，间歇式处理；

（3）然后将处理后的明胶溶液进行过滤，121℃高压灭菌30 min、冻干，得到0.82 g明胶类酶活保护剂。

制备例2

本制备例提供了一种明胶类酶活保护剂的制备方法。

与制备例1的区别在于，本制备例中，明胶的添加量为10.0 g，得到8.6 g明胶类酶活保护剂。

制备例3

本制备例提供了一种明胶类酶活保护剂的制备方法。

与制备例2的区别在于，本制备例中，步骤（2）的工作时间为30 min，得到8.9 g明胶类酶活保护剂。

制备例4

本制备例提供了一种明胶类酶活保护剂的制备方法。

与制备例1的区别在于，本制备例中，明胶的添加量为5.0 g，得到4.4 g明胶类酶活保护剂。

制备例5

本制备例提供了一种明胶类酶活保护剂的制备方法。

与制备例4的区别在于，本制备例中，步骤（2）的工作时间为20 min，得到4.3 g明胶类酶活保护剂。

制备例6

本制备例提供了一种明胶类酶活保护剂的制备方法。

与制备例4的区别在于，本制备例中，步骤（2）的工作时间为30 min，得到4.3 g明胶类酶活保护剂。

制备例7

本制备例提供了一种明胶类酶活保护剂的制备方法。

与制备例1的区别在于，本制备例中，步骤（2）的工作时间为30 min，得到0.84 g明胶类酶活保护剂。

在上述制备例中，当明胶溶液的浓度达到10%时，若处理不及时容易发生果冻状的凝胶现象，经处理后的明胶溶液没有该现象。

对比例1

本对比例提供了一种明胶类酶活保护剂的制备方法。

与制备例1的区别在于，在本对比例中，步骤（2）的工作时间为5 min，得到0.87 g明胶类酶活保护剂。

对比例2

本对比例提供了一种明胶类酶活保护剂的制备方法。

与制备例2的区别在于，本对比例中，步骤（2）的工作时间为5 min，得到9.2 g明胶类酶活保护剂。

对比例3

本对比例提供了一种水解明胶作为酶活保护剂，制备方法如下：

（1）取8.0 g明胶置于50 ml 60℃的热水中，使其充分溶胀；

（2）待明胶充分溶解后，用1 M的盐酸调节pH至酸性，定容至100 ml；

（3）把明胶溶液置于121℃高压蒸汽酸性水解5小时，然后用1 M的NaOH调节pH到中性；

（4）最后经过过滤、冻干，得到6.2g水解明胶。

对比例4

本对比例提供了一种部分水解明胶作为酶活保护剂。

与对比例3的区别在于，本对比例中，步骤（3）的酸性水解时间为2 h，得到6.5 g部分水解明胶。

性能测试1

（1）随机挑选制备例1-7中得到的明胶类酶活保护剂样品进行HPLC检测，观察样品的分子量大小和分布，同时对对比例1-2得到的样品进行检测，结果如下：

图1为随机挑选的4个制备例样品的HPLC图，由图可知，本发明提供的制备方法得到的明胶类酶活保护剂具有一致性，其分子量大小和分子量分布高度吻合。

图2为对比例1提供的样品的HPLC图，图3为对比例2的样品的HPLC图，由图2-3可知，当物理剪切的时间过短时，分子量分布的均一性较差。

（2）对制备例3、对比例3、对比例4提供的样品进行SDS-PAGE电泳分析，同时以制备例使用的原料明胶做对比，对样品分子量分析，结果如下：

图4为不同明胶样品的SDS-PAGE电泳图，其中，最左侧电泳带为分子量Marker从上到下分子量依次为97400、66200、43000、31000、20100和14400，从左侧第二条电泳带起，从左至右依次为：原料明胶、原料明胶、制备例3、对比例4、对比例4、对比例3、对比例3。

由图可知，原料明胶样品的分子量主要集中在100 kD以上，本发明提供的明胶类酶活保护剂的分子量分布于100 kD-40 kD，主要集中于60kD-90kD之间；部分水解明胶和水解明胶集中于20 kD左右，在水解明胶中，小分子混合物占比大于部分水解明胶。

（3）对制备例3提供的样品和原料明胶进行HPLC检测，对分子量分析，结果如下：

表1

保留时间/min	5.275	7.359	8.075	8.514	8.957	10.174
							分子量/D	97400	66200	43000	31000	20100	14400

图5为HPLC分子量Marker图，表1为HPLC分子量Marker的保留时间；图6为制备例3提供的样品与原料明胶的HPLC图，由图可知，原料明胶的分子量大小主要集中分布于100kD以上、90kD左右和80kD左右三个区域；而经过本发明提供的制备方法处理的明胶的分子量大小发生了均质化，主要分布于80kD-90kD之间。

（4）对制备例3提供的样品、以及制备例3完成物理剪切尚未过滤灭菌的样品和原料明胶进行HPLC检测，对分子量分析，结果如下：

图7为物理剪切后的明胶溶液，成品明胶类酶活保护剂和原料明胶的HPLC图，由图可知，明胶的分子量大小的均质化主要发生在明胶的物理剪切过程，后续的处理过程（过滤、灭菌、冻干）对其性质变化没有显著的影响；且在处理过程中，没有产生小分子的明胶及分子量一万以下的明胶多肽和游离氨基酸。

（5）对对比例3-4提供的样品进行HPLC检测，对分子量分析，结果如下：

图8为对比例3-4提供的样品的HPLC图，由图可知，明胶发生酸性水解后，分子量分布集中向小分子方向移动，并生成大量的分子量一万以下的明胶多肽和游离氨基酸，水解程度越大，平均分子量越小，而小分子明胶多肽和游离氨基酸的含量越高。

（6）对制备例3、对比例3-4提供的样品以及原料明胶进行粘度测定，结果见表2：

表2

粘度测定从另一个侧面反映了明胶分子的大小变化和某些理化性质的变化，由表2可知，本发明提供的物理剪切的方法得到的明胶类酶活保护剂具有适当的粘度，即可以满足药品生产过程中液体流动性的需要，又可以满足制剂对冻干骨架紧密度的要求。

（7）利用HPLC检测，测定制备例3、对比例3-4中含有的氨基酸，同时与原料明胶进行对比，结果如下：

图9为氨基酸空白的HPLC图，图10为氨基酸工具包的HPLC图，图11为明胶氨基酸测定的HPLC图，图12为制备例3提供的样品的氨基酸测定HPLC图，图13为对比例4提供的样品的氨基酸测定HPLC图，图14为对比例3提供的样品的氨基酸测定HPLC图。由图9-14的对比可知，原料明胶和本发明实施例提供的明胶类酶活保护剂均不含有游离氨基酸，而部分水解明胶和水解明胶均含有游离氨基酸。

应用例1

本应用例提供了一种降纤酶注射液（规格10 BU/ml/支），由如下组分组成：

降纤酶总量 10000 BU；

右旋糖酐40 30 g（质量浓度3 wt%）；

制备例1提供的明胶类酶活保护剂 200 mg（质量浓度0.02 wt%）；

注射用水加至1000 ml。

制备方法如下：

（1）用天平秤取30 g右旋糖酐40，加适量注射用水溶解，加入0.5%的针用活性炭（除去右旋糖酐中可能存在的热原），共同煮沸30 min，待冷却到室温后过滤除去活性炭，滤液待用；

（2）准确称取制备例1提供的明胶类酶活保护剂200 mg，用适量注射用水溶解后待用；

（3）取10000 BU的降纤酶原料冻干粉，用少量无菌生理盐水静置溶解，之后加入步骤（1）的右旋糖酐40溶液和步骤（2）的明胶类酶活保护剂溶液合并混匀，中间体溶液取样监测效价，且根据监测数据按10 BU/ml/支标准调整定容体积，用注射用水定容，用0.22 μm的滤膜滤器过滤除菌，处理好的药液按1.0 ml/支分装到处理好的2R西林瓶中，压塞、轧盖、贴签备用，得到降纤酶注射液。

应用例2

本应用例提供了一种降纤酶冻干制剂（规格5 BU/ml/支），在制备过程中，包括如下原料：

降纤酶总量 5000 BU；

右旋糖酐40 30 g（质量浓度3 wt%）；

制备例2提供的明胶类酶活保护剂 20 mg（质量浓度0.002 wt%）；

注射用水加至1000 ml。

制备方法参照应用例1，与应用例1的区别在于，将处理好的药液按1.0 ml/支分装到处理好的2R西林瓶中后，加胶塞，入冻干机冻干，冻干结束后，压塞、轧盖、贴签备用，得到降纤酶冻干制剂。

应用例3

降纤酶总量 5000 BU；

右旋糖酐40 30 g（质量浓度3 wt%）；

制备例3提供的明胶类酶活保护剂 50 mg（质量浓度0.005 wt%）；

注射用水加至1000 ml。

制备方法参照应用例2。

应用例4

降纤酶总量 5000 BU；

右旋糖酐40 30 g（质量浓度3 wt%）；

制备例4提供的明胶类酶活保护剂 200 mg（质量浓度0.02 wt%）；

注射用水加至1000 ml。

制备方法参照应用例2。

性能测试2

（1）明胶类酶活保护剂与降纤酶中间体酶活力测定的影响

设置空白对照：5.5 BU/ml/支降纤酶+3%右旋糖酐40，参照应用例提供的制备降纤酶注射液的方法，制备空白对照；

待测样品：5.5 BU/ml/支降纤酶+3%右旋糖酐40，终浓度为0.001%、0.01%、0.02%、0.05%添加制备例5提供的明胶类酶活保护剂；

按照降纤酶质量标准效价测定项测定对照品和样品的酶活力，其中，标准曲线见表3，测定结果见表4：

表3

表4

由表4可知，与空白样品比较，本发明提供的明胶类酶活稳定剂对降纤酶中间体溶液的酶活力测定具有稳定作用，没有酶活放大效应。

（2）活性炭处理对降纤酶中间体及成品效价的影响

降纤酶冻干制剂的制备：右旋糖酐和明胶类酶活保护剂分别溶解于注射用水，二者混匀后利用活性炭除去热原，冷却至室温加入降纤酶浓溶液，并利用注射用水定容至5BU/ml/支降纤酶；按照下述内容制备降纤酶冻干制剂，对中间体药液以及成品的效价进行表征，结果见表5：

样品1：3%右旋糖酐40+0.01%对比例3提供的水解明胶，混匀后利用1%针用活性炭除热原，然后加入降纤酶溶液和注射用水定容至5BU/ml/支降纤酶；

样品2：3%右旋糖酐40+0.01%对比例3提供的水解明胶+注射用水+5 BU/ml/支降纤酶；

样品3：3%右旋糖酐40+0.01%制备例5提供的明胶类酶活保护剂，混匀后利用1%针用活性炭除热原，然后加入降纤酶溶液和注射用水定容至5 BU/ml/支降纤酶；

样品4：3%右旋糖酐40+0.01%制备例5提供的明胶类酶活保护剂+注射用水+5 BU/ml/支降纤酶；

表5

样品	投药量 (BU/ml/支)	中间体效价(BU/ml/支)	冻干制剂效价(BU/ml/支)
				样品1	5	11.02	5.13
样品2	5	13.8	7.51
				样品3	5	5.19	4.98
样品4	5	5.24	5.09

从表5可知，利用水解明胶作为酶活保护剂的药品稀释液分别用活性炭处理和无炭处理，中间体和冻干制剂效价差异比较大，推测可能的原因是活性炭处理吸附掉对降纤酶活力影响比较大的水解明胶中小分子明胶多肽和氨基酸；而本发明提供的明胶类酶活保护剂不受是否有炭处理的影响，对降纤酶中间体药液的酶活力测定没有影响。

（2-1）对制备例5提供的明胶类酶活保护剂、对比例3提供的水解明胶进行活性炭处理，探究活性炭处理前后的HPLC是否有变化，结果如下：

图15为制备例5提供的明胶类酶活保护剂活性炭处理前后的HPLC对比图，图16为对比例3提供的水解明胶活性炭处理前后的HPLC对比图；由图15和16的对比可知，水解明胶经活性炭处理后，水解明胶中分子量14.4kD以下的小分子明胶多肽和氨基酸更多的被活性炭吸附，水解明胶中的小分子明胶多肽和氨基酸含量大大降低，结合表5中的无炭处理的降纤酶中间体溶液和冻干制剂与活性炭处理的样品的酶活力比对，可以推断出：部分水解明胶和水解明胶对降纤酶中间体酶活力的虚拟放大效应主要来源于小分子明胶多肽和混合氨基酸，经活性炭处理后可以降低这种影响，但是处理不当会显著影响降纤酶制剂的酶活力保护效果；而本发明提供的明胶类酶活保护剂经活性炭处理后，其成分构成和分布均没有发生变化，其对降纤酶中间体溶液酶活力的测定均无影响。

综上，对于水解明胶或部分水解明胶作为酶活力保护剂而言，其成分构成是一个混合物，主要成分包括明胶、明胶多肽及水解而来的各种氨基酸，分子量大多集中于10-20kD，而降纤酶分子量为36000D±5000D，其酶活力失活主要原因在于降纤酶在极低浓度的条件下（生产过程中其药液浓度为2-5 μg/ml），分子构象的完全展开引发聚合而导致，水解明胶的分子量大小不足以对降纤酶分子提供完全的包裹保护作用，而且水解明胶中包括的混合多肽和各种氨基酸对于降纤酶中间体药液的酶活力具有显著的虚拟放大效应，这直接导致制剂生产过程中的中间体监测步骤失去了质量监控的意义，直接影响药品装量的准确性。

本发明提供的明胶类酶活保护剂不仅能够对降纤酶的酶活力提供有效的包裹性保护，在生产和长期储存过程中，提供紧密的保护骨架，阻止降纤酶分子之间的聚合；而且不具有酶活放大效应，能够实现对于中间体的有效监控；同时可以使冻干过程的吹干效应可以大大减少，进一步地保护了酶活的稳定性。因此，本发明提供的明胶类酶活稳定剂能够确保降纤酶的酶活稳定的同时实现中间体的有效监控，以及实现降纤酶制剂的存储稳定性。

（3）中间体药液的酶活力监测、成品效价检测、成品酶活力稳定性

参照应用例提供的制备方法，对于明胶类酶活保护剂分别按照表格中的投料量进行投料，同时右旋糖酐的投料量为3%，制备注射用降纤酶，装量按1.0ml/支分装，对药液中间体以及成品的效价进行检测结果见表6，成品稳定性的结果见表7：

注：

1. 炭吸附的添加时间为：当仅添加右旋糖酐时，在制备右旋糖酐溶液后利用活性炭除去热原；若还包括保护剂的添加，则需要将右旋糖酐溶液与保护剂溶液混合后，混合液利用活性炭除去热原，处理后的溶液再与降纤酶溶液混合定容；

2. 效价比为中间体和装药量的效价比，即效价比=中间体效价/装药量效价；

3. 空白对照指的是，仅添加3%的右旋糖酐，不额外添加其他酶活保护剂。

由表6和表7可知，部分水解明胶和水解明胶作为保护剂，中间体效价监测都有效价虚拟放大效应，而采用活性炭处理工艺，虽然能够一定程度上减少效价放大效应，但是容易造成保护剂损失，从而导致制剂的活力持续长期的损失。

虽然加大酶活保护剂的投量，同时配合降低或取消活性炭处理工艺，效价保护效果趋于改善，但是这些措施增加了匹配保护剂投量、活性炭用量、炭处理时间等工艺参数调整的难度和复杂度，同时也会由此产生更显著的降纤酶中间体效价监测的虚拟放大效应。

而本发明提供的明胶类酶活保护剂，活性炭处理工艺对其成分及分布没有显著影响，酶活保护效果稳定；无炭处理工艺的保护剂各个浓度范围内均无降纤酶中间体监测的虚拟放大效应，且制剂保持酶活力长期稳定。

需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所发明的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种明胶类酶活保护剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

（1）取明胶置于水中充分溶解；

（2）充分溶解的明胶溶液进行定容，定容后的明胶溶液的浓度为1-10%（w/v），然后利用组织捣碎机进行物理剪切，物理剪切的时间为10-30 min，组织捣碎机的转速为10000 rpm；

（3）物理剪切后的明胶溶液进行过滤、高压灭菌、冻干，得到所述明胶类酶活保护剂。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述高压灭菌的方法为高压蒸汽灭菌。

3.权利要求1或2所述的制备方法得到的明胶类酶活保护剂。

4.根据权利要求3所述的明胶类酶活保护剂，其特征在于，所述明胶类酶活保护剂的分子量为40kD-100kD。

5.权利要求3或4所述的明胶类酶活保护剂在降纤酶制剂中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述降纤酶制剂为降纤酶冻干制剂或降纤酶注射液。

7.一种降纤酶冻干制剂，其特征在于，所述降纤酶冻干制剂的组成成分包括降纤酶、右旋糖酐和权利要求3或4所述的明胶类酶活保护剂。

8.根据权利要求7所述的降纤酶冻干制剂，其特征在于，以所述降纤酶冻干制剂的定容后的中间体药液的总体积为100%计，所述右旋糖酐的浓度为1-5%（w/v），所述明胶类酶活保护剂的浓度为0.001-0.5%（w/v）。

9.一种降纤酶注射液，其特征在于，所述降纤酶注射液由权利要求7或8所述的降纤酶冻干制剂的中间体药液经过定容、过滤除菌、分装得到。