CN110256398B - 一种具有hdac抑制活性的亚甲基醚漆酚异羟肟酸衍生物的合成方法 - Google Patents

一种具有hdac抑制活性的亚甲基醚漆酚异羟肟酸衍生物的合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种具有HDAC抑制活性的亚甲基醚漆酚异羟肟酸衍生物的合成方法。以不饱和漆酚为原料，通过醚化反应阻断漆酚氧化聚合，通过Diels‑Alder、水解和羟氨化等反应，在漆酚侧链尾部引入异羟肟酸基团，并且在其苯环或烷基链引入硝基和羟基等不同药效基团，合成了3种亚甲基醚漆酚异羟肟酸衍生物，3种化合物均能很好地与HDAC的活性口袋结合，可与其残基形成稳定氢键相互作用，并能与活性口袋底部的Zn2+形成稳定螯合，具有很好的HDAC的抑制活性，3种化合物对HDAC 2和HDAC 8的半数抑制浓度(IC50)值与FDA批准的HDAC抑制剂SAHA的IC50值相当，可应用于临床抗肿瘤药物中，附加值极高，可以成为临床上开发新型漆酚基HDAC抑制剂的一种新技术。

Description

一种具有HDAC抑制活性的亚甲基醚漆酚异羟肟酸衍生物的合 成方法
技术领域
本发明属于药物合成化学技术领域，涉及一种亚甲基醚漆酚异羟肟酸衍生物的合成方法及其HDAC抑制活性。
背景技术
漆酚是漆树(Toxicodendron verniciflum(Stokes)F.A.Barkl.)分泌物生漆中的一种天然活性成分，是我国重要的林特产品，世界上85％的生漆产自中国。漆酚是一种邻苯二酚结构的烷基酚类化合物，其侧链为不同饱和度的C15的烷烃。漆酚具有很好的抗肿瘤生物活性，其对人体9种器官29种肿瘤细胞均有抑制作用，作用机理包括诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤血管生成、核转录因子抑制、毒杀肿瘤细胞等。干漆作为中药辅助治疗肿瘤在我国已有数千年的历史。因此漆酚非常有希望开发成抗癌药物，然而，漆酚的化学结构不稳定，容易氧化聚合，严重降低其抗肿瘤疗效，限制了不饱和漆酚作为抗肿瘤药物的开发与应用。
组蛋白去乙酰化酶(HDAC)是国内外公认的治疗癌症的重要靶点。HDAC异常导致的组蛋白乙酰化状态失衡与肿瘤的发生和发展有密切关系，HDAC的过度表达已经在大多数肿瘤细胞中被发现。HDAC抑制剂通过改变细胞内乙酰化水平，从而在调节基因的翻译过程、抑制细胞生长、诱发细胞凋亡或分化、抑制肿瘤细胞血管再生等方面产生抗肿瘤的活性。设计开发低毒、高效的HDAC抑制剂类似物已成为国内外抗肿瘤靶向药物研究的热点。按照结构特点，HDAC抑制剂可分为四大类：异羟肟酸类、苯甲酰胺类、亲电酮类和环肽类。其中异羟肟酸类化合物具有特异性强、抗肿瘤活性好且毒副作用小等优势，是目前研究最广泛且最深入的一类HDAC抑制剂，典型的异羟肟酸类HDAC抑制剂结构按功能可分为3部分：表面识别区、连接臂区和锌离子结合区；表面识别区主要由疏水片段构成，通常是苯环衍生物；连接臂区为脂肪链；锌离子结合区的功能基团为异羟肟酸。研究表明异羟肟酸基团是HDAC抑制剂的关键药效基团，其可直接与HDAC酶的Zn2+结构结合，从而有效抑制HDAC的活性。目前，Merck公司的异羟肟酸类HDAC抑制剂Vorinostat(SAHA)已被美国FDA批准用于治疗淋巴癌，此外，还有多个异羟肟酸类HDAC抑制剂处于临床研究阶段。
研究表明不饱和漆酚具有一定的HDAC抑制活性，其结构与FDA批准使用的HDAC抑制剂SAHA结构相似，但是还缺少HDAC抑制关键结构单元锌离子结合区。因此本发明以不饱和漆酚为原料，通过醚化反应阻断漆酚氧化聚合，通过Diels-Alder、水解和羟氨化等反应，在漆酚侧链尾部引入异羟肟酸基团，并且在其苯环或烷基链引入硝基和羟基等不同药效基团，合成了3种亚甲基醚漆酚异羟肟酸衍生物，3种化合物均能很好地与HDAC的活性口袋结合，可与其残基形成稳定氢键相互作用，并能与活性口袋底部的Zn2+形成稳定螯合，具有很好的HDAC的抑制活性，化合物1、2和3对HDAC 2的半数抑制浓度(IC50)分别为0.27，0.25和0.22ug/mL，对HDAC 8的半数抑制浓度(IC50)分别为0.29，0.26和0.24ug/mL，与FDA批准的HDAC抑制剂SAHA的IC50值相当，可应用于临床抗肿瘤药物中，附加值极高，可以成为临床上开发新型漆酚基HDAC抑制剂的一种新技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种合成具有HDAC抑制活性的亚甲基醚漆酚异羟肟酸衍生物的方法，该方法合成了3种亚甲基醚漆酚异羟肟酸衍生物，3种化合物均能很好地与HDAC的活性口袋结合，对HDAC 2和HDAC 8的半数抑制浓度(IC50)与FDA批准的HDAC抑制剂SAHA的IC50值相当，具有很好的HDAC的抑制活性，可开发新型漆酚基HDAC抑制剂用于抗肿瘤药物中，附加值极高。
本发明是通过以下技术方案实现的。
1.一种具有HDAC抑制活性的亚甲基醚漆酚异羟肟酸衍生物，包括化合物1，2和3，化学命名分别为5-(10-(苯并[d][1，3]二氧戊环-4-基)癸烷-2-烯-1-基)-N-羟基-2-甲基环己烷-3-烯-1-甲酰胺，5-(10-(苯并[d][1，3]二氧戊环-4-基)-3-羟基-癸烷基)-N-羟基-2-甲基环己烷-3-烯-1-甲酰胺和5-(10-(7-硝基苯并[d][1，3]二氧戊环-4-基)癸烷-2-烯-1-基)-N-羟基-2-甲基环己烷-3-烯-1-甲酰胺，其结构式分别如下：
Figure BSA0000184781430000021
Figure BSA0000184781430000031
2.所述的化合物1的合成方法包括如下步骤：
(1)以化合物I漆酚为原料，取一定量漆酚溶于DMF和DCM中，加入一定量NaH，氩气保护下回流过夜，冷却至室温后缓慢加入一定量水，用DCM萃取3次，合并有机层，用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后，减压蒸干，柱层析，以PE洗脱，洗脱液减压蒸干得化合物II；
(2)取一定量化合物II溶于甲苯，加入一定量丙烯酸酯，氩气保护下加热回流36小时，减压蒸干溶剂，加入一定量乙醇和KOH，加热回流10分钟，减压蒸干溶剂，加入一定量水，用EA萃取3次，合并萃取液用无水硫酸钠干燥，减压蒸干，柱层析，用PE-EA洗脱，洗脱液减压蒸干得化合物III；
(3)取一定量化合物III溶于无水DMF中，加入一定量DIPEA、硅基保护羟胺和HATU，反应搅拌过夜，减压蒸干溶剂，直接柱层析，以二氯甲烷-甲醇洗脱，洗脱液减压蒸干后产物溶于一定量TBAF-THF溶液中，室温搅拌40分钟，减压蒸干，直接柱层析，以DCM-MeOH洗脱，洗脱液减压蒸干产物进一步用HPLC纯化，即得到目标化合物1。
步骤(1)中所述漆酚来源于生漆，是以生漆为原料经过甲醇萃取而得，得到的漆酚纯度≥90％。
步骤(3)中所述HPLC纯化方法，其色谱柱为C18制备柱，流动相为乙腈-水，比例为75∶25，检测波长210nm。
化合物1的合成路线如下：
Figure BSA0000184781430000041
3.所述的化合物2的合成方法包括如下步骤：
(1)以化合物III为原料，取一定量III溶于二氯甲烷中，加入一定量mCPBA，室温搅拌过夜，饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次，无水硫酸钠干燥，减压蒸干得到无色油状物，将其全部溶于无水四氢呋喃中，缓慢滴加到一定量的100mg/mL氢化铝锂混悬液中，滴加完毕后升温至70℃反应2小时，冷却至室温后，缓慢加入一定量水，再加入一定量的15％氢氧化钠溶液，再次加入一定量水，搅拌30分钟后过滤，四氢呋喃洗涤，滤液减压除去四氢呋喃，加入一定量水，用乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，减压蒸干，用硅胶柱层析，用PE-EA洗脱，洗脱液减压蒸干，得化合物IV；
(2)取化合物IV溶于一定量丙酮中，冰水浴降温，加入一定量Jones试剂，室温反应30min后，加入一定量异丙醇，搅拌20min，加入一定量饱和氯化钠溶液，用EA萃取5次，合并萃取液，无水硫酸钠干燥，减压蒸干，硅胶柱层析，用PE-EA洗脱，洗脱液减压蒸干得化合物V；
(3)取化合物V溶于一定量甲醇中，加入一定量NaBH4，室温反应30min，减压蒸干用一定量EA溶解，饱和食盐水洗涤两次，用EA萃取2次，合并萃取液，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，真空干燥2h，加入一定量DCM，NH2OTHP，EDC.Cl和TEA，反应过夜，用5％柠檬酸水溶液洗涤2次后，用DCM萃取2次，合并有机相，减压蒸干溶剂，加入甲醇溶解，冰水浴降温，加入一定量10％HCl溶液，反应1h，减压蒸干溶剂，用甲醇溶解，微孔滤膜过滤，进一步用HPLC纯化，即得到目标化合物2。
步骤(3)中所述HPLC纯化方法，其色谱柱为C18制备柱，流动相为乙腈-水，比例为68∶32，检测波长210nm。
化合物2的合成路线如下：
Figure BSA0000184781430000051
4.所述的化合物3的合成方法包括如下步骤：
(1)以化合物III为原料，取一定量III溶于新蒸醋酐中，降温至0℃，剧烈搅拌下加入一定量无水硝酸铜，2小时后加入一定量无水硝酸铜，3小时后加入一定量水，搅拌20分钟后用乙酸乙酯萃取2次，合并有机层用饱和碳酸氢钠溶液洗涤2次，无水硫酸镁干燥，减压蒸干得淡黄色油状物；
(2)将第一步所得淡黄色油状物溶于甲醇中，加入一定量水和氢氧化钾，加热回流3小时后减压蒸干溶剂，加入一定量水，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，减压蒸干得淡黄色油状物；
(3)将第二步所得淡黄色油状物在45℃真空干燥5小时后溶于无水二氯甲烷中，加入一定量NH2OTHP，TBTU和DIPEA，室温反应6小时后，用10％柠檬酸水溶液洗涤2次，饱和碳酸氢钠溶液洗涤2次，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，用硅胶柱层析，用PE-EA洗脱，洗脱液减压蒸干得无色油状物；
(4)将第三步所得无色油状物溶于甲醇中，加入一定量6M盐酸溶液，室温搅拌2小时，减压蒸干溶剂，加入一定量水，乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂得淡黄色油状物，将其溶于色谱甲醇中，微孔滤膜过滤，进一步HPLC纯化，即得到目标化合物3。
步骤(3)中所述HPLC纯化方法，其色谱柱为C18制备柱，流动相为乙腈-水，比例为70∶30，检测波长210nm。
化合物3的合成路线如下：
Figure BSA0000184781430000061
本发明以三烯烷基漆酚为起始原料，与二氯甲烷和NaH进行醚化反应，生成亚甲基醚漆酚，可有效阻断漆酚的氧化聚合，利用漆酚烷基侧链的共轭双键与丙烯酸酯进行Diels-Alder反应，再通过水解得到具有环己烯甲酸结构的关键中间体化合物III，将化合物III与硅基保护羟胺和HATU进行反应，即可得到侧链尾部具有异羟肟酸基团的目标化合物1；为了考察漆酚苯环和脂肪链上引入功能基团对HDAC抑制活性的影响，合成了目标化合物2和3；以中间体化合物III为原料，先与mCPBA反应，使脂肪链上双键氧化成酮，再通过氢化铝锂还原成羟基，但同时化合物III侧链尾部的羰基也被还原成羟基，因此继续通过与Jones试剂进行氧化反应，与NaBH4进行还原反应得到中间体化合物VI，将化合物VI与NH2OTHP反应，即得到脂肪链上具有羟基结构的目标化合物2；以中间体化合物III为原料，先与无水硝酸铜进行反应，使苯环上引入硝基，再与NH2OTHP反应，即得到苯环上具有硝基结构的目标化合物3；本发明通过1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS、IR等技术手段对3种目标化合物的结构进行了确证。
本发明采用分子模拟软件对3种化合物分子分别与HDAC 2和HDAC 8晶体结构进行了分子对接研究；Glide评分结果表明化合物1、2和3与HDAC 2的对接分数分别为-7.724，-7.914和-7.946，与HDAC 8的对接分数分别为-9.230，-9.583和-9.835；3种化合物均能很好地与HDAC2和HDAC 8的活性口袋结合，其异羟肟酸基团都可和口袋底部的Zn2+形成稳定螯合，3种化合物可和HDAC 2酶的His145、Tyr308、Glu103和Asp104等残基形成稳定氢键相互作用，可和HDAC 8酶的Gly140、His143、Lys33、Ala32、His142和Tyr154等残基形成稳定氢键相互作用；3种化合物中化合物2和3显示出较高的Glide评分，这表明在漆酚的烷基侧链中引入电子供体基团羟基或在苯环上引入硝基等取代基可显著提高其对HDAC 2和HDAC 8的结合亲和力，因为它们能与残基形成更多更强的氢键相互作用。
本发明采用HDAC检测试剂盒分别测定了3种化合物对HDAC2和HDAC8的抑制活性；化合物1、2和3对HDAC 2和HDAC8均起到了良好的抑制作用，抑制率均随着浓度的增加呈上升趋势，当浓度为20ug/mL时，化合物1、2和3对HDAC 2的抑制率分别为95.6％，96.5％和97.9％，对HDAC 8的抑制率分别为94.8％，95.4％和96.9％，化合物1、2和3对HDAC 2的半数抑制浓度(IC50)分别为0.27，0.25和0.22ug/mL，对HDAC 8的半数抑制浓度(IC50)分别为0.29，0.26和0.24ug/mL，3种化合物的IC50值和阳性药SAHA的IC50值相当。
本发明的有益效果：
(1)本发明以天然漆酚为原料合成HDAC抑制剂，漆酚是漆树的分泌物，其来源广泛易得，绿色安全可再生，且漆酚具有很好的抗肿瘤活性，其结构与FDA批准使用的HDAC抑制剂SAHA结构相似，因此以漆酚为原料开发天然靶向抗肿瘤药物具有很好的应用前景。
(2)本发明以漆酚为原料，通过醚化反应阻断漆酚氧化聚合，可使漆酚化学结构稳定，通过Diels-Alder、水解和羟氨化等反应，在漆酚侧链尾部引入HDAC抑制关键药效基团异羟肟酸，可使其靶向作用于HDAC酶口袋部位，与HDAC酶中锌离子有效螯合，达到选择性抑制HDAC酶的效果，而且可改善不饱和漆酚的生物相容性；通过在漆酚苯环或烷基链引入硝基和羟基等药效基团，可增强其HDAC抑制活性，提高其对HDAC酶的识别和结合力。
(3)本发明合成的3种亚甲基醚漆酚异羟肟酸衍生物，均能很好地与HDAC的活性口袋结合，可与其残基形成稳定氢键相互作用，并能与活性口袋底部的Zn2+形成稳定螯合，具有很好的HDAC的抑制活性，3种化合物对HDAC 2的半数抑制浓度(IC50)分别为0.27，0.25和0.22ug/mL，对HDAC 8的半数抑制浓度(IC50)分别为0.29，0.26和0.24ug/mL，与FDA批准的HDAC抑制剂SAHA的IC50值相当，因此本发明合成的亚甲基醚漆酚异羟肟酸衍生物非常有望开发成为新型天然HDAC抑制剂，应用于靶向抗肿瘤药物中，有效提高天然漆酚的附加值。
具体实施方式
以下实施例对本发明作进一步详细的描述，本发明不受此限制。
实施例1
目标化合物1的合成
(1)取化合物I漆酚3g溶于50mL DMF和50mL DCM中，加入0.8g NaH，氩气保护下回流过夜，冷却至室温后缓慢加入100mL水，用DCM萃取3次，每次60mL，合并萃取液，用饱和食盐水洗2次，每次90mL，无水硫酸钠干燥后，减压蒸干，柱层析，以PE洗脱，洗脱液减压蒸干得化合物II；
(2)取化合物II 1.2g溶于2mL甲苯，加入2mL丙烯酸酯，氩气保护下加热回流36小时，减压蒸干溶剂，加入10mL乙醇和1.2g KOH，加热回流10分钟，减压蒸干溶剂，加入10mL水，用EA萃取3次，每次15mL，合并萃取液，用无水硫酸钠干燥，减压蒸干，柱层析，用PE-EA洗脱，PE∶EA＝100∶1到3∶1，洗脱液减压蒸干得化合物III；
(3)取化合物III 30mg溶于1mL无水DMF中，加入30uL DIPEA、110mg硅基保护羟胺和57mg HATU，反应搅拌过夜，减压蒸干溶剂，直接柱层析，以二氯甲烷-甲醇洗脱，二氯甲烷∶甲醇＝200∶1，洗脱液减压蒸干后产物溶于2mL TBAF-THF溶液中，室温搅拌40分钟，减压蒸干，直接柱层析，以DCM-MeOH洗脱，DCM∶MeOH＝50∶1，洗脱液减压蒸干产物用HPLC纯化，色谱柱为C18制备柱，流动相为乙腈-水，比例为75∶25，检测波长210nm，收集目标组分减压蒸干即得到11.6mg目标化合物1。
目标化合物2的合成
(1)取化合物III415mg溶于5mL二氯甲烷中，加入250mg的mCPBA，室温搅拌过夜，饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次，每次用量5mL，无水硫酸钠干燥，减压蒸干得到无色油状物，将其全部溶于2mL无水四氢呋喃中，缓慢滴加到5mL的含500mg氢化铝锂混悬液中，滴加完毕后升温至70℃反应2小时，冷却至室温后，缓慢加入0.5mL水，再加入0.5mL的15％氢氧化钠溶液，再次加入1.5mL水，搅拌30分钟后过滤，用5mL四氢呋喃洗涤，滤液减压除去四氢呋喃，加入3mL水，用乙酸乙酯萃取4次，每次用量3mL，合并萃取液，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，减压蒸干，用硅胶柱层析，用PE-EA洗脱，PE∶EA＝3∶1到2∶1，洗脱液减压蒸干，得化合物IV；
(2)取化合物IV 59mg溶于0.5mL丙酮中，冰水浴降温，加入200uL的Jones试剂，室温反应30min后，加入100uL异丙醇，搅拌20min，加入2mL饱和氯化钠溶液，用EA萃取5次，每次用量2mL，合并萃取液，无水硫酸钠干燥，减压蒸干，硅胶柱层析，用PE-EA洗脱，PE∶EA＝1∶1，洗脱液减压蒸干得化合物V；
(3)取化合物V55mg溶于0.5mL甲醇中，加入10mg的NaBH4，室温反应30min，减压蒸干用3mL的EA溶解，饱和食盐水洗涤两次，用EA萃取2次，每次用量3mL，合并萃取液，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，真空干燥2h，加入1mL DCM，13mg NH2OTHP，15mg EDC.Cl和20uL的TEA，反应过夜，用2mL 5％柠檬酸水溶液洗涤2次后，用DCM萃取2次，每次用量3mL，合并有机相，减压蒸干溶剂，加入0.8mL甲醇溶解，冰水浴降温，加入1mL 10％HCl溶液，反应1h，减压蒸干溶剂，用2mL甲醇溶解，微孔滤膜过滤，进一步用HPLC纯化，色谱柱为C18制备柱，流动相为乙腈-水，比例为68∶32，检测波长210nm，收集目标组分减压蒸干即得到30mg的目标化合物2。
目标化合物3的合成
(1)取化合物III620mg溶于5mL新蒸醋酐中，降温至0℃，剧烈搅拌下加入300mg无水硝酸铜，2小时后加入295mg无水硝酸铜，3小时后加入15mL水，搅拌20分钟后用乙酸乙酯萃取2次，每次用量10mL，合并有机层用饱和碳酸氢钠溶液洗涤2次，每次用量20mL，无水硫酸镁干燥，减压蒸干得淡黄色油状物；
(2)将第一步所得淡黄色油状物溶于10mL甲醇中，加入0.5mL水和1.1g氢氧化钾，加热回流3小时后减压蒸干溶剂，加入5mL水，用乙酸乙酯萃取3次，每次用量5mL，合并萃取液，用10mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，减压蒸干得淡黄色油状物；
(3)将第二步所得淡黄色油状物在45℃真空干燥5小时后溶于5mL无水二氯甲烷中，加入160mg NH2OTHP，400mg TBTU和0.6mL DIPEA，室温反应6小时后，用10％柠檬酸水溶液洗涤2次，每次用量5mL，饱和碳酸氢钠溶液洗涤2次，每次用量10mL，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，用硅胶柱层析，用PE-EA洗脱，PE∶EA＝3∶1到2∶1，洗脱液减压蒸干得无色油状物；
(4)将第三步所得无色油状物溶于3mL甲醇中，加入0.5mL 6M盐酸溶液，室温搅拌2小时，减压蒸干溶剂，加入3mL水，乙酸乙酯萃取3次，每次用量3mL，合并萃取液，用5mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤，再用5mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂得淡黄色油状物，将其溶于1mL色谱甲醇中，微孔滤膜过滤，进一步HPLC纯化，色谱柱为C18制备柱，流动相为乙腈-水，比例为70∶30，检测波长210nm，收集目标组分减压蒸干即得到200mg目标化合物3。
实施例2
目标化合物1的合成
(1)取化合物I漆酚4g溶于60mL DMF和60mL DCM中，加入0.85g NaH，氩气保护下回流过夜，冷却至室温后缓慢加入100mL水，用DCM萃取3次，每次60mL，合并萃取液，用饱和食盐水洗2次，每次100mL，无水硫酸钠干燥后，减压蒸干，柱层析，以PE洗脱，洗脱液减压蒸干得化合物II；
(2)取化合物II 1.5g溶于3mL甲苯，加入3mL丙烯酸酯，氩气保护下加热回流36小时，减压蒸干溶剂，加入15mL乙醇和1.5g KOH，加热回流10分钟，减压蒸干溶剂，加入15mL水，用EA萃取3次，每次15mL，合并萃取液，用无水硫酸钠干燥，减压蒸干，柱层析，用PE-EA洗脱，PE∶EA＝100∶1到3∶1，洗脱液减压蒸干得化合物III；
(3)取化合物III 40mg溶于2mL无水DMF中，加入40uL DIPEA、120mg硅基保护羟胺和60mg HATU，反应搅拌过夜，减压蒸干溶剂，直接柱层析，以二氯甲烷-甲醇洗脱，二氯甲烷∶甲醇＝200∶1，洗脱液减压蒸干后产物溶于3mL TBAF-THF溶液中，室温搅拌40分钟，减压蒸干，直接柱层析，以DCM-MeOH洗脱，DCM∶MeOH＝50∶1，洗脱液减压蒸干产物用HPLC纯化，色谱柱为C18制备柱，流动相为乙腈-水，比例为75∶25，检测波长210nm，收集目标组分减压蒸干即得到12.5mg目标化合物1。
目标化合物2的合成
(1)取化合物III450mg溶于6mL二氯甲烷中，加入300mg的mCPBA，室温搅拌过夜，饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次，每次用量6mL，无水硫酸钠干燥，减压蒸干得到无色油状物，将其全部溶于3mL无水四氢呋喃中，缓慢滴加到6mL的含600mg氢化铝锂混悬液中，滴加完毕后升温至70℃反应2小时，冷却至室温后，缓慢加入0.8mL水，再加入0.8mL的15％氢氧化钠溶液，再次加入2.0mL水，搅拌30分钟后过滤，用5mL四氢呋喃洗涤，滤液减压除去四氢呋喃，加入4mL水，用乙酸乙酯萃取4次，每次用量4mL，合并萃取液，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，减压蒸干，用硅胶柱层析，用PE-EA洗脱，PE∶EA＝3∶1到2∶1，洗脱液减压蒸干，得化合物IV；
(2)取化合物IV60mg溶于0.5mL丙酮中，冰水浴降温，加入200uL的Jones试剂，室温反应30min后，加入100uL异丙醇，搅拌20min，加入3mL饱和氯化钠溶液，用EA萃取5次，每次用量3mL，合并萃取液，无水硫酸钠干燥，减压蒸干，硅胶柱层析，用PE-EA洗脱，PE∶EA＝1∶1，洗脱液减压蒸干得化合物V；
(3)取化合物V60mg溶于0.6mL甲醇中，加入10mg的NaBH4，室温反应30min，减压蒸干用4mL的EA溶解，饱和食盐水洗涤两次，用EA萃取2次，每次用量4mL，合并萃取液，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，真空干燥2h，加入1mL DCM，15mg NH2OTHP，15mg EDC.Cl和20uL的TEA，反应过夜，用3mL 5％柠檬酸水溶液洗涤2次后，用DCM萃取2次，每次用量4mL，合并有机相，减压蒸干溶剂，加入0.8mL甲醇溶解，冰水浴降温，加入1mL 10％HCl溶液，反应1h，减压蒸干溶剂，用3mL甲醇溶解，微孔滤膜过滤，进一步用HPLC纯化，色谱柱为C18制备柱，流动相为乙腈-水，比例为68∶32，检测波长210nm，收集目标组分减压蒸干即得到32mg的目标化合物2。
目标化合物3的合成
(1)取化合物III 700mg溶于6mL新蒸醋酐中，降温至0℃，剧烈搅拌下加入350mg无水硝酸铜，2小时后加入300mg无水硝酸铜，3小时后加入20mL水，搅拌20分钟后用乙酸乙酯萃取2次，每次用量15mL，合并有机层用饱和碳酸氢钠溶液洗涤2次，每次用量20mL，无水硫酸镁干燥，减压蒸干得淡黄色油状物；
(2)将第一步所得淡黄色油状物溶于10mL甲醇中，加入0.6mL水和1.2g氢氧化钾，加热回流3小时后减压蒸干溶剂，加入6mL水，用乙酸乙酯萃取3次，每次用量6mL，合并萃取液，用15mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，减压蒸干得淡黄色油状物；
(3)将第二步所得淡黄色油状物在45℃真空干燥5小时后溶于6mL无水二氯甲烷中，加入160mg NH2OTHP，400mg TBTU和0.6mL DIPEA，室温反应6小时后，用10％柠檬酸水溶液洗涤2次，每次用量6mL，饱和碳酸氢钠溶液洗涤2次，每次用量10mL，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，用硅胶柱层析，用PE-EA洗脱，PE∶EA＝3∶1到2∶1，洗脱液减压蒸干得无色油状物；
(4)将第三步所得无色油状物溶于4mL甲醇中，加入0.6mL 6M盐酸溶液，室温搅拌2小时，减压蒸干溶剂，加入5mL水，乙酸乙酯萃取3次，每次用量5mL，合并萃取液，用5mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤，再用5mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂得淡黄色油状物，将其溶于1mL色谱甲醇中，微孔滤膜过滤，进一步HPLC纯化，色谱柱为C18制备柱，流动相为乙腈-水，比例为70∶30，检测波长210nm，收集目标组分减压蒸干即得到210mg目标化合物3。
实施例3：
目标化合物1的合成
(1)取化合物I漆酚5g溶于90mL DMF和90mL DCM中，加入1.2g NaH，氩气保护下回流过夜，冷却至室温后缓慢加入150mL水，用DCM萃取3次，每次100mL，合并萃取液，用饱和食盐水洗2次，每次100mL，无水硫酸钠干燥后，减压蒸干，柱层析，以PE洗脱，洗脱液减压蒸干得化合物II；
(2)取化合物II 2.0g溶于4mL甲苯，加入4mL丙烯酸酯，氩气保护下加热回流36小时，减压蒸干溶剂，加入16mL乙醇和1.9g KOH，加热回流10分钟，减压蒸干溶剂，加入15mL水，用EA萃取3次，每次15mL，合并萃取液，用无水硫酸钠干燥，减压蒸干，柱层析，用PE-EA洗脱，PE∶EA＝100∶1到3∶1，洗脱液减压蒸干得化合物III；
(3)取化合物III 50mg溶于2mL无水DMF中，加入48uL DIPEA、170mg硅基保护羟胺和90mg HATU，反应搅拌过夜，减压蒸干溶剂，直接柱层析，以二氯甲烷-甲醇洗脱，二氯甲烷∶甲醇＝200∶1，洗脱液减压蒸干后产物溶于3.5mL TBAF-THF溶液中，室温搅拌40分钟，减压蒸干，直接柱层析，以DCM-MeOH洗脱，DCM∶MeOH＝50∶1，洗脱液减压蒸干产物用HPLC纯化，色谱柱为C18制备柱，流动相为乙腈-水，比例为75∶25，检测波长210nm，收集目标组分减压蒸干即得到19mg目标化合物1。
目标化合物2的合成
(1)取化合物III 650mg溶于9mL二氯甲烷中，加入400mg的mCPBA，室温搅拌过夜，饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次，每次用量8mL，无水硫酸钠干燥，减压蒸干得到无色油状物，将其全部溶于3mL无水四氢呋喃中，缓慢滴加到8mL的含800mg氢化铝锂混悬液中，滴加完毕后升温至70℃反应2小时，冷却至室温后，缓慢加入0.8mL水，再加入0.8mL的15％氢氧化钠溶液，再次加入2.5mL水，搅拌30分钟后过滤，用8mL四氢呋喃洗涤，滤液减压除去四氢呋喃，加入5mL水，用乙酸乙酯萃取4次，每次用量5mL，合并萃取液，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，减压蒸干，用硅胶柱层析，用PE-EA洗脱，PE∶EA＝3∶1到2∶1，洗脱液减压蒸干，得化合物IV；
(2)取化合物IV 95mg溶于0.8mL丙酮中，冰水浴降温，加入300uL的Jones试剂，室温反应30min后，加入160uL异丙醇，搅拌20min，加入3mL饱和氯化钠溶液，用EA萃取5次，每次用量3mL，合并萃取液，无水硫酸钠干燥，减压蒸干，硅胶柱层析，用PE-EA洗脱，PE∶EA＝1∶1，洗脱液减压蒸干得化合物V；
(3)取化合物V 85mg溶于0.8mL甲醇中，加入16mg的NaBH4，室温反应30min，减压蒸干用5mL的EA溶解，饱和食盐水洗涤两次，用EA萃取2次，每次用量5mL，合并萃取液，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，真空干燥2h，加入1.5mL DCM，20mg NH2OTHP，20mg EDC.Cl和30uL的TEA，反应过夜，用3mL 5％柠檬酸水溶液洗涤2次后，用DCM萃取2次，每次用量5mL，合并有机相，减压蒸干溶剂，加入1.2mL甲醇溶解，冰水浴降温，加入1.5mL 10％HCl溶液，反应1h，减压蒸干溶剂，用3mL甲醇溶解，微孔滤膜过滤，进一步用HPLC纯化，色谱柱为C18制备柱，流动相为乙腈-水，比例为68∶32，检测波长210nm，收集目标组分减压蒸干即得到47mg的目标化合物2。
目标化合物3的合成
(1)取化合物III 950mg溶于8mL新蒸醋酐中，降温至0℃，剧烈搅拌下加入500mg无水硝酸铜，2小时后加入450mg无水硝酸铜，3小时后加入25mL水，搅拌20分钟后用乙酸乙酯萃取2次，每次用量15mL，合并有机层用饱和碳酸氢钠溶液洗涤2次，每次用量30mL，无水硫酸镁干燥，减压蒸干得淡黄色油状物；
(2)将第一步所得淡黄色油状物溶于16mL甲醇中，加入0.8mL水和1.6g氢氧化钾，加热回流3小时后减压蒸干溶剂，加入8mL水，用乙酸乙酯萃取3次，每次用量8mL，合并萃取液，用15mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，减压蒸干得淡黄色油状物；
(3)将第二步所得淡黄色油状物在45℃真空干燥5小时后溶于8mL无水二氯甲烷中，加入250mg NH2OTHP，650mg TBTU和0.9mL DIPEA，室温反应6小时后，用10％柠檬酸水溶液洗涤2次，每次用量8mL，饱和碳酸氢钠溶液洗涤2次，每次用量15mL，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，用硅胶柱层析，用PE-EA洗脱，PE∶EA＝3∶1到2∶1，洗脱液减压蒸干得无色油状物；
(4)将第三步所得无色油状物溶于5mL甲醇中，加入0.8mL 6M盐酸溶液，室温搅拌2小时，减压蒸干溶剂，加入5mL水，乙酸乙酯萃取3次，每次用量5mL，合并萃取液，用8mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤，再用8mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂得淡黄色油状物，将其溶于2mL色谱甲醇中，微孔滤膜过滤，进一步HPLC纯化，色谱柱为C18制备柱，流动相为乙腈-水，比例为70∶30，检测波长210nm，收集目标组分减压蒸干即得到315mg目标化合物3。
实施例4：
3种化合物的结构鉴定
采用1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS、IR等手段对合成的目标化合物1，2和3的化学结构进行了鉴定和确证，3种化合物的理化性质及波谱数据见表1。
表1 化合物1、2和3的物理化学常数和光谱数据
Figure BSA0000184781430000141
实施例5：
3种化合物与HDAC 2和HDAC 8的分子对接
本发明采用GLIDE程序将化合物1、2和3分子分别与HDAC 2晶体结构(PDB ID：4LXZ)和HDAC 8晶体结构(PDB ID：3SFF)进行对接；并采用Grid评分函数评价化合物与HDAC2和HDAC 8的对接效果，Glide评分结果表明化合物1、2和3与HDAC 2的对接分数分别为-7.724，-7.914和-7.946，与HDAC 8的对接分数分别为-9.230，-9.583和-9.835；3种化合物均能很好地与HDAC 2和HDAC 8的活性口袋结合，3种化合物的脂肪链部分占据了口袋中长而窄的管道部位，异羟肟酸基团都位于管道的底部，异羟肟酸基团都可和口袋底部的Zn2+形成稳定螯合，异羟肟酸基团中羟基和羰基可与HDAC 2酶的His145和Tyr308残基形成稳定氢键相互作用，可与HDAC8酶的Gly140和His143残基形成稳定氢键相互作用；此外化合物2脂肪链上羟基和化合物3苯环上硝基还可与HDAC 2酶的Glu103和Asp104等残基形成稳定氢键相互作用，可与HDAC 8酶的Lys33、Ala32、His142和Tyr154等残基形成稳定氢键相互作用；3种化合物中化合物2和3显示出较高的Glide评分，这表明在漆酚的烷基侧链中引入电子供体基团羟基或在苯环上引入硝基等取代基可显著提高其对HDAC 2和HDAC 2的结合亲和力，因为它们能与残基形成更多更强的氢键相互作用。
实施例6：
3种化合物对HDAC 2和HDAC 8的抑制活性评价
本发明采用HDAC检测试剂盒分别测定了3种化合物对HDAC2和HDAC8的抑制活性；化合物1、2和3对HDAC 2和HDAC8均起到了良好的抑制作用，抑制率均随着浓度的增加呈上升趋势，呈现出明显的浓度依赖性。当浓度为20ug/mL时，化合物1、2和3对HDAC 2的抑制率分别为95.6％，96.5％和97.9％，对HDAC 8的抑制率分别为94.8％，95.4％和96.9％，化合物1、2和3对HDAC 2的半数抑制浓度(IC50)分别为0.27，0.25和0.22ug/mL，对HDAC 8的半数抑制浓度(IC50)分别为0.29，0.26和0.24ug/mL；而阳性药SAHA对HDAC 2的半数抑制浓度(IC50)为0.21ug/mL，对HDAC 8的半数抑制浓度(IC50)为0.23ug/mL；因此本发明合成的3种化合物的IC50值和阳性药SAHA的IC50值相当。此外化合物2和3对HDAC 2和HDAC 8的抑制效果要优于化合物1，3种化合物对HDAC 2和HDAC 8的抑制结果与分子对接结果一致，表明在漆酚的烷基侧链中引入电子供体基团羟基或在苯环上引入硝基等取代基可显著提高其对HDAC 2和HDAC8的抑制活性。
表2 不同浓度化合物对HDAC 2和HDAC 8抑制率的影响
Figure BSA0000184781430000151

Claims (7)

1.一种具有HDAC抑制活性的亚甲基醚漆酚异羟肟酸衍生物的合成方法，其特征在于化合物1的合成方法包括如下步骤：
Figure FSB0000195937450000011
(1)以化合物I漆酚为原料，取一定量漆酚溶于DMF和DCM中，加入一定量NaH，氩气保护下回流过夜，冷却至室温后缓慢加入一定量水，用DCM萃取3次，合并有机层，用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后，减压蒸干，柱层析，以PE洗脱，洗脱液减压蒸干得化合物II；
(2)取一定量化合物II溶于甲苯，加入一定量丙烯酸酯，氩气保护下加热回流36小时，减压蒸干溶剂，加入一定量乙醇和KOH，加热回流10分钟，减压蒸干溶剂，加入一定量水，用EA萃取3次，合并萃取液用无水硫酸钠干燥，减压蒸干，柱层析，用PE-EA洗脱，洗脱液减压蒸干得化合物III；
(3)取一定量化合物III溶于无水DMF中，加入一定量DIPEA、硅基保护羟胺和HATU，反应搅拌过夜，减压蒸干溶剂，直接柱层析，以二氯甲烷-甲醇洗脱，洗脱液减压蒸干后产物溶于一定量TBAF-THF溶液中，室温搅拌40分钟，减压蒸干，直接柱层析，以DCM-MeOH洗脱，洗脱液减压蒸干产物进一步用HPLC纯化，即得到目标化合物1。
2.一种具有HDAC抑制活性的亚甲基醚漆酚异羟肟酸衍生物的合成方法，其特征在于化合物2的合成方法包括如下步骤：
Figure FSB0000195937450000021
(1)以化合物III为原料，取一定量III溶于二氯甲烷中，加入一定量mCPBA，室温搅拌过夜，饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次，无水硫酸钠干燥，减压蒸干得到无色油状物，将其全部溶于无水四氢呋喃中，缓慢滴加到一定量的100mg/mL氢化铝锂混悬液中，滴加完毕后升温至70℃反应2小时，冷却至室温后，缓慢加入一定量水，再加入一定量的15％氢氧化钠溶液，再次加入一定量水，搅拌30分钟后过滤，四氢呋喃洗涤，滤液减压除去四氢呋喃，加入一定量水，用乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，减压蒸干，用硅胶柱层析，用PE-EA洗脱，洗脱液减压蒸干，得化合物IV；
(2)取化合物IV溶于一定量丙酮中，冰水浴降温，加入一定量Jones试剂，室温反应30min后，加入一定量异丙醇，搅拌20min，加入一定量饱和氯化钠溶液，用EA萃取5次，合并萃取液，无水硫酸钠干燥，减压蒸干，硅胶柱层析，用PE-EA洗脱，洗脱液减压蒸干得化合物V；
(3)取化合物V溶于一定量甲醇中，加入一定量NaBH4，室温反应30min，减压蒸干用一定量EA溶解，饱和食盐水洗涤两次，用EA萃取2次，合并萃取液，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，真空干燥2h，加入一定量DCM，NH2OTHP，EDC.Cl和TEA，反应过夜，用5％柠檬酸水溶液洗涤2次后，用DCM萃取2次，合并有机相，减压蒸干溶剂，加入甲醇溶解，冰水浴降温，加入一定量10％HCl溶液，反应1h，减压蒸干溶剂，用甲醇溶解，微孔滤膜过滤，进一步用HPLC纯化，即得到目标化合物2。
3.一种具有HDAC抑制活性的亚甲基醚漆酚异羟肟酸衍生物的合成方法，其特征在于化合物3的合成方法包括如下步骤：
Figure FSB0000195937450000031
(1)以化合物III为原料，取一定量III溶于新蒸醋酐中，降温至0℃，剧烈搅拌下加入一定量无水硝酸铜，2小时后加入一定量无水硝酸铜，3小时后加入一定量水，搅拌20分钟后用乙酸乙酯萃取2次，合并有机层用饱和碳酸氢钠溶液洗涤2次，无水硫酸镁干燥，减压蒸干得淡黄色油状物；
(2)将第一步所得淡黄色油状物溶于甲醇中，加入一定量水和氢氧化钾，加热回流3小时后减压蒸干溶剂，加入一定量水，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，减压蒸干得淡黄色油状物；
(3)将第二步所得淡黄色油状物在45℃真空干燥5小时后溶于无水二氯甲烷中，加入一定量NH2OTHP，TBTU和DIPEA，室温反应6小时后，用10％柠檬酸水溶液洗涤2次，饱和碳酸氢钠溶液洗涤2次，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，用硅胶柱层析，用PE-EA洗脱，洗脱液减压蒸干得无色油状物；
(4)将第三步所得无色油状物溶于甲醇中，加入一定量6M盐酸溶液，室温搅拌2小时，减压蒸干溶剂，加入一定量水，乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂得淡黄色油状物，将其溶于色谱甲醇中，微孔滤膜过滤，进一步HPLC纯化，即得到目标化合物3。
4.根据权利要求1所述的一种具有HDAC抑制活性的亚甲基醚漆酚异羟肟酸衍生物的合成方法，其特征在于步骤(1)中所述漆酚来源于生漆，是以生漆为原料经过甲醇萃取而得，得到的漆酚纯度≥90％。
5.根据权利要求1所述的一种具有HDAC抑制活性的亚甲基醚漆酚异羟肟酸衍生物的合成方法，其特征在于步骤(3)中所述HPLC纯化方法，其色谱柱为C18制备柱，流动相为乙腈-水，比例为75∶25，检测波长210nm。
6.根据权利要求2所述的一种具有HDAC抑制活性的亚甲基醚漆酚异羟肟酸衍生物的合成方法，其特征在于步骤(3)中所述HPLC纯化方法，其色谱柱为C18制备柱，流动相为乙腈-水，比例为68∶32，检测波长210nm。
7.根据权利要求3所述的一种具有HDAC抑制活性的亚甲基醚漆酚异羟肟酸衍生物的合成方法，其特征在于步骤(4)中所述HPLC纯化方法，其色谱柱为C18制备柱，流动相为乙腈-水，比例为70∶30，检测波长210nm。
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Design, virtual screening, molecular docking and molecular dynamics studies of novel urushiol derivatives as potential HDAC2 selective inhibitors;Zhou, Hao等;《Gene》;20170920;63-71 *

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