CN113861267A

CN113861267A - 一种缩酯环肽类化合物lzg-pku-h及其合成方法和应用

Info

Publication number: CN113861267A
Application number: CN202111242559.1A
Authority: CN
Inventors: 李子刚; 尹丰; 詹美苗; 孔凌微
Original assignee: Shenzhen Bay Laboratory Pingshan Biomedical R & D And Transformation Center; Peking University Shenzhen Graduate School
Current assignee: Shenzhen Bay Laboratory Pingshan Biomedical R & D And Transformation Center; Peking University Shenzhen Graduate School
Priority date: 2021-10-25
Filing date: 2021-10-25
Publication date: 2021-12-31
Anticipated expiration: 2041-10-25
Also published as: CN113861267B

Abstract

本发明提出一种缩酯环肽类化合物LZG‑PKU‑H，结构式如下：

本发明还提出该化合物的制备方法，以苏氨酸为起始原料，通过一系列反应得到化合物LZG‑PKU‑H。本发明还提出化合物LZG‑PKU‑H在制备抑制HDAC活性药物中的应用。本发明提出的化合物LZG‑PKU‑H结构新颖，具有较强的HDAC抑制性，且结构稳定，其二硫键不易被还原，合成方法具有简便、路线短、中间体稳定、环保经济等优势，同时为后续更多的药用机制等生物学、药学研究提供了参照。

Description

一种缩酯环肽类化合物LZG-PKU-H及其合成方法和应用

技术领域

本发明属于稳定多肽方法学、有机化学以及化学生物学领域，具体涉及一种新型的用于抑制HDAC活性的缩酯环肽类化合物LZG-PKU-H及其合成方法和应用。

背景技术

肿瘤的恶性发展与表观遗传的修饰有关，包括基因组DNA的甲基化，以及组蛋白乙酰化等翻译后修饰，而组蛋白去乙酰化酶(HDAC)是一类对组蛋白以及其他细胞蛋白进行去乙酰化修饰的蛋白酶，其通过移除赖氨酸的乙酰基团，使组蛋白所结合的染色体的结构发生改变，进而调节该区域的基因的转录和复制，影响生命体各机能。

根据细胞定位和同源性差异，人体HDAC家族的18个成员被分为Zn²⁺依赖型的ClassI(HDAC1,2,3,8)、Class IIa(HDAC4,5,7,9)、Class IIb(HDAC6,10)、Class IV(HDAC11)和NAD⁺依赖型的Class III(SIRT1-7)。

2006年，Vorinostat(SAHA，伏立诺他)被美国FDA批准上市用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤，在肿瘤的治疗中取得了较大突破。随后，Romidepsin(FK-228，罗米地辛)、Belinostat(PXD-101)、Panobinostat(LBH-589)和Chidamide(CS055)也相继被批准上市用于治疗皮T-细胞淋巴瘤和外T-细胞淋巴瘤，并取得了良好的效果。

虽然SAHA等HDAC抑制剂在癌症治疗方面取得了一定的成果，但是目前已上市的HDAC抑制剂均为泛抑制剂，对HDAC不同亚型均有较强的抑制作用，其对HDAC不同亚型的非选择性抑制导致了一系列的毒副作用，如SAHA在临床中往往伴随着腹泻、疲劳、白细胞减少症等一系列副作用。此外FK-228进入细胞经谷胱甘肽还原后，所产生的red FK-228具有高亲和性地与肿瘤细胞中HDAC活性位点结合能力，导致其难以泵出，进而出现了逆转耐药的现象等。这些都极大地限制了HDAC抑制剂的临床应用。

因此，开发和设计新型HDAC抑制剂意义重大，其临床的应用前景广阔。

发明内容

本发明的目的在于提供一种缩酯环肽类化合物LZG-PKU-H。

本发明提供的化合物LZG-PKU-H，具有如下结构式：

本发明提出的缩酯环肽类化合物LZG-PKU-H，其所形成的新型二硫键的稳定性明显优于罗米地辛所包含的二硫键，即该二硫键难以被一般还原性物质还原，诸如恶性肿瘤细胞环境中的高浓度GSH(谷胱甘肽)。此外，化合物LZG-PKU-H保持了对于HDAC尤其HDACClassⅠ型活性的有效抑制

本发明的第二目的在于提供一种缩酯环肽类化合物LZG-PKU-H的合成方法，由化合物1经包含如下步骤的合成方法制备得到：

(1)化合物1经酯化得到化合物1i，再经酰胺缩合得到化合物2：

(2)化合物2经酰胺缩合得到化合物3：

(3)化合物3将苏氨酸残基的羟基添加上保护基甲磺酰基，形成化合物3i后，脱去氨基端Fmoc保护基后进行酰胺缩合得到化合物4：

(4)化合物4和L-Val通过酯化反应得到化合物5：

(5)化合物5脱去羧基端保护基后得到化合物6：

(6)化合物6通过分子内酰胺缩合关环得到化合物7：

(7)化合物7氧化关环形成分子内二硫键得到化合物LZG-PKU-H：

本发明中，步骤(1)中，0℃～室温下，化合物1、Me₃SiEtOH、DIPEA和DMAP在有机溶剂中与TCBC进行反应制得化合物1i，其中化合物1、Me₃SiEtOH、TCBC、DIPEA和DMAP摩尔比范围为：1:2～3:1～1.3:1～1.3:0.1～0.3；在有机溶剂中，化合物1i、D-Pen、HATU和HOAt混合试剂、DIPEA的摩尔比范围为：1:1:1～1.3:1～1.3；其中，有机溶剂为二氯甲烷或乙腈中的一种。

本发明中所涉及的“室温”具体的温度范围是25-30℃。

化合物2的制备通过常规的酰胺缩合方法所得，以L-苏氨酸为起始原料，室温下，通过酯化等方式让苏氨酸的羧基端添加上保护基，酯化试剂优选为TCBC，有机碱为DMAP和DIPEA，反应12小时，得到中间体，继而利用二乙胺等试剂在室温下反应1.5～2小时脱去氨基端Fmoc保护基得到产物与D-Pen进行下一步酰胺缩合，反应12小时，缩合试剂优选为HOAt和HATU的混合试剂，有机碱优选DIPEA。。

本发明中，步骤(2)中，在有机溶剂中，室温下，化合物2、D-Val、HATU和HOAt混合试剂、DIPEA的摩尔比范围为1:1:1～1.3:1～1.3，其中有机溶剂为二氯甲烷或乙腈中的一种。

化合物3的制备依旧利用酰胺缩合方法，室温下，利用二乙胺等试剂将化合物2的氨基端Fmoc保护基脱去，反应时间为1.5～2小时，随后与D-Val在室温下进行酰胺缩合，反应12小时。缩合试剂优选为HOAt和HATU的混合试剂，有机碱优选为DIPEA。其中二乙胺的浓度为3％～5％的体积分数，有机溶剂优选为二氯甲烷与乙腈。

本发明中，步骤(3)中，在吡啶中，0℃～室温下，化合物3、MsCl和DMAP的摩尔比范围为1:2～3:0.1～0.3，制得化合物3i；在有机溶剂中，室温下，化合物3i、DABCO、Hm7、HATU和HOAt混合试剂、DIPEA的摩尔比范围为1:5～10:1:1～1.3:1～1.3，其中有机溶剂为二氯甲烷或乙腈中的一种。

化合物4的制备涉及非天然氨基酸L-2-amino-2-butylenoic的形成，主要方法是将化合物3在有机碱吡啶作为溶剂的情况下，将苏氨酸残基的羟基添加上保护基甲磺酰基，反应温度为0℃～室温，反应时间为12小时，继而在有机碱DABCO的催化下，反应2～3小时，形成中间体，进一步利用二乙胺在室温下脱去中间体氨基端Fmoc保护基，反应时间为1.5～2小时，与巯基由三苯甲基保护的Hm7在室温下进行酰胺缩合。缩合试剂优选为HOAt和HATU的混合试剂，有机碱优选为DIPEA。二乙胺的浓度为3％～5％的体积分数，有机溶剂优选为二氯甲烷与乙腈。

本发明中，步骤(4)中，在有机溶剂中，室温下，化合物4、L-Val、TCBC、DIPEA和DMAP的摩尔比范围为：1:1:1.5～2:1～1.3:0.1～0.3，其中有机溶剂为二氯甲烷或乙腈中的一种。

化合物5的制备是由L-Val和化合物4通过酯化反应所得。缩合试剂为TCBC，有机碱包括DIPEA、DMAP，室温下反应48小时，继而利用二乙胺在室温下反应1.5～2小时脱去中间体氨基酸Fmoc保护基得到化合物5。其中二乙胺的浓度为3％～5％的体积分数，有机溶剂优选为二氯甲烷与乙腈。

本发明中，步骤(5)中，在乙腈中，化合物5、氟化铯的摩尔比范围为：1:5～10。

化合物6的制备为化合物5脱去羧基端保护基TMSE，试剂优选为氟化铯，在60℃的情况下反应24～48小时。

本发明中，步骤(6)中，在有机溶剂中，室温下，化合物6的摩尔浓度大于等于零且小于等于千分之五，有机溶剂为二氯甲烷或乙腈中的一种。

化合物7的制备为化合物6通过分子内的酰胺缩合关环所得，缩合试剂优选为HOAt和HATU的混合试剂，室温下反应12小时，有机溶剂优选乙腈。

本发明中，步骤(7)中，在甲醇中，室温下，化合物7和碘的摩尔比范围为：1:1～3。

化合物LZG-PKU-H的制备为化合物7氧化关环形成分子内二硫键所得。室温下，化合物7与碘反应0.5～1小时，随后利用抗坏血酸和柠檬酸处理。有机试剂优选为甲醇。

本发明的第三目的在于缩酯环肽类化合物LZG-PKU-H在制备抑制HDAC活性的药物中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明提出的缩酯环肽类化合物LZG-PKU-H，显示出了较FK-228的稳定性，即比FK-228结构能够更长时间保留其二硫键，该特性可以更好地利用在制备治疗各种疾病中的药物中，进而改善逆转耐药现象。

本发明提出的合成LZG-PKU-H的方法路线简短，方法简便，中间体稳定，反应具有一定经济性。

本发明的缩酯环肽类化合物LZG-PKU-H即使在高浓度GSH存在的情况下，亦具有较强的抑制HDAC活性，且较阳性SAHA的抑制活性强，与未被还原的FK-228抑制活性相当。同时，LZG-PKU-H在是否存在还原性物质如GSH的情况下都具有稳定的抑制HDAC能力，其较FK-228有着较广的适用环境范围，可改善其逆转耐药的缺陷。

附图说明

图1.实施例10中LZG-PKU-H在GSH存在下的LC-MS图。

图2.实施例10中FK228在GSH存在下不同孵育时间情况下的LC-MS图。

图3.实施例11中不同条件下LAG-PKU-H对Hela细胞核提取物的酶活对照图(阳性对照为罗米地辛(FK-228)和伏立诺他(SAHA))。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

申请文件中所用英文缩写对应的中文含义见表1。

表1、英文缩写释义

实施例1.化合物1i的合成：

在0℃条件下，于化合物1(10g，29mmol)和三甲基硅基乙醇(12.9ml，90mmol)、DIPEA(6.5ml，37.7mmol)以及DMAP(1.0g，8.7mmol)的二氯甲烷溶液中缓慢滴入TCBC(6.1ml，37.7mmol)，升至室温，搅拌反应过夜。依次用饱和NaHCO₃溶液，饱和NaCl溶液洗涤，二氯甲烷萃取，无水Na₂SO₃干燥，过滤，减压浓缩，残留物经柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1～1:1)，得白色固体10g，产率80％。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)：δ7.80(d,J＝7.5Hz,2H),7.69–7.64(m,2H),7.43(t,J＝7.5Hz,3H),7.35–7.30(m,2H),5.88(d,J＝8.9Hz,1H),4.46(d,J＝7.1Hz,2H),4.43–4.35(m,2H),4.33–4.25(m,3H),1.31(d,J＝6.1Hz,3H),1.11–1.04(m,2H),0.08(s,9H)ppm；MSm/z464.18(M+Na⁺)。

实施例2化合物2的合成：

室温下，于体积分数为5％二乙胺乙腈溶液中，加入化合物1i(5g，11.3mmol)搅拌反应两小时，减压旋干溶剂，用二氯甲烷溶解，依次加入HATU(5.6g，14.7mmol)，HOAt(2.0g，14.7mmol)，DIPEA(2.3ml，14.7mmol)和D-Pen(6.9g，11.3mmol)，继续室温搅拌反应过夜。依次用饱和NaHCO₃溶液，饱和NaCl溶液洗涤，二氯甲烷萃取，无水Na₂SO₃干燥，过滤，减压浓缩，残留物经柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:1～1:2)，得白色固体7.8g，产率86％。

¹H NMR(400MHz,DMSO)：δ8.64(dd,J＝8.4,1.4Hz,1H),7.66–7.58(m,15H),7.31(dt,J＝13.7,6.9Hz,9H),5.05(d,J＝5.6Hz,1H),4.41(t,J＝6.3Hz,3H),4.29(d,J＝3.5Hz,2H),4.20–4.14(m,3H),1.15(d,J＝6.4Hz,3H),1.07(d,J＝5.0Hz,3H),1.01–0.97(m,5H),0.07–0.05(m,9H)ppm；MS m/z 837.33(M+Na⁺).

实施例3化合物3的合成：

室温下，于体积分数为5％二乙胺乙腈溶液中，加入化合物2(5g，6.1mmol)搅拌反应两小时，减压旋干溶剂，用二氯甲烷溶解，依次加入HATU(3.0g，7.9mmol)，HOAt(1.1g，7.9mmol)，DIPEA(1.2ml，7.9mmol)和D-Val(2.1g，6.1mmol)，继续室温搅拌反应过夜。依次用饱和NaHCO₃溶液，饱和NaCl溶液洗涤，二氯甲烷萃取，无水Na₂SO₃干燥，过滤，减压浓缩，残留物经柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:1～1:3)，得白色固体4.6g，产率83％。

¹H NMR(400MHz,DMSO)：δ7.51–7.24(m,26H),5.24–5.17(m,1H),4.75–4.69(m,1H),4.36–4.03(m,8H),2.12–1.99(m,1H),1.46–1.42(m,6H),1.37(s,3H),1.02–0.96(m,2H),0.92(t,J＝5.5Hz,6H),0.06(s,9H)ppm；MS m/z 936.40(M+Na⁺).

实施例4化合物3i的合成：

在0℃条件下，将化合物3(4g，4.4mmol)溶于吡啶中，加入少量DMAP(161mg，1.32mmol)，随后缓慢滴入MsCl(1ml，13.2mmol)，继续反应24小时。反应结束后，缓慢加入适量的水，过滤出析出的固体，柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:1～1:3)，得白色固体2.3g，产率53％。

¹H NMR(400MHz,DMSO)：δ7.50–7.43(m,4H),7.43–7.24(m,22H),5.21(dd,J＝6.4,2.9Hz,1H),4.92(s,1H),4.74–4.70(m,1H),4.31–4.26(m,2H),4.21–4.02(m,4H),3.19(s,3H),2.11–1.99(m,1H),1.47–1.42(m,6H),1.37(s,3H),0.92(t,J＝6.3Hz,8H),0.06(s,9H)ppm；MS m/z 1014.38(M+Na⁺).

实施例5化合物4的合成：

室温下，将化合物3i(2g，2.0mmol)溶于乙腈，随后加入DABCO(2.2g，20mmol)，反应过液。继续加入二乙胺(体积分数为5％)反应两小时，减压旋干，用二氯甲烷溶解，依次加入HATU(988mg，2.6mmol)，HOAt(354mg，2.6mmol)，DIPEA(420μl，2.6mmol)和Hm7(836mg，2mmol)，继续室温搅拌反应过夜。依次用饱和NaHCO₃溶液，饱和NaCl溶液洗涤，二氯甲烷萃取，无水Na₂SO₃干燥，过滤，减压浓缩，残留物经柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:2～1:5)，得白色固体1.4g，产率65％。

¹H NMR(400MHz,DMSO)：δ9.50(d,J＝7.8Hz,1H),7.42–7.30(m,30H),7.25(t,J＝7.2Hz,3H),6.57–6.48(m,1H),5.44(dd,J＝7.9,3.5Hz,2H),4.67(s,1H),4.44(t,J＝6.8Hz,1H),4.27(dd,J＝11.7,5.5Hz,1H),4.12(ddd,J＝12.8,6.0,3.0Hz,2H),2.40–2.29(m,2H),2.22–2.13(m,3H),2.04(ddd,J＝16.8,10.0,5.6Hz,4H),1.15–1.08(m,1H),1.03(t,J＝7.1Hz,1H),0.95(t,J＝8.6Hz,6H),0.88(dd,J＝13.5,6.8Hz,7H),0.06(s,9H)ppm；MS m/z 1074.49(M+H⁺).

实施例6化合物5的合成：

在0℃条件下，于溶有化合物4(1g，0.93mmol)，L-Val(308mg，0.93mmol)，DIPEA(124μl，1.2mmol)和DMAP(34mg，0.28mmol)的二氯甲烷溶液中，缓慢滴入TCBC(308μl，1.9mmol)，升至室温搅拌反应过夜，旋干溶剂，加入体积分数为5％的二乙胺乙腈溶液继续搅拌反应两小时，旋干溶剂。依次用饱和NaHCO₃溶液，饱和NaCl溶液洗涤，二氯甲烷萃取，无水Na₂SO₃干燥，过滤，减压浓缩，残留物经柱层析纯化(乙酸乙酯:甲醇＝20:1～10:1)，得白色固体524mg，产率48％。

¹H NMR(400MHz,DMSO)：δ7.97(d,J＝7.5Hz,3H),7.79(dd,J＝16.7,8.3Hz,3H),7.49(dd,J＝11.2,7.3Hz,3H),7.38–7.28(m,21H),7.24(t,J＝7.4Hz,5H),6.57–6.49(m,1H),5.66–5.51(m,2H),5.48–5.38(m,1H),4.65(s,1H),4.50(d,J＝7.1Hz,1H),4.19–4.09(m,2H),3.98(t,J＝5.6Hz,1H),2.10(dt,J＝13.2,6.9Hz,4H),2.00–1.89(m,3H),1.75(t,J＝6.3Hz,4H),0.98–0.94(m,6H),0.88(dd,J＝6.5,4.4Hz,10H),0.82(d,J＝6.6Hz,4H),0.06(s,9H)ppm；MS m/z 1173.56(M+H⁺).

实施例7化合物6的合成：

室温下，于溶有化合物5(500mg，0.42mmol)的乙腈溶液中，加入氟化铯(317mg，2.1mmol)，逐步升至60℃，搅拌反应过夜，旋干溶剂，依次用饱和NaHCO₃溶液，饱和NaCl溶液洗涤，二氯甲烷萃取，无水Na₂SO₃干燥，过滤，减压浓缩，残留物经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇＝20:1～10:1，滴加少量醋酸于流动相中)，得白色固体274mg，产率60％。

¹H NMR(400MHz,MeOD)：δ7.61(t,J＝8.4Hz,6H),7.37(dt,J＝7.1,2.4Hz,8H),7.28(dd,J＝7.3,5.1Hz,12H),7.25–7.17(m,9H),6.82(p,J＝7.1Hz,1H),5.77–5.64(m,2H),5.44(dd,J＝15.4,7.9Hz,1H),4.45–4.40(m,1H),4.22(dd,J＝12.9,7.7Hz,1H),3.84(t,J＝4.1Hz,1H),2.68(dd,J＝14.7,8.1Hz,1H),2.58(dd,J＝14.6,5.3Hz,1H),2.20(dt,J＝9.8,5.1Hz,3H),2.13(dd,J＝12.7,5.9Hz,2H),1.78–1.71(m,4H),1.05–0.99(m,3H),0.98–0.93(m,7H),0.89(dd,J＝10.2,6.7Hz,8H)ppm；MS m/z 1073.80(M+H⁺).

实施例8化合物7的合成：

室温下，将化合物6(200mg，0.18mmol)溶于100ml二氯甲烷溶液中，随后依次加入HATU(205mg，0.54mmol)，HOAt(73mg，0.54mmol)和DIPEA(87μl，0.54mmol)，搅拌反应过夜。依次用饱和NaHCO₃溶液，饱和NaCl溶液洗涤，二氯甲烷萃取，无水Na₂SO₃干燥，过滤，减压浓缩，残留物经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇＝20:1～10:1)，得白色固体141mg，产率72％。

¹H NMR(400MHz,MeOD)：δ7.61(d,J＝7.4Hz,6H),7.38(d,J＝7.5Hz,8H),7.30(d,J＝4.1Hz,4H),7.28–7.25(m,8H),7.20(t,J＝7.2Hz,8H),6.83(q,J＝7.2Hz,1H),5.60(dt,J＝23.2,11.3Hz,2H),5.42–5.33(m,1H),4.58(dd,J＝10.1,5.4Hz,2H),4.02–3.95(m,1H),2.62–2.57(m,2H),2.34(dd,J＝13.6,6.1Hz,1H),2.18(dd,J＝14.6,7.1Hz,3H),2.08–1.97(m,5H),1.04(dd,J＝10.3,6.7Hz,8H),0.93–0.88(m,10H)ppm；MS m/z 1077.46(M+Na⁺).

实施例9化合物LZG-PKU-H的合成：

室温下，将化合物7(100mg，0.09mmol)溶于甲醇，随后加入适量碘(68mg，0.27mmol)，搅拌反应30分钟，旋干溶剂，加入1M抗环血酸和1M柠檬酸水溶液，二氯甲烷萃取，无水Na₂SO₃干燥，过滤，减压浓缩，残留物经柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝3:1～1:1)，得白色固体17.8mg，产率33％。

制得的化合物LZG-PKU-H，分子量：568。

¹H NMR(400MHz,DMSO)：δ7.40–7.35(m,1H),7.35–7.31(m,1H),7.31–7.25(m,1H),7.24–7.20(m,1H),6.81–6.71(m,1H),6.49(dd,J＝16.9,5.5Hz,1H),5.95(s,1H),5.52(d,J＝10.3Hz,1H),4.85(t,J＝8.8Hz,1H),4.63(t,J＝5.5Hz,1H),3.91(d,J＝4.5Hz,1H),3.00–2.86(m,1H),2.69(d,J＝1.8Hz,1H),2.63–2.55(m,2H),2.35(s,1H),2.27(dt,J＝13.5,7.8Hz,2H),1.70(d,J＝7.2Hz,2H),1.58(d,J＝7.3Hz,2H),1.33(d,J＝15.9Hz,6H),1.06–1.00(m,5H),0.99–0.87(m,7H)ppm；MS m/z 569.13(M+Na⁺)，681.22(M+CF₃COO^-).

实施例10LZG-PKU-H在GSH存在下与FK-228稳定性的对比

将实施例9中得到的化合物LZG-PKU-H和FK-228(1mM)分别溶于30％乙腈和100mM的PBS缓冲液中，随后加入10mM的GSH(还原型谷胱甘肽)，37℃水浴条件下共孵育，分别取共孵育3-24小时之后的反应液，通过液相色谱-质谱联用仪进行分析，观察二硫键被还原情况。

LZG-PKU-H(1mM，分子量：568)在GSH(10mM)存在下的LC-MS图，如图1所示，该图表明在24小时内化合物的二硫键基本保持稳定，没有出现开环现象。

FK-228(1mM，分子量：540)在GSH(10mM)存在下不同孵育时间情况下的LC-MS图，如图2所示，该图表明FK-228在三小时内就开始出现开环现象。

结合图1和图2可知，化合物LZG-PKU-H较FK-228，其二硫键能够保持很强的稳定性。实施例11化合物LZG-PKU-H对Hela细胞核提取物(高表达HDAC1，2，6，8和4)的抑制实验

1)稀释50-200μg细胞核提取物至85μL的ddH₂O(去离子水)，用于酶活检测

2)空白孔：85μL的ddH₂O

3)100％酶活孔：10μLHeLa细胞核提取物，75μL的ddH₂O

4)正对照孔：10μLHeLa细胞核提取物，70μL ddH₂O，5μL梯度稀释SAHA(伏立诺他)(购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)

5)实验孔：10μLHeLa细胞核提取物，70μL ddH₂O，5μL梯度稀释的抑制剂(此处分别为LZG-PKU-H和FK-228)

6)每孔加10μL的10X HDAC实验缓冲液(HDAC实验缓冲液的配置：25mM Hepes(pH7.5)，300mM NaCl，10％甘油，0.04％Triton X-100)

7)每孔加入5μLHDAC荧光底物(荧光底物的配置：浓度为200μM的Boc-Lys(Ac)-AMC)，充分混匀，在37℃孵育1小时

8)终止反应：每孔加入10μL显影剂(developer)(10X 0.5％Trypsin-EDTA)，充分混匀，37℃孵育30分钟

9)酶标仪检测：用酶标仪检测酶的抑制活性，激发光340-360nm，发射光440-465nm，该体系在30分钟内保持稳定，尽量在30分钟内完成检测。％抑制率＝(100％酶活-实验孔酶活)/(100％酶活)×100。

具体结果如图3所示。图3是不同条件下FK-228和LAG-PKU-H对Hela细胞核提取物的酶活对照图(阳性对照：SAHA；图例所述的无还原剂是指在上述步骤中HDAC实验缓冲液未添加有任何能够还原二硫键的还原剂，诸如常用的谷胱甘肽，二硫苏糖醇，三(2-羧乙基)膦等；而加有还原剂即10mM GSH则是指在实验缓冲液中加入了10mM GSH)，由图3可知，化合物LZG-PKU-H即使在高浓度GSH存在的情况下，对Hela细胞核提取物亦具有较强的抑制HDAC活性，且较阳性SAHA的抑制活性强，与未被还原的FK-228抑制活性相当(图3所示)。同时图3酶活曲线提示，LZG-PKU-H在是否存在还原性物质如GSH的情况下都具有稳定的抑制HDAC能力，意味着其较FK-228有着较广的适用环境范围，或可改善其逆转耐药的缺陷。

Claims

1.一种缩酯环肽类化合物LZG-PKU-H，其特征在于：该化合物简称LZG-PKU-H，具有如下结构式：

2.一种缩酯环肽类化合物LZG-PKU-H的合成方法，其特征在于：由化合物1经包含如下步骤的合成方法制备得到：

(1)化合物1经酯化得到化合物1i，再经酰胺缩合得到化合物2：

(2)化合物2经酰胺缩合得到化合物3：

(4)化合物4和L-Val通过酯化反应得到化合物5：

(5)化合物5脱去羧基端保护基后得到化合物6：

(6)化合物6通过分子内酰胺缩合关环得到化合物7：

(7)化合物7氧化关环形成分子内二硫键得到化合物LZG-PKU-H：

3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于步骤(1)中，0℃-室温下，化合物1、Me₃SiEtOH、DIPEA和DMAP在有机溶剂中与TCBC进行反应制得化合物1i，其中化合物1、Me₃SiEtOH、TCBC、DIPEA和DMAP摩尔比范围为：1:2～3:1～1.3:1～1.3:0.1～0.3；在有机溶剂中，化合物1i、D-Pen、HATU和HOAt混合试剂、DIPEA的摩尔比范围为：1:1:1～1.3:1～1.3；其中，有机溶剂为二氯甲烷或乙腈中的一种。

4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于步骤(2)中，在有机溶剂中，室温下，化合物2、D-Val、HATU和HOAt混合试剂、DIPEA的摩尔比范围为1:1:1～1.3:1～1.3，其中有机溶剂为二氯甲烷或乙腈中的一种。

5.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于步骤(3)中，在吡啶中，0℃～室温下，化合物3、MsCl和DMAP的摩尔比范围为1:2～3:0.1～0.3，制得化合物3i；在有机溶剂中，室温下，化合物3i、DABCO、Hm7、HATU和HOAt混合试剂、DIPEA的摩尔比范围为1:5～10:1:1～1.3:1～1.3，其中有机溶剂为二氯甲烷或乙腈中的一种。

6.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于步骤(4)中，在有机溶剂中，室温下，化合物4、L-Val、TCBC、DIPEA和DMAP的摩尔比范围为：1:1:1.5～2:1～1.3:0.1～0.3，其中有机溶剂为二氯甲烷或乙腈中的一种。

7.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于步骤(5)中，在乙腈中，化合物5、氟化铯的摩尔比范围为：1:5～10。

8.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于步骤(6)中，在有机溶剂中，室温下，化合物6的摩尔浓度大于零且小于等于千分之五，有机溶剂为二氯甲烷或乙腈中的一种。

9.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于步骤(7)中，在甲醇中，室温下，化合物7和碘的摩尔比范围为：1:1～3。

10.根据权利要求1所述的缩酯环肽类化合物LZG-PKU-H在制备抑制HDAC活性的药物中的应用。