CN113861269A - Dr8多肽类似物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一类可以用于治疗或预防肺纤维化和肾脏纤维化等相关疾病的DR8多肽类似物其制备方法和应用。本发明的DR8多肽类似物，其氨基酸序列如下：NH2‑Asp‑His‑Xaa3‑Xaa4‑Pro‑Gln‑Xaa7‑Xaa8‑CONH2，其中，Xaa3为Ala、D‑Asn或α‑(4‑Pentenyl)‑Ala；Xaa4为Ala、D‑Asn或α‑(4‑Pentenyl)‑Ala；Xaa7为Ala或D‑Ala；Xaa8为Ala或D‑Arg。本发明的DR8多肽类似物用量低、稳定性高、安全无毒、制备成本低，可推广性更高；解决了DR8稳定性较差、生物利用度和药效低的问题。

Description

DR8多肽类似物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体的，涉及一种DR8多肽类似物，本发明还涉及上述DR8多肽类似物的制备方法及其在肺纤维化和肾脏纤维化等相关疾病的预防和/或治疗中的用途。
背景技术
肺纤维化(Pulmonary fibrosis，PF)是由多种急慢性病变引起的肺脏组织内纤维结缔组织增多和实质细胞减少的共性病理变化，呈进行性发展。纤维化导致的肺功能衰竭是患者致残、死亡的主要原因，患者确诊后中位存活时间只有3-5年。随着大气环境的不断恶化，放射学检查、治疗及多种疾病的化学药物治疗的不断增多，近年来发病率呈逐年上升趋势，对人类的健康和危害极大，但至今无有效的药物能逆转肺纤维化的自然过程及其终末结局，FDA批准的两种治疗肺纤维化药物吡非尼酮和尼达尼布能够减缓肺功能下降和疾病进展，但无法逆转和治愈肺纤维化，并且存在半衰期短，副作用大，剂量高的缺点。
肺纤维化的发病机制尚不明确，目前研究认为肺泡上皮细胞发生的反复微小损伤导致炎症细胞的浸润，并且产生多种生长因子、细胞因子和趋化因子，诱导成纤维细胞增生，趋化循环纤维细胞到损伤部位，刺激上皮间质转化，使成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，形成纤维细胞灶，分泌过量的胞外基质，沉积于基底膜，导致纤维瘢痕形成，反复的肺组织修复与重建促使蜂窝状囊肿的形成和肺结构的破坏，最终导致纤维化和功能丧失。
肾脏纤维化是由多种原因引起的进行性疾病，主要特征是肾组织内细胞外基质成分的过度积聚，引起瘢痕形成、肾小管萎缩及毛细血管和足细胞丢失等结构损伤，导致肾功能下降甚至丧失，最终发展为终末期肾病。终末期肾病患者只能通过透析或肾移植维持生命，严重影响患者生活质量。肾脏发生损伤时，局部趋化因子激活炎症反应，募集炎症细胞合成分泌大量炎性因子，刺激巨噬细胞和肾小管上皮细胞等细胞产生大量促纤维化因子，使成纤维细胞和系膜细胞活化，同时诱导上皮间充质转化和内皮间充质转化等过程转化为肌成纤维细胞，导致细胞外基质合成和降解出现失衡，肾脏结构破坏，最终导致肾脏纤维化和肾功能丧。
DR8(DHNNPQIR)是Xu等2017年报道的从菜籽蛋白中分离提取的抗氧化多肽，通过增强谷胱甘肽过氧化物酶活性清除自由基，从而减轻自由基对机体的损伤，并且可以清除细胞内活性氧(ROS)，对易过氧化的脂质起保护作用，从而发挥抗氧化活性。现有技术将DR8用于治疗肺纤维化与肾脏纤维化的结果显示DR8可有效改善肺脏与肾脏纤维化，但是DR8仍存在稳定性较差、生物利用度低、药效有待提高的问题。
发明内容
针对以上问题，本发明的目的在于提供一种DR8多肽类似物。
本发明的再一目的在于提供所述DR8多肽类似物的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述DR8多肽类似物的应用。
根据本发明具体实施方式的DR8多肽类似物，其氨基酸序列如下所示：
NH2-Asp-His-Xaa3-Xaa4-Pro-Gln-Xaa7-Xaa8-CONH2，其中，
Xaa3为Ala、D-Asn、Asn或α-(4-Pentenyl)-Ala；Xaa4为Ala、D-Asn、Asn或α-(4-Pentenyl)-Ala；Xaa7为Ala、D-Ala或Ile；Xaa8为Ala、D-Arg或Arg。
优选的，所述Xaa3为Ala、α-(4-Pentenyl)-Ala或D-Asn。
优选的，所述Xaa4为Ala、α-(4-Pentenyl)-Ala或D-Asn。
优选的，所述Xaa7为D-Ala或Ala。
优选的，所述Xaa8为Ala或D-Arg。
优选的，所述DR8多肽类似为如下化合物中的任一种：
化合物DR8-3A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
SEQ ID NO.1：NH2-Asp-His-Ala-Asn-Pro-Gln-Ile-Arg-CONH2；
化合物DR8-3D，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：
SEQ ID NO.2：NH2-Asp-His-(D-Asn)-Asn-Pro-Gln-Ile-Arg-CONH2；
化合物DR8-4A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：
SEQ ID NO.3：NH2-Asp-His-Asn-Ala-Pro-Gln-Ile-Arg-CONH2；
化合物DR8-4D，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：
SEQ ID NO.4：NH2-Asp-His-Asn-(D-Asn)-Pro-Gln-Ile-Arg-CONH2；
化合物DR8-7A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示：
SEQ ID NO.5：NH2-Asp-His-Asn-Asn-Pro-Gln-Ala-Arg-CONH2；
化合物DR8-8A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示：
SEQ ID NO.6：NH2-Asp-His-Asn-Asn-Pro-Gln-Ile-Ala-CONH2；
化合物DR8-8D，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示：
SEQ ID NO.7：NH2-Asp-His-Asn-Asn-Pro-Gln-Ile-(D-Arg)-CONH2；
化合物DR3penA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示：
SEQ ID NO.8：
NH2-Asp-His-[α-(4-Pentenyl)-Ala]-Asn-Pro-Gln-Ile-Arg-CONH2；
化合物DR4penA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示：
SEQ ID NO.9：
NH2-Asp-His-Asn-[α-(4-Pentenyl)-Ala]-Pro-Gln-Ile-Arg-CONH2；
化合物DR7dA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示：
SEQ ID NO.10：NH2-Asp-His-Asn-Asn-Pro-Gln-(D-Ala)-Arg-CONH2。
根据本发明具体实施方式的DR8多肽类似物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：采用Fmoc固相合成法，由羧基端向氨基端方向合成所述的DR8多肽类似物的多肽肽链对应的多肽树脂；
步骤2：切割步骤1合成的多肽树脂，脱除多肽肽链的全保护，收集含有粗制多肽肽链的切割液；
步骤3：纯化步骤2得到的粗制多肽肽链，获得DR8多肽类似物。
优选的，步骤1中，Fmoc固相合成法使用的树脂为MBHA树脂；
步骤2中，使用切割液切割步骤1合成的多肽树脂，所述切割液为TFA：Tis：H2O按体积比95：2.5：2.5组成。
本发明的再一目的在于提供一种组合物，其含有上述DR8多肽类似物，还包括药学上可接受的载体或辅料。载体可以是能够减少药物降解及损失、降低副作用的载体，例如胶束、微乳液、凝胶等；辅料可以是使药物制成适宜的剂型而加入的物料，例如缓冲剂、冻干用赋形剂等，液体配方一般是缓冲液、等渗溶液和水溶液。具体的，以DR8多肽类似物为活性成分添加药学上可接受的载体和/或辅料支撑药物组合物。
本发明的药物组合适用于各种给药方式，例如口服给药、经皮给药、静脉给药、肌肉给药、局部给药、经鼻给药等。根据所采用的给药方式，可将本发明的多肽类似物药物组合支撑各种合适的剂型，其中包含至少一种有效量的本发明的多肽类似物和至少一种药学上可接受的药用载体。
适当剂型的实例为片剂、胶囊、糖衣片剂、粒剂、口服溶液和糖浆、用于皮肤表面的油膏和药贴、气雾剂、鼻喷剂以及可以用于注射的无菌溶液。含有本发明多肽类似物的药物组合物可以制成溶液或者冻干粉以用于胃肠外给药，在使用前可加入适当溶剂或其他可要用的载体将粉末重新配制，液体配方一般是PBS缓冲液、生理盐水等渗溶液和水溶液。
本发明多肽类似物在药物组合物中的用量可以在较大范围内变动，本领域技术人员可以根据一些客观的因素如疾病的种类、病情严重程度、患者体重、剂型、给药途径等因素很容易地加以确定。
本发明提供上述DR8多肽类似物的应用，具体包括：
在制备预防肺纤维或治疗肺纤维疾病的药物中的应用，在制备预防或治疗肾脏纤维化疾病的药物中的应用。
本发明的DR8多肽类似物对肺纤维化疾病具有治疗和改善作用，可用于直接或间接治疗以肺纤维化为特征的病症；其中，肺纤维化疾病，包括特发性肺纤维化和职业暴露、不良生活习惯、创伤、放射性元素损伤、药物不良反应及病原微生物感染等多种因素引起的肺纤维化疾病。
本发明的多肽类似物对肾脏纤维化疾病具有治疗和改善作用，可用于直接或间接治疗以肾脏纤维化为特征的病症。其中，肾脏纤维化疾病，包括梗阻性肾病、糖尿病肾病、肾硬化、肾炎、肾脏肿瘤和不良生活习惯、药物不良反应及病原微生物感染等多种因素引起的肾脏纤维化疾病。
本发明的有益效果：
本发明合成了一系列DR8多肽类似物，并对这一系列DR8多肽类似物的药效作用展开研究，包括DR8多肽类似物对纤维化的体外活性、体外抑制效应、改善治疗作用等活性指标进行评价，还包括DR8多肽类似物的血清稳定性、细胞毒性、小鼠的急性毒性进行研究。结果显示，与母肽DR8相比，筛选得到的DR8多肽类似物DR8-3A、DR8-3D、DR8-4A、DR8-4D、DR8-7A、DR8-8A、DR8-8D、DR7dA、DR3penA及DR4penA，各方面的活性指标均优于母肽，稳定性和安全性也优于母肽。由此证明，本发明的DR8多肽类似物可以用于制备预防或治疗肺纤维化疾病和肾脏纤维化疾病的药物。
本发明通过具有较小甲基侧链的丙氨酸替换母肽DR8中特定位点的氨基酸，从而改变多肽的空间位阻，作为疏水性氨基酸在自身周围形成疏水微环境，促进与非极性自由基和不饱和脂肪酸的相互作用，增加了肽与脂质靶标或膜脂双层之间的相互作用，有利于多肽进入细胞内部更好的发挥作用。
由于蛋白酶在体内识别的氨基酸是天然L-氨基酸，D型基酸对内源性肽酶的敏感性较弱，因此用D-氨基酸取代L-氨基酸后，多肽在血清中的稳定性提高。另外，D型氨基酸替换可以提高多肽在体内的活性。
因此，母肽DR8第3、4、7、8位氨基酸替换为丙氨酸或相应D型氨基酸后，抗纤维化活性以及稳定性均有所提高。
基于该位点疏水性的增加和空间位阻及由此引起的构象改变与抗纤维化活性密切的相关性，在第3、4位引入丙氨酸结构类似的非天然疏水性氨基酸α-(4-戊烯)-丙氨酸(α-(4-pentenyl)-Ala)，第7位引入D型丙氨酸(D-Ala)，由于非天然氨基酸同样无法被体内的蛋白酶识别，因此非天然氨基酸的引入能够改善多肽药物的稳定性，对于提高多肽的活性以及降低毒性也有重要的作用。结果表明在引入非天然疏水性氨基酸α-(4-pentenyl)-Ala以及D-Ala后，DR8多肽类似物的疏水性、稳定性以及抗纤维化活性明显增强。
本发明经化学改造筛选出的DR8多肽类似物DR8-3A、DR8-3D、DR8-4A、DR8-4D、DR8-7A、DR8-8A、DR8-8D、DR7dA、DR3penA及DR4penA具有更好的抗肺纤维化疾病和肾脏纤维化疾病生物学活性；与母肽DR8和对照药物相比，用量显著降低，稳定性提高；与小分子化合物相比，类似物无毒，安全窗口大；与大分子蛋白相比，制备成本更经济，可推广性更高。
本发明中所用缩写具体含义如下：
Ala(简写A)为丙氨酸，Ile(简写I)为异亮氨酸，Pro(简写P)为脯氨酸，Gln(简写Q)为谷氨酰胺，Arg(简写R)为精氨酸，Asn(简写N)为天冬酰胺，Asp(简写D)为天冬氨酸，His(简写H)为组氨酸，α-(4-pentenyl)-Ala为α-(4-戊烯)-丙氨酸。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见的，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。
图1为实施例2中各组对应的小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3提取蛋白的α-SMA和GAPDH蛋白表达的实验结果图，其中，图A-C中左图为α-SMA和GAPDH蛋白表达的Westernblot图，右图为分析得到的蛋白相对表达量的柱状图；图1A为受试物为DR8、DR8-1A至DR8-9A的实验结果图；图1B为受试物为DR8、DR8-1D至DR8-D的实验结果图；图1C为受试物为DR8、DR4dA、DR3d4dA、DR3penA、DR4penA、DR7dA的实验结果图。
图2为实施例3中各组作用人肺腺癌上皮细胞A549、胚胎成纤维细胞NIH3T3和肾小管上皮细胞HK-2后，纤维化相关蛋白表达的的实验结果图；图2A左图为对照组、诱导组以及实验组DR8-3D和DR8-8A作用A549细胞后Westernblot检测α-SMA、Fibronectin、Vimentin、GAPDH的蛋白表达的Westernblot图，图2A右图为左图分析得到的蛋白相对表达量的柱状图；图2B上图为对照组、诱导组以及实验组DR3penA(2.5μM、10μM)分别作用A549细胞、HK-2细胞后，α-SMA、Fibronectin、Vimentin、CollagenI、GAPDH的蛋白表达的Westernblot图，以及作用NIH3T3细胞后α-SMA、Fibronectin及GAPDH的蛋白表达的Westernblot图，图2B下图为对应上图结果分析得到的蛋白相对表达量的柱状图；图2C左图为对照组、诱导组以及实验组DR7dA(5μM、10μM)作用A549细胞、以及对照组、诱导组以及实验组DR7dA(2.5μM、10μM)作用NIH3T3细胞后，α-SMA、Vimentin、Fibronectin、CollagenI、GAPDH的蛋白表达的Westernblot图，图2C右图为对应左图结果分析得到的蛋白相对表达量的柱状图；
图3为实施例3中各组作用胚胎成纤维细胞NIH3T3后α-SMA蛋白表达表达情况图；图3A上图为对照组、诱导组以及实验组DR3penA作用细胞NIH3T3后，α-SMA、GAPDH的蛋白表达的Westernblot图，图3A下图为对应上图结果分析得到的蛋白相对表达量的柱状图；图3B上图为对照组、诱导组以及实验组DR4penA作用细胞NIH3T3后，α-SMA、GAPDH的蛋白表达的Westernblot图；图3B下图为对应上图结果分析得到的蛋白相对表达量的柱状图；图3C上图为对照组、诱导组以及实验组DR7dA作用细胞NIH3T3后，α-SMA、GAPDH的蛋白表达的Westernblot图；图3C下图为对应上图结果分析得到的蛋白相对表达量的柱状图；图3D上图为对照组、诱导组以及实验组DR8作用细胞NIH3T3后，α-SMA、GAPDH的蛋白表达的Westernblot图，图3D下图为对应上图结果分析得到的蛋白相对表达量的柱状图；
图4为实施例4中给药21天后各组小鼠肺组织病理切片HE染色结果；
图5为实施例4中给药21天后各组小鼠肺组织病理切片Masson染色结果；
图6为实施例4中给药21天后各组小鼠肺组织中相关蛋白表达结果图；其中，左图为正常组、生理盐水组、博来霉素组、给药组、吡非尼酮阳性对照组作用小鼠后，Westernblot检测α-SMA、Fibronectin、Vimentin、CollagenI、GAPDH蛋白的的Westernblot图，右图为对应左图结果分析得到的蛋白相对表达量柱状图；
图7为实施例5中给药7天后各组小鼠的生化指标水平检测结果图；图7A为实施例5中给药7天后各组小鼠的血肌酐水平；图7B为实施例5中给药7天后各组小鼠的血尿素氮水平；图7C为实施例5中给药7天后各组小鼠的尿蛋白肌酐比值；
图8为实施例5中给药7天后各组小鼠肾脏组织病理切片HE和Masson染色结果；
图9为实施例5中给药7天后各组小鼠肾组织中α-SMA，Vimentin，Fibronectin蛋白表达的Westernblot图片及蛋白相对表达量柱状图，其中左图为Westernblot图，右图为对应左图结果分析得到的蛋白相对表达量柱状图；
图10为实施例7中各组的细胞存活率结果；其中，上图为NIH3T3细胞和HK-2细胞的存活率，下图为A549细胞的存活率；
图11为实施例8中单次给药后各组小鼠肝脏和肾脏组织HE染色结果；
图12为实施例8中单次给药DR3penA(0.5-62.5mg/kg)后各组小鼠的肝肾功能指标水平图；图12A为各组小鼠的谷草转氨酶水平；图12B为各组小鼠的谷丙转氨酶水平；图12C为各组小鼠的血尿素氮水平；图12D为各组小鼠的血肌酐水平；
图13为实施例8中单次给药DR3penA(5000mg/kg)后各组小鼠的肝肾功能指标水平图；图13A为各组小鼠的谷草转氨酶水平；图13B为各组小鼠的谷丙转氨酶水平；图13C为各组小鼠的血尿素氮水平；图13D为各组小鼠的血肌酐水平。
具体实施方式
为使本发明的优点和技术方案更加清楚，下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其他实施方式，都属于本发明所保护的范围。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。除非另有说明，否则所用试剂或仪器均可以通过市场购置获得。
材料与方法：
下述实施例中所述实验条件和实验方法，如无特殊说明，均为常规条件和方法，所述试剂或仪器，均可从商业途径获得。
其中，Westernblot结果采用EvolutionCapt软件灰度分析蛋白表达量，GraphPadPrism8.0软件进行统计和分析，数据以平均值±标准差(Mean±SD)表示，并通过单因素方差分析和Tukey检验进行显著性差异分析，TGF-β1组与对照组相比，**P＜0.01，*P＜0.05；模型组与对照组相比，**P＜0.01，*P＜0.05；给药组与模型组相比，##P＜0.01，#P＜0.05。
实施例1、化合物的制备
步骤1：化合物的合成采用Fmoc固相合成法，由羧基端向氨基端方向合成，具体步骤如下：
(1)MBHA树脂的活化：称取树脂加入适量DCM在摇床上溶胀30min，抽干后加入DMF清洗3次，每次3min；
(2)茚检：在试管中加入茚三酮：吡啶：苯酚＝1：2：1的茚检试剂，蘸取少许树脂于其中，沸水浴3min，若茚检结果为黄色，表明树脂正常；
(3)树脂脱保护：加入含有3％重蒸哌啶的DMF溶液脱去保护基团，抽去残留试剂，加入DMF清洗，每次3min，重复4次，抽去残余试剂；
(4)茚检：在试管中加入茚三酮：吡啶：苯酚＝1：2：1的茚检试剂，取少量树脂于试管，沸水浴3min，若茚检结果为蓝紫色则证明保护基已脱去；
(5)氨基酸缩合反应：在烧杯中称取3倍量的待缩合的氨基酸和HOBT，少量DMF溶解，加入6倍过量的DIEA充分溶解，最后加入3倍量HBTU后立即倒入树脂中，搅拌1h，抽干溶剂，用DMF清洗3min，重复3次；
(6)茚检：若茚检结果为黄色，则表明缩合成功；
(7)重复步骤(3)(4)(5)(6)按照化合物中氨基酸序列的顺序依次缩合，直至待合成化合物的全部氨基酸缩合完成，得到多肽肽链：NH2-Asp-His-Xaa3-Xaa4-Pro-Gln-Xaa7-Xaa8-CONH2；
步骤2：切割多肽肽链：肽链合成后脱保护，DCM清洗树脂3min，重复2次；甲醇清洗3min；DCM洗3min；最后甲醇洗3min，重复2次。抽干树脂3h至粉末状。配制TFA：Tis：H2O＝95：2.5：2.5(V/V/V)的切割液，加入到树脂中切割3h，收集切割液；
步骤3：多肽肽链的纯化：
用旋转蒸发仪旋蒸切割液，之后用预冷的冰乙醚进行沉淀，加入去离子水萃取，分液漏斗收集水相分装至50mL的烧杯中，于-80℃冰箱过夜冻存后进行冷冻干燥处理，得到粗肽。
化合物的制备纯化：
(1)称取约40mg的粗肽溶解于去离子水制成多肽溶液，待完全溶解之后用0.45μm规格滤器除去多肽溶液中不溶性物质，洗脱溶剂(乙腈和去离子水)中加入0.1％TFA；
(2)高效液相色谱使用C18反向制备柱100％乙腈冲洗至谱线平稳，5％乙腈初始浓度进行平衡，设置流量梯度后进样；
(3)进样后，检测220nm处的吸收峰，收集主峰，最终将收集到的组分进行标记，用保鲜膜密封，扎排气孔，于-80℃冰箱过夜冻存后进行冷冻干燥处理，得到化合物；基于以上合成步骤，合成本发明的如下化合物(表1)。
(4)冻干后取少量化合物溶解，C18反向分析柱以5％-95％乙腈/去离子水洗脱30min，220nm色谱图峰面积积分统计纯度，化合物纯度均＞95％，并使用质谱表征鉴定分离出的产物，确认质子化分子离子峰的m/z值(表1中的测量m/z)，并将测量m/z与分子理论m/z比较，确认合成纯化的产物为目标产物，表1分别给出了实施例1所合成的化合物结构、理论m/z以及测量m/z。
表1、实施例1所合成的化合物结构及质谱鉴定结果：
Figure BDA0003214319120000101
Figure BDA0003214319120000111
表1中涉及的下划线标记的氨基酸表示D型氨基酸。
实施例2、将实施例1得到的化合物作为受试物进行纤维化的体外活性筛选实验
选用小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3细胞株，研究并观察受试物对转化生长因子TGF-β1诱导的NIH3T3细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)表达的作用。
将NIH3T3细胞铺板于6孔板，用DMEM+10％FBS+1％双抗培养基(ThermoFisher)在37℃，5％CO2条件下培养24h，更换为无血清培养基培养12h后，加入5ng/mLTGF-β1和80μM受试物共同作用细胞48h后提取细胞总蛋白，Westernblot检测α-SMA的蛋白表达水平。
实验包括：
空白对照组(图1中标记为Control，培养基中未添加TGF-β1和受试物)；
诱导组(图1中标记为TGF-β1，培养基中加入5ng/mLTGF-β1)；
实验组(图1中标记为实施例1中合成的化合物的名称DR8至DR7dA，培养基中加5ng/mLTGF-β1和80μM对应的化合物)。
图1为对照组和受试物作用NIH3T3细胞后，Westernblot检测α-SMA和GAPDH的蛋白表达结果以及分析得到的α-SMA蛋白的相对表达量。
图1A为空白对照组、诱导组、实验组(受试物为DR8、DR8-1A至DR8-9A)中α-SMA和GAPDH的蛋白表达结果(左图)以及分析得到的α-SMA蛋白的相对表达量(右图)。
图1B为空白对照组、诱导组、实验组(受试物为DR8、DR8-1D至DR8-D)中α-SMA和GAPDH的蛋白表达结果(左图)以及分析得到的α-SMA蛋白的相对表达量(右图)。
图1C为空白对照组、诱导组、实验组(受试物为DR8、DR4dA、DR3d4dA、DR3penA、DR4penA、DR7dA)中α-SMA和GAPDH的蛋白表达结果(左图)以及分析得到的α-SMA蛋白的相对表达量(右图)。
通过比较各图中α-SMA蛋白的相对表达量，可见与TGF-β1诱导组相比，图1A中受试物DR8-3A、DR8-4A、DR8-7A、DR8-8A及DR8-9A，图1B中受试物DR8-3D、DR8-4D、DR8-8D及DR8-D，图1C中受试物DR3penA、DR4penA、DR7dA在浓度为80μM时，α-SMA蛋白的相对表达量明显低于诱导组的α-SMA蛋白的相对表达量，表明上述化合物显示出显著抑制TGF-β1诱导的α-SMA蛋白表达的效果。将筛选得到的以上化合物做以下进一步的性能实验。
实施例3、将实施例1得到的化合物DR8-3D、DR8-8A、DR3penA、DR4penA及DR7dA作为受试物进行纤维化的体外抑制效应实验
选用人肺腺癌细胞株A549、肾小管上皮细胞株HK-2以及胚胎成纤维细胞株NIH3T3，研究并观察受试物对不同细胞纤维化相关蛋白表达量的影响。
将A549细胞、HK-2细胞和NIH3T3细胞分别铺板于6孔板，分别用RPMI1640+10％FBS+1％双抗培养基、DMEM/F12+10％FBS+1％双抗培养基和DMEM+10％FBS+1％双抗培养基在37℃，5％CO2条件下培养24h，更换为无血清培养基培养12h，加入5ng/mLTGF-β1和不同浓度受试物共同作用A549细胞或NIH3T3细胞48h，或者作用HK-2细胞24h后提取细胞总蛋白，Westernblot检测α-SMA，Fibronectin，Vimentin，CollagenI的蛋白表达水平。
空白对照组(图2、3中标记为Control，培养基中未添加TGF-β1和受试物)；
诱导组(图2、3中标记为TGF-β1，培养基中加入5ng/mLTGF-β1)；
实验组(图2、3中标记为受试物名称DR8-3D、DR8-8A、DR3penA、DR7dA，培养基中加5ng/mLTGF-β1和80μM对应的受试物)
图2为对照组和受试物作用A549细胞、HK-2细胞和NIH3T3细胞后，Westernblot检测α-SMA、Fibronectin、Vimentin、CollagenI、GAPDH的蛋白表达结果以及分析得到的蛋白相对表达量。
图2A左图为对照组、诱导组以及实验组DR8-3D和DR8-8A作用A549细胞后Westernblot检测α-SMA、Fibronectin、Vimentin、GAPDH的蛋白表达结果。
图2A右图为左图分析得到的蛋白相对表达量的柱状图，由右图可知，实验组DR8-3D和DR8-8A作用的A549细胞后三种蛋白α-SMA、Fibronectin、Vimentin的相对表达量明显低于TGF-β1诱导组，表眀DR8-3D和DR8-8A能够显著抑制A549细胞中TGF-β1诱导的肺纤维化的效果。
图2B上图为对照组、诱导组以及实验组DR3penA(2.5μM、10μM)分别作用A549细胞、HK-2细胞后，α-SMA、Fibronectin、Vimentin、CollagenI、GAPDH的蛋白表达结果图，以及作用NIH3T3细胞后α-SMA、Fibronectin及GAPDH的蛋白表达结果图。
图2B下图为对应上图检测结果分析得到的蛋白相对表达量的柱状图，由下图可知，实验组不同浓度的DR3penA作用A549细胞和HK-2细胞后，四种蛋白α-SMA、Fibronectin、Vimentin、CollagenI的相对表达量明显低于TGF-β1诱导组，作用NIH3T3细胞后蛋白α-SMA、Fibronectin的相对表达量明显低于TGF-β1诱导组，表眀受试物DR3penA能够显著抑制A549细胞、HK-2细胞和NIH3T3细胞中TGF-β1诱导的肺纤维化和肾纤维化的效果。
图2C左图为对照组、诱导组以及实验组DR7dA(5μM、10μM)作用A549细胞、以及对照组、诱导组以及实验组DR7dA(2.5μM、10μM)作用NIH3T3细胞后，α-SMA、Vimentin、Fibronectin、CollagenI、GAPDH的蛋白表达结果图。
图2C右图为对应左图检测结果分析得到的蛋白相对表达量的柱状图，由右图可知，实验组不同浓度的DR7dA作用A549细胞和NIH3T3细胞后，四种蛋白α-SMA、Vimentin、Fibronectin、CollagenI的相对表达量明显低于TGF-β1诱导组，表眀受试物DR7dA能够显著抑制A549细胞和NIH3T3细胞中TGF-β1诱导的肺纤维化和肾纤维化的效果。
结果显示，与TGF-β1诱导组相比，受试物DR8-3D，DR8-8A，DR3penA，DR4penA和DR7dA显示出显著抑制A549细胞、HK-2细胞和NIH3T3细胞中纤维化相关蛋白α-SMA、Fibronectin、Vimentin或CollagenI表达的效果，说明受试物DR8-3D和DR8-8A具有抑制TGF-β1诱导的肺纤维化的效果，DR3penA、DR4penA和DR7dA具有抑制TGF-β1诱导的肺纤维化和肾纤维化的效果。
图3为实施例3中各组作用胚胎成纤维细胞NIH3T3后Westernblot检测α-SMA、GAPDH的蛋白表达结果图及分析得α-SMA相对表达量柱状图。
图3A上图为对照组、诱导组以及实验组DR3penA(1μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM)作用细胞NIH3T3后，α-SMA、GAPDH的蛋白表达结果图。图3A下图为对应上图检测结果分析得到的蛋白相对表达量的柱状图，由下图可知，实验组DR3penA以大于2.5μM的浓度作用NIH3T3细胞后，蛋白α-SMA的相对表达量均低于TGF-β1诱导组，表眀不同浓度的受试物DR3penA均能抑制NIH3T3细胞中TGF-β1诱导的肺纤维化和肾纤维化的效果。
图3B上图为对照组、诱导组以及实验组DR4penA(1μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM)作用细胞NIH3T3后，α-SMA、GAPDH的蛋白表达结果图。图3B下图为对应上图检测结果分析得到的蛋白相对表达量的柱状图，由下图可知，实验组DR4penA以大于2.5μM的浓度作用NIH3T3细胞后，蛋白α-SMA的相对表达量均低于TGF-β1诱导组，表眀不同浓度的受试物DR4penA均能抑制NIH3T3细胞中TGF-β1诱导的肺纤维化和肾纤维化的效果。
图3C上图为对照组、诱导组以及实验组DR7dA(1μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM)作用细胞NIH3T3后，α-SMA、GAPDH的蛋白表达结果图。图3C下图为对应上图检测结果分析得到的蛋白相对表达量的柱状图，由下图可知，实验组DR7dA以大于2.5μM的浓度作用NIH3T3细胞后，蛋白α-SMA的相对表达量均低于TGF-β1诱导组，表眀不同浓度的受试物DR7dA均能抑制NIH3T3细胞中TGF-β1诱导的肺纤维化和肾纤维化的效果。
图3D上图为对照组、诱导组以及实验组DR8(1μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM)作用细胞NIH3T3后，α-SMA、GAPDH的蛋白表达结果图。图3D下图为对应上图检测结果分析得到的蛋白相对表达量的柱状图。由下图可知，母肽DR8的有效作用浓度为20μM，而DR3penA、DR4penA和DR7dA的有效作用浓度为2.5μM，DR3penA、DR4penA和DR7dA的有效作用浓度明显降低，说明DR3penA，DR4penA和DR7dA的治疗效果和有效作用剂量均优于DR8。
实施例4、将实施例1得到的化合物DR8-3D，DR8-8A，DR3penA，DR4penA，DR7dA作为受试物对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的改善治疗作用实验
(1)受试物：化合物DR8-3D、DR8-8A、DR3penA、DR4penA及DR7dA。
(2)将104只雌性C57BL/6J小鼠(8周龄，体重约18g，购自兰州大学动物实验中心)，随机分为13组，每组8只。
分组：对照组包括：正常组(Normal)、生理盐水组(Saline)、博来霉素组(BLM，5mg/kg)、吡非尼酮阳性对照组(PFD，100mg/kg)、N-乙酰半胱氨酸阳性对照组(NAC，600mg/kg)；
给药组包括：DR8-3D(0.5mg/kg)、DR8-8A(0.5mg/kg)、DR3penA(0.5mg/kg)、DR3penA(2.5mg/kg)、DR4penA(0.5mg/kg)、DR4penA(2.5mg/kg)、DR7dA(0.5mg/kg)和DR7dA(2.5mg/kg)。
(3)肺纤维化模型建立：C57BL/6J小鼠经腹腔注射1％戊巴比妥钠溶液(50mg/kg)麻醉后，75％酒精对小鼠颈部皮肤消毒，无菌手术器械切开皮肤约1cm，钝性分离肌肉使气管暴露，气管内注射50μL博来霉素溶液(5mg/kg)诱导肺纤维化，得到肺纤维化小鼠。博来霉素诱导的肺纤维化模型，其表现特征为：肺泡结构破坏，肺泡腔变形，肺泡隔增宽，炎性细胞浸润以及肺间隔内成纤维细胞增生。生理盐水组小鼠以同样的方法在气管内注射等体积的生理盐水。
(4)正常组、生理盐水组和博来霉素组，给予肺纤维化小鼠皮下注射等体积无菌PBS；
给药组：给予肺纤维化小鼠皮下注射100μL相应化合物；
阳性对照组：给予肺纤维化小鼠灌胃100μL吡非尼酮或N-乙酰半胱氨酸；
连续给药21天后采集血样和肺组织样本，进行病理观察并提取肺组织蛋白检测肺纤维化相关蛋白的表达情况。
图4为给药21天后各组小鼠肺组织病理切片HE染色图片；结果显示，DR8-3D，DR8-8A，DR3penA，DR4penA，DR7dA给药组小鼠肺组织的炎症细胞浸润、肺泡结构破坏等肺组织损伤程度相比于BLM组小鼠得到明显改善。
图5为给药21天后各组小鼠组织病理切片Masson染色图片，结果显示，DR8-3D，DR8-8A，DR3penA，DR4penA，DR7dA给药组小鼠肺组织胶原纤维沉积现象相比于BLM组小鼠明显减少。
图6为给药21天后各组小鼠组织α-SMA、Fibronectin、Vimentin、CollagenI蛋白的表达情况。左图为正常组、生理盐水组、博来霉素组、给药组、吡非尼酮阳性对照组作用小鼠后，Westernblot检测α-SMA、Fibronectin、Vimentin、CollagenI、GAPDH蛋白的表达情况，右图为对应左图结果分析得到的蛋白相对表达量柱状图。结果表明，在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠中，给予DR8-3D、DR8-8A、DR3penA、DR4penA及DR7dA治疗后，α-SMA、Fibronectin、Vimentin、CollagenI蛋白表达显著降低，说明DR8-3D、DR8-8A、DR3penA、DR4penA及DR7dA能够抑制肺纤维化相关蛋白的表达。
由以上结果可知，本申请的化合物DR8-3D，DR8-8A，DR3penA，DR4penA，DR7dA能够显著改善博来霉素导致的肺纤维化，另外，DR8-3D，DR8-8A、DR3penA、DR4penA及DR7dA的用药剂量为0.5mg/kg，明显低于阳性对照吡非尼酮(100mg/kg)，且治疗效果相当。
使用的方法为：
HE染色：石蜡切片60℃烘箱中烤片1h。脱蜡水化：二甲苯I(20min)→二甲苯II(20min)→无水乙醇I(2min)→无水乙醇II(2min)→95％乙醇I(2min)→95％乙醇II(2min)→80％乙醇(2min)→温水冲洗2次(各2min)。染色：苏木素滴染(3min)→自来水冲洗2次(各2min)→0.5％盐酸酒精分化(2s)→自来水充分水洗→淡氨水返蓝(5-10s)→自来水充分水洗→5％伊红染色(5s)。脱水透明：95％乙醇I(15s)→95％乙醇II(15s)→无水乙醇I(15s)→无水乙醇II(15s)→晾干→二甲苯透明2次(各2min)→晾干后，中性树胶封片。
Masson染色：石蜡切片60℃烘箱中烤片1h。脱蜡水化→染色→Weigert铁苏木素染色(7min)→自来水冲洗→酸性乙醇分化(12s)→蓝化液返蓝(3min)，蒸馏水洗(1min)→丽春红品红染色(6min)→弱酸工作液(0.3％冰乙酸溶液)洗(1min)→苯胺蓝染色(2min)→弱酸工作液洗(1min)。脱水透明，晾干后中性树胶封片。
实施例5、将实施例1得到的化合物DR3penA作为受试物对UUO(单侧输尿管梗阻，unilateraluretericobstruction，简称UUO)诱导的小鼠肾脏纤维化的改善治疗作用实验
(1)受试物：化合物DR3penA。
(2)将40只雄性C57BL/6J小鼠(6周龄，体重约18g，购自兰州大学动物实验中心)，随机分为5组，每组8只。
分组：假手术组(Sham)，模型组(UUO)，卡托普利阳性对照组(Cap，20mg/kg)，给药组：DR3penA(0.5mg/kg)、DR3penA(2.5mg/kg)。
(3)肾纤维化模型建立：采用1％戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉后，模型小鼠分离左侧输尿管，用4-0缝合线结扎靠近肾盂处输尿管，并剪断结扎中间的输尿管；UUO诱导的肾脏纤维化模型，其表现特征为：肾积水、肾皮质变薄、肾小管扩张及炎性细胞浸润。经DR3penA治疗UUO模型小鼠后，对其血液、尿液及肾脏进行了肾功能检测及病理学分析。假手术组小鼠仅分离左侧输尿管，不予结扎。
(4)给药组，给予模型小鼠每日皮下注射0.5或2.5mg/kg化合物DR3penA；Cap组，给予模型小鼠腹腔注射20mg/kg卡托普利；UUO组小鼠为模型小鼠，UUO组小鼠和假手术组皮下注射等量无菌PBS溶液。给药7天后取材。
图7为实施例5中给药7天后各组小鼠的生化指标水平检测结果图；实验结果显示：UUO组的血肌酐、血尿素氮及尿蛋白肌酐比值明显升高，而在DR3penA治疗后，血肌酐、血尿素氮及尿蛋白肌酐比值均下降，说明DR3penA能改善肾功能。
图8为实施例5中给药7天后各组小鼠肾脏组织病理切片HE和Masson染色结果；图8的HE染色结果显示：与假手术组相比，UUO组肾脏明显损伤，出现肾小管管腔扩张，肾小管上皮细胞脱落，炎性细胞浸润等病理变化。DR3penA给药后治疗7天后，肾小管管腔扩张明显减轻，且炎性细胞浸润减少，有明显治疗和改善作用。此外，通过Masson染色标记纤维化区域，图8的Masson染色结果显示DR3penA治疗能够很好地减少胶原纤维沉积情况。
图9为给药7天后各组小鼠肾脏组织α-SMA、Vimentin、Fibronectin和GAPDH蛋白的表达情况(图9左图)及根据左图分析得到的GAPDH的相对表达量统计的柱状图(图9右图)，可知在UUO模型小鼠中，经DR3penA治疗后，肾脏中纤维化相关蛋白水平明显降低，说明DR3penA有很好地改善肾脏纤维化的作用。由以上结果可知，DR3penA能抑制和治疗UUO诱导的肾脏纤维化和肾脏损伤，且治疗效果明显优于阳性药物卡托普利，另外，DR3penA用药剂量(0.5mg/kg)低于卡托普利用药剂量(20mg/kg)，具有显著的保护效果。
实施例6、将实施例1得到的化合物DR8-3D、DR8-8A、DR3penA、DR4penA、DR7dA作为受试物进行血清稳定性实验
C57BL/6J小鼠麻醉后取血，全血8000rpm/min离心30min，吸取上层血清于-80℃冻存，实验前将冻存血清融化后37℃孵育2min。称取适量受试物，配制为浓度为10mM的母液，将224μL小鼠血清与56μL10mM受试物充分混匀后37℃孵育，分别在不同时间点(0min、15min、30min、60min、120min、240min)取样40μL，立即加入40μL冰乙腈，涡旋震荡后冰上静置10min。样品13000g离心15min，收集上清。C18反向分析柱以5％-95％乙腈/去离子水梯度洗脱30min，检测220nm处的吸收峰，通过对受试物峰面积积分并与0min时的对应受试物峰面积进行比较，确定不同时间点受试物的降解率以及半衰期。
表2、实施例6受试物半衰期
Figure BDA0003214319120000191
表2为受试物的半衰期，结果显示，与母肽DR8相比，受试物血清稳定性均有所提高。
实施例7、将实施例1得到的化合物DR8-3D、DR8-8A、DR3penA、DR4penA及DR7dA作为受试物进行细胞毒性评价
选用A549细胞株、NIH3T3细胞株和HK-2细胞株，研究并观察受试物对A549细胞、NIH3T3细胞和HK-2细胞毒性情况的检测。
将A549细胞、NIH3T3细胞和HK-2细胞分别接种到96孔板，分别用RPMI1640+10％FBS+1％双抗培养基、DMEM/F12+10％FBS+1％双抗培养基和DMEM+10％FBS+1％双抗培养基在37℃，5％CO2条件下进行培养24h，加入不同浓度的受试物，孵育24h后，加入10μLMTT(5mg/mL)溶液后孵育4h，吸弃培养基并加入150μLDMSO，振荡15min，酶标仪检测波长570nm处的吸光值。
图10为各组细胞存活率，其中上图为NIH3T3细胞和HK-2细胞的存活率，下图为A549细胞的存活率；结果表明，在0-160μM浓度范围内，受试物作用细胞后，细胞存活率与对照组保持基本相同水平，无显著性差异，表明受试物对细胞无显著毒性。
实施例8、化合物DR3penA对昆明小鼠的急性毒性评价
(1)受试物：化合物DR3penA。
(2)将60只昆明小鼠(体重约18g，购自兰州兽医研究所)，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。给药前禁食12h，自由饮水。
对照组：PBS，对照组小鼠皮下注射200μLPBS。
给药组：DR3penA(0.5mg/kg)，DR3penA(2.5mg/kg)，DR3penA(12.5mg/kg)，DR3penA(62.5mg/kg)，DR3penA(5000mg/kg)；给药组小鼠皮下注射200μL不同剂量DR3penA；
(3)观察并记录小鼠进食、饮水、体重、行为、死亡情况、小鼠状态以及异常症状出现、持续以及恢复时间，14天后取材进行大体解剖检查、血清学指标检测以及病理观察。
图11为各剂量DR3penA给药组小鼠肝脏和肾脏组织病理染色图片，结果表明，各剂量DR3penA(0.5mg/kg，2.5mg/kg，12.5mg/kg，62.5mg/kg)给药后，肝脏组织中肝细胞形态完整，胞核正常，肝小叶结构清晰，胆管未见破坏，汇管区结缔组织未见增生，但出现少量炎性细胞浸润以及轻微水肿，肾脏组织皮质、髓质以及肾小管、集合管结构清晰，肾小球未见增生和萎缩，肾小管上皮细胞未见变性及坏死，与对照组相比未见明显差异。
图12为各剂量DR3penA给药组小鼠血清肝功能指标谷丙转氨酶和谷草转氨酶以及肾功能指标血肌酐和血尿素氮水平，结果表明，各剂量DR3penA(0.5mg/kg，2.5mg/kg，12.5mg/kg，62.5mg/kg)给药后，与对照组相比，无显著差异。图13为DR3penA(5000mg/kg)给药后小鼠血清肝功能指标谷丙转氨酶和谷草转氨酶以及肾功能指标血肌酐和血尿素氮水平，结果表明，高剂量DR3penA(5000mg/kg)给药后，与对照组相比，无显著差异。另外，在DR3penA剂量为5000mg/kg时小鼠未出现死亡，按全球统一毒性分级系统(GHS)标准，DR3penA毒性未分类。
以上结果说明，DR3penA在0.5-62.5mg/kg以及5000mg/kg剂量下未对小鼠肝、肾功能造成不良影响，且肝、肾组织未显示出明显的病理改变，说明DR3penA属于毒性较小的药物，且急性毒副作用较少，安全窗口较大。
以上，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 兰州大学
<120> DR8多肽类似物及其制备方法和应用
<141> 2021-08-16
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Arg的C端连接NH2
<400> 1
Asp His Ala Asn Pro Gln Ile Arg
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(8)
<223> Asn=D-Asn，Arg的C端连接NH2
<400> 2
Asp His Asn Asn Pro Gln Ile Arg
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Arg的C端连接NH2
<400> 3
Asp His Asn Ala Pro Gln Ile Arg
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(8)
<223> Asn=D-Asn ，Arg的C端连接NH2
<400> 4
Asp His Asn Asn Pro Gln Ile Arg
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Arg的C端连接NH2
<400> 5
Asp His Asn Asn Pro Gln Ala Arg
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Arg的C端连接NH2
<400> 6
Asp His Asn Asn Pro Gln Ile Ala
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Arg=D-Arg,且C端连接NH2
<400> 7
Asp His Asn Asn Pro Gln Ile Arg
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(8)
<223> Ala=α-(4 Pentenyl)-Ala，Arg的C端连接NH2
<400> 8
Asp His Ala Asn Pro Gln Ile Arg
1 5
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(8)
<223> Ala=α-(4 Pentenyl)-Ala，Arg的C端连接NH2
<400> 9
Asp His Asn Ala Pro Gln Ile Arg
1 5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(8)
<223> Ala=D-Ala，Arg的C端连接NH2
<400> 10
Asp His Asn Asn Pro Gln Ala Arg
1 5

Claims (10)

1.一种DR8多肽类似物，其特征在于，所述DR8多肽类似物的氨基酸序列如下：
NH2-Asp-His-Xaa3-Xaa4-Pro-Gln-Xaa7-Xaa8-CONH2，
其中，
Xaa3为Ala、D-Asn、Asn或α-(4-Pentenyl)-Ala；
Xaa4为Ala、D-Asn、Asn或α-(4-Pentenyl)-Ala；
Xaa7为Ala、D-Ala或Ile；
Xaa8为Ala、D-Arg或Arg。
2.根据权利要求1所述的DR8多肽类似物，其特征在于，所述Xaa3为Ala、α-(4-Pentenyl)-Ala或D-Asn。
3.根据权利要求1所述的DR8多肽类似物，其特征在于，所述Xaa4为Ala、α-(4-Pentenyl)-Ala或D-Asn。
4.根据权利要求1所述的DR8多肽类似物，其特征在于，所述Xaa7为D-Ala或Ala。
5.根据权利要求1所述的DR8多肽类似物，其特征在于，所述Xaa8为Ala或D-Arg。
6.根据权利要求1所述的DR8多肽类似物，其特征在于，所述DR8多肽类似为如下化合物中的任一种：
化合物DR8-3A：NH2-Asp-His-Ala-Asn-Pro-Gln-Ile-Arg-CONH2；
化合物DR8-3D：NH2-Asp-His-(D-Asn)-Asn-Pro-Gln-Ile-Arg-CONH2；
化合物DR8-4A：NH2-Asp-His-Asn-Ala-Pro-Gln-Ile-Arg-CONH2；
化合物DR8-4D：NH2-Asp-His-Asn-(D-Asn)-Pro-Gln-Ile-Arg-CONH2；
化合物DR8-7A：NH2-Asp-His-Asn-Asn-Pro-Gln-Ala-Arg-CONH2；
化合物DR8-8A：NH2-Asp-His-Asn-Asn-Pro-Gln-Ile-Ala-CONH2；
化合物DR8-8D：NH2-Asp-His-Asn-Asn-Pro-Gln-Ile-(D-Arg)-CONH2；
化合物DR3penA：
NH2-Asp-His-[α-(4-Pentenyl)-Ala]-Asn-Pro-Gln-Ile-Arg-CONH2；
化合物DR4penA：
NH2-Asp-His-Asn-[α-(4-Pentenyl)-Ala]-Pro-Gln-Ile-Arg-CONH2；
化合物DR7dA：NH2-Asp-His-Asn-Asn-Pro-Gln-(D-Ala)-Arg-CONH2。
7.权利要求1～6任一所述的DR8多肽类似物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：采用Fmoc固相合成法，由羧基端向氨基端方向合成所述的DR8多肽类似物对应的多肽树脂；
步骤2：切割步骤1合成的多肽树脂，脱除肽链的全保护，收集含有DR8多肽类似物的切割液；
步骤3：纯化步骤2得到的切割液，获得DR8多肽类似物。
8.根据权利要求7所述的DR8多肽类似物的制备方法，其特征在于，
步骤1中，Fmoc固相合成法使用的树脂为MBHA树脂；
步骤2中，使用切割液切割步骤1合成的多肽树脂，所述切割液由TFA：Tis：H2O按体积比95：2.5：2.5组成。
9.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1～6任一项所述的DR8多肽类似物和药学上可接受的载体或辅料。
10.权利要求1～6中任一项所述的DR8多肽类似物在制备预防或治疗肺纤维化疾病的药物中的应用；
以及，所述的DR8多肽类似物在制备预防或治疗肾脏纤维化疾病的药物中的应用。
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