CN113908151A - 奥利司他在制备治疗微孢子虫病的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及奥利司他在制备治疗微孢子虫病的药物中的应用,属于药物制备技术领域。本发明提供了奥利司他在制备治疗微孢子虫病的药物中的应用。奥利司他能够抑制无脊椎动物微孢子虫代表‑家蚕微粒子虫(Nosemabombycis)和虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei)的增殖,亦可抑制脊椎动物微孢子虫代表‑海伦脑炎微孢子虫(Encephalitozoonhellem)和兔脑炎微孢子虫(Encephalitozooncuniculi)的增殖。
Description
技术领域
本发明涉及药物制备技术领域,具体涉及奥利司他在制备治疗微孢子虫病的药物中的应用。
背景技术
微孢子虫(Microsporidia)是一类专性细胞内寄生的真核微生物。这类病原的宿主范围广泛,可以感染几乎所有无脊椎动物和脊椎动物。感染家蚕的家蚕微粒子虫,感染对虾的虾肝肠胞虫和感染蜜蜂的蜜蜂微孢子虫等均严重威胁畜牧水产行业。虽然微孢子虫一般不感染免疫系统正常的人群,但是可以感染免疫力较低的人群,例如艾滋病患者、器官移植者和先天遗传性免疫缺陷病患者等,由兔脑炎微孢子虫和海伦脑炎微孢子虫等微孢子虫引起的病例的报道频率也越来越高。
目前临床上可用于治疗人类微孢子虫病的药物为阿苯达唑和烟曲霉素。由于烟曲霉素具有一定的副作用,目前仅在美洲被批准用于人类和动物微孢子虫治疗,在欧盟和我国该药并未被批准使用。驱虫药阿苯达唑虽然被证实可以抑制微孢子虫的增殖,但是停药后往往会存在复发的现象。目前我国批准使用多菌灵用于家蚕制种过程中微孢子虫病的防治,但是该化合物有肝脏与生殖毒性,并不适用于人类与畜牧生产。因此,亟待开发出一种安全有效的广谱抗微孢子虫药物,用于治疗人与动物微孢子虫病。
发明内容
本发明的目的在于提供奥利司他在制备治疗微孢子虫病的药物中的应用。本发明制备得到的药物能够有效治疗微孢子虫病,抑制微孢子虫的增殖。
本发明提供了奥利司他在制备治疗微孢子虫病的药物中的应用。
本发明还提供了奥利司他在制备抑制微孢子虫增殖的药物中的应用。
优选的是,所述微孢子虫包括:无脊椎动物微孢子虫和/或脊椎动物微孢子虫。
优选的是,所述无脊椎动物微孢子虫包括家蚕微粒子虫和/或虾肝肠胞虫。
优选的是,所述脊椎动物微孢子虫包括海伦脑炎微孢子虫和/或兔脑炎微孢子虫。
本发明提供了奥利司他在制备治疗微孢子虫病的药物中的应用。奥利司他(Orlistat)为一种肥胖症治疗药。与常见的减肥药不同,其靶点为胃肠道脂肪酶,通过与胃、胰脂肪酶的丝氨酸残基结合使其脂肪酶失活,阻止三酰甘油水解为游离脂肪酸和单酰基甘油酯,减少对膳食中脂肪的吸收。目前奥利司他主要用于适度饮食控制和运动锻炼的肥胖症和超重者,包括已经出现与肥胖相关的危险因素的患者的长期治疗。本发明令人惊讶地发现奥利司他对可以感染家蚕的家蚕微粒子虫,可以感染对虾的虾肝肠胞虫,可以感染人类和其他哺乳动物的兔脑炎微孢子虫和海伦脑炎微孢子虫均具有良好的抑制能力。
附图说明
图1为本发明提供的细胞水平添加奥利司他对家蚕微粒子虫增殖的影响结果图;
图2为本发明提供的细胞水平添加奥利司他对兔脑炎微孢子虫增殖的荧光显微观察结果图;
图3为本发明提供的细胞水平添加奥利司他对兔脑炎微孢子虫增殖的影响结果图;
图4为本发明提供的细胞水平添加奥利司他对海伦脑炎微孢子虫增殖的影响结果图;
图5为本发明提供的饲料中添加奥利司他对虾肝肠胞虫增殖的影响结果图。
具体实施方式
本发明提供了奥利司他在制备治疗微孢子虫病的药物中的应用。为获得安全高效的微孢子虫治疗药物,本发明以草地贪夜蛾SF9III细胞系-家蚕微粒子虫感染模型为基础,测试了大部分目前临床上常用的化合物,最终意外发现奥利司他对家蚕微粒子虫、海伦脑炎微孢子虫、兔脑炎微孢子虫和虾肝肠胞虫的增殖有显著的抑制效果。奥利司他是一种在临床上广泛使用的减肥药,生产成本低,安全性高且副作用少。本发明对奥利司他的来源没有特殊限定,采用本领域技术人员熟知的常规奥利司他市售产品即可。
本发明还提供了奥利司他在制备抑制微孢子虫增殖的药物中的应用。奥利司他能够抑制无脊椎动物微孢子虫代表-家蚕微粒子虫和虾肝肠胞虫的增殖,亦可抑制脊椎动物微孢子虫代表-海伦脑炎微孢子虫和兔脑炎微孢子虫的增殖。
在本发明中,所述微孢子虫包括:无脊椎动物微孢子虫和/或脊椎动物微孢子虫。
在本发明中,所述无脊椎动物微孢子虫包括家蚕微粒子虫和/或虾肝肠胞虫。
在本发明中,所述脊椎动物微孢子虫包括海伦脑炎微孢子虫和/或兔脑炎微孢子虫。
本发明所述应用中,当所述微孢子虫为家蚕微粒子虫时,奥利司他的添加终浓度优选为0.8~1.5μg/mL,更优选为1μg/mL。当所述微孢子虫为虾肝肠胞虫时,奥利司他的添加终浓度优选为3~12mg/kg,更优选为6mg/kg。当所述微孢子虫为海伦脑炎微孢子虫时,奥利司他的添加终浓度优选为8~12μg/mL,更优选为10μg/mL。当所述微孢子虫为兔脑炎微孢子虫时,奥利司他的添加终浓度优选为8~12μg/mL,更优选为10μg/mL。
试验结果表明,奥利司他处理的实验组中,病原含量均远低于仅添加等量溶剂的对照组,证明添加奥利司他可以显著抑制相应微孢子虫的增殖。
下面结合具体实施例对本发明所述的奥利司他在制备治疗微孢子虫病的药物中的应用做进一步详细的介绍,本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
SF9III细胞传代培养
(1)显微观察确定草地贪夜蛾细胞SF9III处于良好的生长状态与较高的细胞汇合度;
(2)用无菌玻璃吸管轻轻吹起贴壁的细胞;
(3)将细胞悬液转移至离心管中,1000g离心5min,弃上清;
(4)向离心管中添加1mL Grace昆虫细胞培养基,轻轻吹散细胞沉淀;
(5)取两个新的细胞培养瓶,各添加2mL培养基,然后分别添加500μL细胞悬液,轻轻混匀,静置2min,等待细胞贴壁后弃去培养基;
(6)在新细胞培养瓶中添加3mL Grace昆虫细胞培养基,做好标记,置于28℃恒温培养箱培养。
SF9III细胞铺孔及添毒
(1)打开12孔细胞培养板,每孔添加300μL培养基铺满孔底;
(2)向细胞培养瓶中添加1mL的Grace昆虫细胞培养基,用玻璃吸管(已灭菌)轻轻吹下贴壁细胞,吹打混匀,取50μL悬液滴入血球计数板后用显微镜进行直接计数;
(3)将4mL细胞悬液均匀分到12个样品孔中,轻轻摇匀,使细胞悬液充满孔底,静置3min,吸去培养基,添加600μL新的Grace昆虫细胞培养基;
(4)按照细胞:家蚕微粒子虫为1:20的比例吸取一定量的家蚕微粒子虫的成熟孢子悬液,3500g离心3min,弃上清;
(5)用0.1M的KOH溶液(以0.22μm无菌滤膜过滤除菌)处理孢子沉淀2min,随后2800g离心2min,弃去上清,用Grace昆虫细胞培养基重悬孢子沉淀后加入样品孔中,轻轻摇晃均匀。
奥利司他抑制家蚕微粒子虫增殖的能力评估
(1)按照前述方法进行细胞铺孔及添毒;
(2)将奥利司他以二甲基亚砜(DMSO)溶解为100mg/mL母液,加入样品孔中至终浓度1μg/mL,混合均匀后于28℃细胞培养箱培养;
(3)每隔两天将样品孔中的旧培养基转移至灭菌1.5mL离心管中,3500g离心3min后弃去上清;
(4)用新鲜的Grace昆虫细胞培养基重悬沉淀后,将其加回对应的样品孔中,然后重新加入奥利司他至终浓度1μg/mL,于28℃继续培养;
感染家蚕微粒子虫的SF9III细胞中总DNA的提取
(1)收集感染细胞培养液上清,5000g离心5min,弃去上清;
(2)向样品孔中加入500μL 0.25%胰蛋白酶,待细胞消化完成后,5000g离心5min收集细胞,与(1)中所取样品混合;
(3)向样品中加入400μL 2%十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液,重新悬浮细胞;
(4)加入20μL蛋白酶K(10mg/mL),吹打均匀,55℃孵育过夜;
(5)取出经酶消化的感染细胞样品,待其冷却至室温后,加入300μL苯酚:氯仿:异戊醇混合液(比例25:24:1),涡旋振荡7-8min,13000g,4℃离心10min,离心完毕后将上清液转移至新的离心管;
(6)再次加入300μL苯酚:氯仿:异戊醇混合液(比例25:24:1),涡旋振荡7-8min,4℃,13000g离心10min,离心完毕后将上清液转移至新的离心管;
(7)向离心管中加入300μL 100%异丙醇,-20℃放置1h,4℃,13000g离心10min,弃上清;
(8)加入1mL预冷的75%冰乙醇洗涤沉淀一次;
(9)弃去上清,待沉淀自然干燥后,加入50μL去离子水溶解,-20℃保存用于后续实验。
qPCR确定样品中病原量
按照表1所示配制反应体系,混合均匀后放入荧光定量PCR仪进行qPCR确定病原量。qPCR反应条件为:95℃5min;95℃10s,60℃30s,共40个循环。
反应体系如下:
表1反应体系
引物序列如下:
Nb-β-tubulin-qF:AGAACCAGGAACAATGGACG(SEQ ID NO.1);
Nb-β-tubulin-qR:AGCCCAATTATTACCAGCACC(SEQ ID NO.2)。
SF9III细胞感染家蚕微粒子虫后,本发明通过向培养液中添加终浓度1μg/mL奥利司他,在感染第九天后提取总DNA通过qPCR检测病原量,发现奥利司他处理组(Orlistat)中,病原含量远低于仅添加等量二甲基亚砜的溶剂对照组,结果如图1所示,说明奥利司他能够抑制家蚕微粒子虫的增殖。
实施例2
RK13细胞复苏和传代培养
(1)从液氮储罐中取出含有兔肾细胞RK13的冻存管,并将其置于37℃水浴中轻轻摇动,直至完全解冻;
(2)2000g离心5min,弃去细胞冻存液;
(3)以3mL预热的MEM培养基(添加1%5000U/mL青霉素-链霉素溶液和10%热灭活胎牛血清)重悬细胞,将细胞转移至细胞培养瓶中,置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养过夜;
(4)用倒置显微镜检查细胞的生长情况,每3天更换一次培养基;
(5)待培养瓶中细胞密度达到90%以上时,弃培养基并向培养瓶中添加1mL预热的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS),去除培养基中成分;
(6)弃去PBS,添加1mL预热的胰蛋白酶细胞消化液,置于37℃培养箱消化直到所有细胞从培养瓶壁分离,向培养瓶中加入1mL MEM培养基终止胰蛋白酶反应;
(7)取出悬液,以2000g离心5min后,弃去上清,用1mL预热的MEM培养基重悬细胞,将适量细胞转移至新的细胞培养瓶中,置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。
奥利司他抑制兔脑炎微孢子虫的能力评估
(1)按照上述方法消化细胞后,以每个样品孔5×104个细胞的密度将RK13细胞接种于24孔细胞培养板,每孔中加入以1mL含有10%胎牛血清的MEM培养基培养,置于37℃、5%CO2培养箱中过夜;
(2)第二天,将培养板中培养基替换为1mL含终浓度为10μg/mL奥利司他的新鲜MEM培养基;
(3)培养8小时后以兔脑炎微孢子虫与细胞比例为5:1的比例将兔脑炎微孢子虫的成熟孢子添加至样品孔中,轻轻摇晃混匀;
(4)在感染后的第3天和第6天,更换含有药物或溶剂的新鲜培养基,旧培养基上清中微孢子虫通过8000g,5min离心后,以新鲜培养基重悬后重新加回相应样品孔中。
寄生泡染色及荧光计数
(1)取对照组及药物处理孔第3天,第6天的细胞样品,弃去孔中培养基;
(2)500μLPBST(含有0.01%Tween20的PBS缓冲液)清洗3次后,以300μL4%多聚甲醛将样品固定12min;
(3)以500μLPBST将固定好的样品清洗3次,每次5min;
(4)按照1:1000比例添加荧光增白剂28(FluorescentBrightener 28)染色30min;
(5)完成染色后,以500μLPBST清洗3次,每次5min;
(6)在倒置荧光显微镜下对每个样品孔的随机20个视野进行拍照,对染色的寄生泡进行计数统计。
RK13细胞感染兔脑炎微孢子虫后,本发明通过向培养液中添加终浓度10μg/mL奥利司他,在感染第六天后在荧光显微镜下观察发现,在奥利司他处理的实验组(Orlistat)中代表病原寄生泡的蓝色荧光信号区无论是强度与数量均显著低于仅添加等量溶剂的对照组(Vehicle Control)(图2),通过计数寄生泡法检测病原量,发现使用奥利司他处理的实验组(Orlistat)中,病原含量远低于仅添加等量溶剂的对照组(Vehicle Control)(图3),说明奥利司他能够抑制兔脑炎微孢子虫的增殖。
实施例3
RK13细胞复苏和传代培养
(1)从液氮储罐中取出含有兔肾细胞RK13的冻存管,并将其置于37℃水浴中轻轻摇动,直至完全解冻;
(2)2000g离心5min,弃去细胞冻存液;
(3)以3mL预热的MEM培养基(添加1%5000U/mL青霉素-链霉素溶液和10%热灭活胎牛血清)重悬细胞,将细胞转移至细胞培养瓶中,置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养过夜;
(4)用倒置显微镜检查细胞的生长情况,每3天更换一次培养基;
(5)待培养瓶中细胞密度达到90%以上时,弃培养基并向培养瓶中添加1mL预热的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS),去除培养基中成分;
(6)弃去PBS,添加1mL预热的胰蛋白酶细胞消化液,置于37℃培养箱消化直到所有细胞从培养瓶壁分离,向培养瓶中加入1mL MEM培养基终止胰蛋白酶反应;
(7)取出悬液,以2000g离心5min后,弃去上清,用1mL预热的MEM培养基重悬细胞,将适量细胞转移至新的细胞培养瓶中,置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。
奥利司他抑制海伦脑炎微孢子虫的能力评估
(1)按照上述方法消化细胞后,以每个样品孔5×104个细胞的密度将RK13细胞接种于24孔细胞培养板,每孔中加入以1mL含有10%胎牛血清的MEM培养基培养,置于37℃、5%CO2培养箱中过夜;
(2)第二天,将培养板中培养基替换为1mL含终浓度为10μg/mL奥利司他的新鲜MEM培养基;
(3)培养8小时后以海伦脑炎微孢子虫与细胞比例为5:1的比例将海伦脑炎微孢子虫的成熟孢子添加至样品孔中,轻轻摇晃均匀;
(4)在感染后的第3天和第6天,更换含有药物或溶剂的新鲜培养基,旧培养基上清中微孢子虫通过8000g,5min离心后,以新鲜培养基重悬后重新加入至相应样品孔中。
寄生泡染色及荧光计数
(1)取对照组及药物处理孔第3天,第6天的细胞样品,弃去孔中培养基;
(2)500μLPBST清洗3次后,加入300μL4%多聚甲醛固定12min;
(3)以500μLPBST将固定好的样品清洗3次,每次5min;
(4)按照1:1000比例添加荧光增白剂28染色30min;
(5)完成染色后,以500μLPBST清洗3次,每次5min;
(6)在倒置荧光显微镜下对每个样品孔的随机20个视野进行拍照,对染色的寄生泡进行计数统计。
RK13细胞感染海伦脑炎微孢子虫后,本发明通过向培养液中添加终浓度10μg/mL奥利司他,在感染第六天后通过计数寄生泡法检测病原量,发现使用奥利司他处理的实验组(Orlistat)中(图4),病原含量远低于仅添加等量溶剂的对照组(Vehicle Control),说明奥利司他能够抑制海伦脑炎微孢子虫的增殖。
实施例4
感染对虾肝胰腺中总DNA的提取方法
1、取20只感染虾肝肠胞虫的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei),收集肝胰腺组织进行研磨后,取200μL组织研磨液,加入500μL 2%CTAB,20μL蛋白酶K(10mg/mL),缓慢颠倒20~20次,56℃孵育3h,隔半小时颠倒混匀。
2、加入400μL的苯酚:氯仿:异戊醇混合液(比例25:24:1),涡旋振荡1~2min,4℃,12000g离心10min,吸取上清置于新的1.5mL离心管中。
3、重复步骤2一次。
4、加入1倍体积-20℃预冷的异丙醇与吸取的上层液体混合,轻轻颠倒混匀,于-20℃放置30min,充分混匀后4℃,12000g离心10min,弃上清。
5、加入500μL的75%乙醇,轻轻颠倒混匀洗涤DNA沉淀。
6、重复步骤5一次,弃去上清。
7、将1.5mL离心管开盖放置5min,挥发剩余乙醇,加入50μL的去离子水溶解DNA,保存于-20℃
qPCR确定样品中病原量
按照表2所示配制反应体系,混合均匀后放入荧光定量PCR仪进行qPCR确定病原量。qPCR反应条件为:95℃5min;95℃10s,60℃30s,共40个循环。
反应体系如下:
表2反应体系
引物序列如下:
EHPPTP2-6F:AGCAGAGCCTCATAGAGAAAAACGT(SEQ ID NO.3);
EHPPTP2-6R:GCCTTTGTGTAGCAGTTTTTGGTTG(SEQ ID NO.4)。
本发明选取被虾肝肠胞虫感染的凡纳滨对虾,按照6mg/kg的比例向对虾饲料中拌入奥利司他,每日投喂带有药物的饲料(对照组投喂拌入等量溶剂的饲料),在给药12天后提取肝胰腺组织总DNA,运用qPCR法检测病原量,发现使用奥利司他处理的实验组(Orlistat)中(图5),病原含量远低于仅添加等量溶剂的对照组(Vehicle Control),说明奥利司他能够抑制虾肝肠胞虫的增殖。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 西南大学
<120> 奥利司他在制备治疗微孢子虫病的药物中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agaaccagga acaatggacg 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcccaatta ttaccagcac c 21
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcagagcct catagagaaa aacgt 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcctttgtgt agcagttttt ggttg 25
Claims (5)
1.奥利司他在制备治疗微孢子虫病的药物中的应用。
2.奥利司他在制备抑制微孢子虫增殖的药物中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述微孢子虫包括:无脊椎动物微孢子虫和/或脊椎动物微孢子虫。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述无脊椎动物微孢子虫包括家蚕微粒子虫和/或虾肝肠胞虫。
5.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述脊椎动物微孢子虫包括海伦脑炎微孢子虫和/或兔脑炎微孢子虫。
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Citations (2)
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WO2011151088A1 (en) * | 2010-06-04 | 2011-12-08 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e. V. | Use of orlistat for the anti-parasitic treatment of a parasitic disease |
CN112791083A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-05-14 | 镇江市高等专科学校 | 一种小分子化合物在制备防治或治疗蚕微粒子病药物中的应用 |
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2021
- 2021-11-29 CN CN202111435137.6A patent/CN113908151A/zh active Pending
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I. F. ABOU-EL-NAGA 等: "A new scope for orlistat: Effect of approved anti-obesity drug against experimental microsporidiosis", 《MEDICAL MYCOLOGY》 * |
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