CN108465103A - 抗氧化多肽dr8在制备治疗肺脏纤维化药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗氧化多肽DR8的医药新用途——在制备治疗肺脏纤维化药物中的应用，属于生物医药技术领域。体外肺上皮细胞相关实验与体内肺纤维化模型小鼠给药实验表明，DR8能够有效抑制肺脏纤维化的发生发展，具有抗肺脏纤维化作用，且细胞毒性低，因此，可以DR8为活性成分，采用药剂学常规工艺和辅料，制备成治疗肺脏纤维化的冻干粉剂和肠溶衣制剂、微球、微囊、毫微球、脂质体、纳米粒、微乳制剂等各种口服制剂，具有很好的临床应用价值。

Description

抗氧化多肽DR8在制备治疗肺脏纤维化药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体是一种具有抗氧化作用的多肽DR8在制备治疗肺脏纤维化药物中的应用。

背景技术

肺纤维化(Pulmonary fibrosis, PF)是一种以弥漫性、进行性肺间质纤维增生和肺泡结构紊乱导致的肺功能障碍为特征的呼吸系统疾病。肺纤维化的发生与多种疾病相关，具有高发病率和高死亡率且预后差的特点。确诊后患者的平均生存时间为2.5-3.5年，近年来其发病呈逐年上升趋势，对人类的健康和危害极大（J. Pneumologia. 2003, 29:1-5; Toxicol Appl Pharmacol. 2015, 286:188-197）。

由于肺纤维化的发病机制尚未明确，因此缺乏有效的治疗手段。目前肺纤维化的治疗多采用糖皮质激素、免疫抑制剂、免疫调节剂等，但其临床疗效并不显著，且具有一定不良反应。吡非尼酮（PFD）是目前唯一被批准可用于肺纤维化临床治疗的药物，通过调节或抑制与纤维化疾病相关的重要因子如成纤维细胞生长因子 （bFGF）、转化生长因子-β（TGF-β）、结缔组织生长因子（CTGF）和金属蛋白酶组织抑制剂 1（TIMP-1）等的表达，抑制成纤维细胞的生物学活性，减少细胞增殖和基质胶原合成，同时还可抑制炎性介质分泌、减少脂质过氧化等，发挥抗炎和抗氧化作用。但PFD副作用大，且半衰期非常短。1987年Cantin等首次发表了关于肺纤维化中氧化应激的研究报告，提示氧化/抗氧化失衡可能在肺纤维化发病机制中发挥重要作用：氧化剂能够引起炎症因子基因表达与合成释放，导致炎症损伤；活性氧（ROS）能刺激多种细胞表达和分泌TGF-β，进而活化成纤维细胞；ROS介导肺泡上皮细胞凋亡，且成纤维细胞及肌成纤维细胞调亡不足，导致细胞外基质（ECM）沉积，最终导致肺纤维化形成（Eur J Cancer. 2002, 38 Suppl 5:S28-36）。

DR8（DHNNPQIR）是Xu等2017年报道的从菜籽蛋白中分离提取的抗氧化多肽，通过增强谷胱甘肽过氧化物酶活性清除自由基，从而减轻自由基对机体的损伤，并且可以清除细胞内活性氧（ROS），对易过氧化的脂质起保护作用，从而发挥抗氧化活性（J Agric FoodChem. 2017, 65:2056-2065）。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗氧化多肽DR8的医药新用途，即在制备治疗肺脏纤维化药物中的应用。

本发明通过动物实验与细胞实验，在细胞和分子水平分别通过一系列实验证实了抗氧化多肽DR8在治疗肺脏纤维化中的药理学活性。

一、动物实验

1. 小鼠建模与给药

用博来霉素（BLM）诱导构建小鼠肺纤维化模型：

雌性C57BL/6小鼠，8周龄，体重为18-20g，将小鼠按随机分组法分为4组，每组8-10只，分别为对照组、生理盐水组、博来霉素模型组、DR8给药组。

博来霉素模型组经腹腔注射1%戊巴比妥钠100μL/只麻醉固定后，75%乙醇消毒颈部皮肤，沿颈部做一长为1cm左右的切口，钝性分离颈部皮下各层组织，暴露气管，按5mg/kg的剂量于气管内注射博来霉素50μL，注射后立即直立匀速旋转小鼠，使药物在肺部均匀分布。对照组小鼠不做处理。生理盐水组小鼠在相同条件下经气管注入等体积生理盐水。DR8给药组首先皮下注射100μL DR8（500μg/kg），接着腹腔注射100μL戊巴比妥钠，最后气管注射博来霉素50μL（5mg/kg）。给药组每天相同剂量皮下给药，隔天称体重，21天取材。

2. 小鼠肺脏组织病理切片结果

将取材的新鲜肺组织用4%多聚甲醛固定24h后分别使用70%、80%、90%、95%和100%的乙醇依次脱水处理1次，每个浓度脱水1h。接着采用二甲苯溶液处理30min并重复1次后，放入55-65℃已溶化的石蜡内浸渍40min，重复1次，待石蜡完全浸入组织块后进行包埋。包埋后在切片机上切成蜡片，于40℃的水面进行展平，展平后放置在清洁的载玻片上，置于60℃烤箱中烘烤。制片后分别进行HE与Masson染色。

实验结果见图1。HE染色实验结果显示，正常组及生理盐水组肺组织内结构清晰，未见炎症及纤维化表现。博来霉素模型组小鼠肺组织切片严重纤维化，表现为肺泡结构破坏或消失，被纤维结缔组织填充，并伴有炎症细胞浸润；肺泡间质明显水肿增宽，大量成纤维细胞和胶原组织沉积。DR8给药组肺组织结构较模型组完整，肺泡内未见明显的炎症细胞，存在少量的纤维灶，纤维化程度明显减轻。Masson染色结果显示，正常组及生理盐水组肺组织内有少量胶原分布。博来霉素模型组支气管壁周围和肺泡隔区域，可见蓝色胶原纤维明显增多。DR8给药组与模型组相比，胶原纤维沉积明显减少（图1a）。统计结果显示，与模型组相比，DR8给药的胶原含量明显降低，差异极显著（图1b）。组织切片结果均显示，DR8能明显改善小鼠肺脏纤维化程度。

3. 血清学指标检测

（1）与纤维化相关重要因子含量检测：转化生长因子（TGF-β）是目前已知的最重要的致纤维化因子，基质金属蛋白酶（MMP-2）能降解和重塑纤维化过程中形成的大量胞外基质（ECM），羟脯氨酸（HYP）是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标，当器官发生纤维化时，血清中TGF-β和MMP-2的含量与肺脏组织中HYP的含量会明显升高。本发明通过ELISA测定对照组、博来霉素模型组和DR8给药组小鼠血清中的TGF-β、MMP-2含量，通过分光光度法测定肺脏组织中HYP含量。具体实验过程为：

将给药实验结束后的小鼠用乙醚麻醉，从眼眶静脉丛取血，置于已灭菌的1.5mL EP管中，室温下自然凝固20-30min后，离心30min（12000r/min)，收集上清，使用ELISA试剂盒测定TGF-β与MMP-2含量。精确称取小鼠肺脏组织湿重30mg放入试管中，准确加水解液1mL ，沸水浴水解20min，调pH 值至6.0-6.8，加蒸馏水至10mL，取3-4mL 稀释的水解液加20-30mg活性炭，离心10min（3500 r/min），取上清1mL用HYP检测试剂盒测定HYP含量。

实验结果见图2，如图2a所示，与对照组相比，博来霉素模型组小鼠血清中TGF-β含量明显升高，差异极显著（P<0.01）；与博来霉素模型组相比，DR8给药组小鼠血清中TGF-β含量明显降低，差异极显著（P<0.01）。如图2b所示，与对照组相比，博来霉素模型组小鼠血清中MMP-2含量明显升高，差异极显著（P<0.01）；与博来霉素模型组相比，DR8给药组小鼠血清中MMP-2含量降低，有显著性差异（P<0.05）。如图2c所示，与对照组相比，博来霉素模型组小鼠肺脏组织中HYP含量明显升高，差异极显著（P<0.01）；与博来霉素模型组相比，DR8给药组小鼠肺脏组织中HYP含量降低，有显著性差异（P<0.05）。以上结果说明，经过DR8的皮下注射给药，与模型组相比，小鼠血清与肺脏组织中反映纤维化指标的因子含量均显著下降，DR8抑制了小鼠肺脏纤维化的发生发展。

（2）与炎症相关重要因子含量检测：肺脏纤维化早期以炎症反应为主，在炎症反应过程中常出现炎性细胞、免疫效应细胞和其他相关细胞因子。其中重要的有肿瘤坏死因子-α（TNF-α），通过促进间质细胞的有丝分裂、调控胶原合成和沉积等多途径影响基质代谢；白细胞介素（IL）通过从炎症损伤等参与肺纤维化的形成。发生纤维化时，炎症因子含量升高。本实验通过ELISA方法测定正常组、模型组和DR8给药组血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量。

试验血样来源和处理方法同实验（1），实验结果见图3。如图3a所示，与对照组相比，博来霉素模型组小鼠血清中TNF-α含量明显升高；与博来霉素模型组相比，DR8给药组小鼠血清中TNF-α含量明显降低。如图3b所示，与对照组相比，博来霉素模型组小鼠血清中IL-1β含量明显升高；与博来霉素模型组相比，DR8给药组小鼠血清中IL-1β含量降低。如图3c所示，与对照组相比，博来霉素模型组小鼠血清中IL-6含量明显升高；与博来霉素模型组相比，DR8给药组小鼠血清中IL-6含量降低。以上结果说明，经过DR8的皮下注射给药，与博来霉素模型组相比，小鼠血清中相关炎症因子含量均显著下降，DR8抑制了纤维化病程中的炎症反应。

（3）氧化应激相关因子含量检测：氧化应激在肺纤维化发病机制中有着重要作用。氧化剂能够引起炎症因子的表达与释放，导致炎症损伤。活性氧（ROS）能刺激多种细胞表达和TGF-β分泌，进而活化成纤维细胞，并介导肺泡上皮细胞凋亡，最终导致ECM沉积。在纤维化发生的进程中，与氧化应激相关的因子含量会发生改变。本实验通过ELISA测定对照组、模型组和DR8给药组小鼠血清中氧化应激相关指标，即总超氧化物歧化酶（T-SOD）活力、过氧化氢酶（CAT）活力、谷胱甘肽（GSH）含量，以及丙二醛（MDA）含量。

试验血样来源和处理方法同实验（1），实验结果见图4。如图4a所示，与对照组相比，博来霉素模型组小鼠血清中T-SOD活力降低；与博来霉素模型组相比，DR8给药组小鼠血清中T-SOD活力明显升高。如图4b所示，与对照组相比，博来霉素模型组小鼠血清中CAT活力降低；与博来霉素模型组相比，DR8给药组小鼠血清中CAT活力明显升高。如图4c所示，与对照组相比，博来霉素模型组小鼠血清中GSH含量明显降低；与博来霉素模型组相比，DR8给药组小鼠血清中GSH含量升高。如图4d所示，与对照组相比，博来霉素模型组小鼠血清中MDA含量升高；与博来霉素模型组相比，DR8给药组小鼠血清中MDA含量明显降低。以上结果说明，与博来霉素模型组相比，DR8皮下注射给药后小鼠血清中相关氧化应激因子含量发生改变，DR8通过抑制纤维化病程中的氧化应激反应，从而减轻炎症反应，改善纤维化。

4. Western-bloting（WB）检测TGF-β及α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达

α-SMA是肌成纤维细胞的主要标志，其含量能够反映纤维化的程度。用WB法检测小鼠肺脏组织中TGF-β和α-SMA的蛋白表达量，是评价药物是否具有抗纤维化作用的重要指标。本实验通过WB检测DR8给药后小鼠肺脏组织中TGF-β和α-SMA的蛋白表达量。

A、提取蛋白

实验动物取材后，称取小鼠肺组织30mg，加入裂解液使用匀质器破碎，混匀，12000r/min离心后，取上清；使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定；

B、蛋白裂解、变性

将各样本的蛋白浓度用裂解液稀释一致，加入上样缓冲液后，100℃煮10min，使蛋白充分变性；

D、电泳

每个孔道加入总量50μg的蛋白，80V电泳至浓缩胶与分离胶界限处，120V电泳至溴酚蓝至电泳槽下端0.5cm处停止；

E、转膜

250mA转膜1.5h，转膜完成后，TBST溶液漂洗3次，每次10min；

F、封闭

5%BSA中慢摇封闭2h；

G. 一抗浓度：TGF-β为1:1000，α-SMA为1:500，GAPDH为1:5000，于4℃冰箱过夜孵育；孵育完后，用TBST溶液漂洗3次，每次10min。二抗浓度：1:10000，于室温下孵育1h；孵育完后，用TBST溶液漂洗3次，每次10min；

H. 显影观察分析

实验结果见图5。通过免疫印迹测定（图5a），实验小鼠经博来霉素作用后，肺脏组织中α-SMA和TGF-β的表达上调，经过DR8给药作用后，α-SMA和TGF-β水平明显降低（图5b），在小鼠组织蛋白水平证明DR8能够抑制肺脏纤维化的发生与发展。

二、细胞实验

本实验以药物研究中广泛应用的II型肺上皮细胞A549为体外模型，通过体外细胞实验对抗氧化多肽DR8在治疗肺纤维化中的药理学活性进行鉴定。

1. 细胞培养

将A549细胞消化处理，混匀计数，按照每孔250000个细胞的浓度稀释，再按照每孔2mL加入6孔板中，将培养板放入37℃、5% CO₂的恒温培养箱中，培养24h；吸去培养板中原培养基，加入无血清培养基，饥饿培养12h。

2. MTT法测定不同浓度DR8对A549细胞与TGF-β刺激的A549细胞的增殖作用

分组加药：（1）无处理的对照组；（2）5ng/mL TGF-β对照组；（3）DR8（10μmol/L）组；（4）DR8（10μmol/L）+5ng/mL TGF-β组；（5）DR8（20μmol/L）组；（6）DR8（20μmol/L）+5ng/mL TGF-β组；（7）DR8（40μmol/L）组；（8）DR8（40μmol/L）+5ng/mL TGF-β组（9）DR8（80μmol/L）组；（10）DR8（80μmol/L）+5ng/mL TGF-β组，每组设10个平行孔，然后继续在培养箱中培养24h。

实验结果见图6。如图6a所示，当DR作用浓度达到160μmol/L时，对A549细胞并未显示出增殖活性，即无毒性；如图6b所示，通过TGF-β刺激的细胞增殖实验得出，当DR8浓度为20、40、80μmol/L时，与TGF-β组差异极显著，效果较好，说明在这三个浓度时，DR8在体外能够有效抑制TGF-β引起的细胞增殖，从而抑制肺上皮细胞的纤维化进程。

3. WB检测有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路及α-SMA表达

MAPK级联是细胞内重要的信号转导系统，MAPK的亚类p38丝裂原蛋白活化激酶在氧化应激和细胞因子的作用下，活化的p38蛋白通过参与细胞损伤，成纤维细胞的增殖和分化、胞外基质沉积，促进肺纤维化的发生。TGF-β介导细胞外信号调节激酶（ERK）通路是肺纤维化形成重要的通路之一，TGF-β通过活化ERK信号蛋白诱导下游相关因子的表达，诱导成纤维细胞增殖分化，从而介导ECM沉积。ERK通路通过参加TGF-β诱导细胞增殖以及成纤维细胞（FB）转化为肌成纤维细胞（MFB），进一步促进纤维化的发生。

本实验通过WB方法，检测A549细胞经DR8处理后，在TGF-β1诱导下磷酸化ERK和p38及α-SMA表达变化，鉴定DR8的抗肺纤维化作用。

A、分组加药

（1）无处理的正常对照组；（2）5ng/mL TGF-β对照组；（3）DR8（20μmol/L）+5ng/mL TGF-β组；（4）DR8（40μmol/L）+5ng/mL TGF-β组，然后继续在培养箱中培养；

B、提取蛋白

培养1h后提取蛋白以检测pERK和p38；培养12h后提取蛋白以检测α-SMA；提取蛋白后使用BCA法测定蛋白浓度；

步骤C-F依次为蛋白裂解、变性；电泳；转膜；封闭；实验过程同动物实验4；

G. 一抗浓度：p-Erk和p-p38为 1:1000，α-SMA为1:500，GAPDH为1:5000，于4℃冰箱过夜孵育；孵育完后，用TBST溶液漂洗3次，每次10min。二抗浓度：1:10000，于室温下孵育1h；孵育完后，用TBST溶液漂洗3次，每次10min；

H. 显影观察分析

实验结果见图7，如图7a所示，与对照组相比，TGF-β及DR8作用后，总ERK及总p38蛋白表达无明显差异，TGF-β作用后，磷酸化ERK和磷酸化p38蛋白表达上调；与TGF-β组相比，DR8干预后，磷酸化ERK和磷酸化p38蛋白表达有所下调。如图7b所示，对图7a进行统计，与对照组相比，TGF-β作用后，磷酸化ERK和磷酸化p38蛋白表达显著增加；20 μmol/L和40 μmol/L的DR8干预后，磷酸化ERK和磷酸化p38的表达较TGF-β组均显著减弱。如图7c所示，与对照组相比，TGF-β作用后，α-SMA表达上调；与TGF-β组相比，DR8干预后，α-SMA表达有所下调。如图7d所示，对图7c进行统计，与对照组相比， TGF-β作用后, α-SMA蛋白表达显著增加；20 μmol/L和40 μmol/L的DR8干预后，α-SMA的表达较TGF-β组均显著减弱。

以上结果说明在细胞实验中，TGF-β1激活了肺上皮细胞内MAPK信号通路，引起纤维化发生，但经过DR8处理后，通过下调信号通路中关键因子α-SMA的表达，从而抑制了肺上皮细胞纤维化的发生发展。

综上所述，本发明化学合成抗氧化多肽DR8后，进行体外细胞实验和体内动物实验，通过模型细胞中DR8作用后肺纤维化相关因子的表达检测、模型动物治疗后组织切片染色观察分析、血清学指标与参与纤维化重要因子的表达水平检测，在细胞水平与分子水平，均证实抗氧化多肽DR8能够有效抑制肺脏纤维化的发展，具有抗肺脏纤维化作用，且细胞毒性低，在制备抗肺脏纤维化药物方面具有很好的临床应用价值。

附图说明

图1 为小鼠肺脏组织切片HE染色、Masson染色与统计：a为染色结果，b为小鼠肺脏组织胶原含量统计结果。

图2为小鼠血清与肺脏组织中纤维化重要因子检测结果：a为血清中TGF-β含量，b为血清中MMP-2含量，c为肺脏组织中HYP含量。

图3为小鼠血清中炎症相关因子血清学检测结果：a为TNF-α含量，b为IL-6含量，c为IL-1β含量。

图4为小鼠血清中氧化应激相关因子血清学检测结果：a为MDA含量，b为GSH含量，c为T-SOD活力，d为CAT活力。

图5 为WB检测小鼠肺脏组织TGF-β与α-SMA表达结果：a为WB实验结果，b为TGF-β与α-SMA表达量统计结果。

图6 为DR8对TGF-β刺激A549细胞的增殖作用：a为A549细胞存活率统计结果，b为A549细胞增值统计结果。

图7 为WB检测A549细胞在TGF-β1诱导下ERK和p38及α-SMA表达结果：a为WB检测ERK和p38表达实验结果，b为ERK和p38表达统计结果，c为WB检测α-SMA表达实验结果，d为α-SMA表达统计结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明DR8作为活性成分，在制备抗肺纤维化药物中的应用作进一步说明。

实施例1、DR8肌肉注射用冻干粉的制备

配方：DR8（纯度大于95%） 30.0g

特异性蛋白稳定剂、冻干保护剂/赋形剂 30.0g

渗透压调节剂（血浆313 mOsm/kgH₂O） 0.5-1L

pH 调节剂（pH 4-9） 0.5-1L

制药用水 加至总体积 60L

冻干粉总质量 60.0-70.0g

工艺：按制备冻干粉的常规工艺操作，共制成冻干粉剂1000支，每支含DR8冻干粉60-70mg，避光保存。

上述非特异性蛋白稳定剂、冻干保护剂优选甘露醇，赋形剂优选乳糖，渗透压调节剂优选NaCl，pH 调节剂优选柠檬酸/Tris-HCl缓冲液。

实施例2、DR8口服制剂的制备

配方：DR8（纯度大于95%） 50.0g

填充剂 85.0g

黏合剂 5.0g

润滑剂 10.0g

共计 200.0g

工艺：按制备胶囊剂的常规工艺制成1000粒，每粒胶囊含DR8有效成分50mg，对胶囊采用肠溶材料丙烯酸树脂包衣，制成肠溶衣制剂。填充剂、黏合剂、润滑剂等辅料均为药剂学常规辅料。

除此之外，口服制剂还可将上述填充剂、黏合剂、润滑剂等辅料由聚酯材料包裹制成微球、微囊和毫微球，由壳聚糖包裹制备成脂质体或纳米粒，加入胆固醇、磷酯和游离脂肪酸制备成微乳制剂等。各剂型的制备工艺均为药剂学常规工艺。

Claims (3)

1.抗氧化多肽DR8在制备治疗肺脏纤维化药物中的应用。

2.如权利要求1所述的抗氧化多肽DR8在制备治疗肺脏纤维化药物中的应用，其特征是，以DR8为活性成分，采用药剂学常规工艺和辅料，制备成冻干粉剂或口服制剂。

3.如权利要求2所述的抗氧化多肽DR8在制备治疗肺脏纤维化药物中的应用，其特征是，所述口服制剂为肠溶衣制剂、微球、微囊、毫微球、脂质体、纳米粒、微乳制剂中的一种。