CN113826737A

CN113826737A - 一种免疫护肝茶及其制备方法

Info

Publication number: CN113826737A
Application number: CN202111017780.7A
Authority: CN
Inventors: 陈耀明; 陈伟
Original assignee: Chengdu Nutrition House Health Technology Co ltd
Current assignee: Chengdu Nutrition House Health Technology Co ltd
Priority date: 2021-08-31
Filing date: 2021-08-31
Publication date: 2021-12-24

Abstract

本发明公开了一种免疫护肝茶及其制备方法，属于保健食品技术领域，该免疫护肝茶由灵芝提取物、黄芪提取物、灰树花提取物、葛根提取物、猴头菇提取物、铁皮石斛提取物、红枣粉、枸杞子粉、山楂果粉以及辅料组成，且经提取、粉碎、过筛、称量、混合、制软材、制粒、干燥、整粒、混合、包装等工艺步骤制成。本发明将多种中药材提取物与红枣、枸杞子和山楂果配合，制成免疫护肝茶，绿色环保，健康无害，同时具有增强免疫力、对化学性肝损伤有辅助保护功能的保健功能。

Description

一种免疫护肝茶及其制备方法

技术领域

本发明涉及保健食品技术领域，特别涉及一种免疫护肝茶及其制备方法。

背景技术

近年来由于生活水平的提高，饮食结构变化及预防保健措施相对滞后。同时由于工业的快速发展、人口增多，蔬菜水果等食品的种植者在种植的过程中使用化肥农药，由于农药残留等问题导致毒性物质在人体内的不断蓄积，在这个大的环境背景下，由于生活节奏的日益加快、工作压力过大、饮酒、生活不规律使得大部分人群处于亚健康状态，导致肝损伤所引发的其他相关慢性疾病也逐年增多。

化学性肝损伤，是由各种毒性物质，如食物中的酒精、环境中的化学毒物及某些药物等对肝脏造成的损伤。化学性肝损伤(包括酒精性肝损伤)的主要损伤类型有:①脂肪变性。②脂质过氧化反应，这是中毒性肝损伤的特殊表现形式。③胆汁郁积反应，主要与肝细胞膜和微绒毛受损而引起胆汁酸排泄障碍有关。肝损伤是严重危害人类身心健康的疾病之一。

因此，人们对于能够预防及治疗化学性肝损伤，提高人体免疫力，并且无毒副作用的中草药物养生调理有很大需求。

发明内容

基于此，本发明提供一种免疫护肝茶及其制备方法，该免疫护肝茶具有增强免疫力、对化学性肝损伤有辅助保护功能的保健功能。

本发明采用的技术方案是：

一种免疫护肝茶，按照重量份数计，包括以下原料：

灵芝提取物10-20份、黄芪提取物25-35份、灰树花提取物15-25份、葛根提取物25-35份、猴头菇提取物20-30份、铁皮石斛提取物5-10份、红枣粉3-5份、枸杞子粉3-5份、山楂果粉3-5份以及辅料150-180份。

在本申请公开的免疫护肝茶中，所述辅料为酸处理淀粉。

灵芝的主要生物活性成分是灵芝多糖，具有提高人体免疫力，加速机体新陈代谢的功效，能促进肝细胞再生，加强肝细胞的解毒功能。

黄芪的主要生物活性成分是黄芪多糖，具有抗氧化及稳定肝细胞膜作用，能促进胆红素代谢，减少肝细胞坏死，促进肝细胞再生。大量体内外实验及临床研究表明，黄芪多糖对化学性肝损伤具有辅助保护、增强免疫力等多种功能。

灰树花的主要生物活性成分是灰树花蛋白多糖，能提高人体T细胞的数量，增强机体对肿瘤的免疫力，具有明显抗肿瘤效果。灰树花的硒、铬含量较高，具有保护肝脏、胰脏，预防肝硬化的作用。

葛根的主要生物活性成分是葛根黄酮，能改善微循环，扩张冠状动脉，增加脑和冠状动脉血流量，减慢心率，降低心肌耗氧指数而改善缺血心肌的代谢，主要用于治疗心脑血管类疾病，同时还具有护肝保肝作用。

猴头菇是一种高蛋白低脂肪食物，能有效提高身体免疫能力，还具有防癌抗癌的作用，猴头菇中含有多糖等物质能够有效抑制癌细胞，也能预防细胞的病变；还有降脂降血脂、胆固醇的功效。

铁皮石斛有一定解热镇痛作用，能促进胃液分泌，具有助消化，保肝护肝，增强新陈代谢、抗衰老等作用。

红枣不但是美味果品，还是滋补良药，具有强筋壮骨，补血行气、滋脾润肺之功效。此外红枣具有抗肿瘤、抗衰老、养脾护肝、降压、预防心血管疾病等保健功能。

山楂为药食同源植物，含有黄酮类、黄烷及其聚合物类、三萜类和有机酸等多种化学成分，主要具有调节血脂、保肝、降压、助消化、强心、抗氧化、抗肿瘤、抗菌等作用。

枸杞子是我国传统的中药材，具有保护肝脏功能、防治糖尿病、改善青光眼病变、降血脂、抗衰老、免疫调节及抗疲劳等诸多功效。

前述的免疫护肝茶的制备方法，包括如下步骤：

S1.原料的制备

S11.提取物的制备，将灵芝、黄芪、灰树花、葛根、猴头菇和铁皮石斛进行提取得到提取液，提取液浓缩干燥得到提取物；将灵芝提取物、黄芪提取物、灰树花提取物、葛根提取物、猴头菇提取物和铁皮石斛提取物分别进行粉碎，过60-100目筛，得细粉，备用；

S12.果粉的制备，将红枣、枸杞子和山楂果洗净、干燥，分别进行粉碎，过60-100目筛，得细粉，备用；

S2.混料，按重量份数，称取原料，将灵芝提取物细粉、黄芪提取物细粉、灰树花提取物细粉、葛根提取物细粉、猴头菇提取物细粉、铁皮石斛提取物细粉、红枣细粉、枸杞子细粉和山楂果细粉预混合5-15min得混合粉1；混合粉1与酸处理淀粉在总混合机中混合20-40min后得总混合粉；

S3.制粒，将总混合粉置于槽混机中加入60％乙醇搅拌均匀制软材，软材用摇摆式颗粒机通过20目筛网制粒，得湿颗粒；将湿颗粒干燥，过筛，整粒得到干颗粒；

S4.总混合，将整粒后的干颗粒混合8-12min，得总混颗粒；

S5.包装，将总混颗粒进行内包装和外包装，包装规格，3g/袋；由质检人员进行成品检验，检验合格后入库。

在本申请公开的免疫护肝茶的制备方法中，所述步骤S3中，将湿颗粒平铺于烘盘中于60℃以下烘至大量乙醇挥发后，将烘箱升温至70℃继续干燥至颗粒水分小于5％，过20目筛网整粒，得干颗粒。

在本申请公开的免疫护肝茶的制备方法中，所述步骤S11中，灵芝与灰树花的提取方法相同，具体为：取灵芝或灰树花的干燥子实体经净选、粉碎和过筛后，于20倍量水中浸泡30-90min，100℃提取2次，每次2-4h，过滤得到滤液，将滤液浓缩，加入4-8倍量乙醇醇沉，静置24h，过滤后喷雾干燥，进风温度180-220℃，出风温度95-100℃，干燥后过筛，得灵芝提取物或灰树花提取物。

在本申请公开的免疫护肝茶的制备方法中，所述步骤S11中，黄芪的提取方法具体为：取黄芪的干燥根经粉碎、过筛后，于14倍量水中，90-95℃提取2-4h，再于12倍量水中，90-95℃提取2h，过滤得到滤液，将滤液浓缩，减压干燥，干燥条件为80-90℃，-0.06～-0.08Mpa，干燥后粉碎、过筛得到黄芪提取物。

在本申请公开的免疫护肝茶的制备方法中，所述步骤S11中，葛根的提取方法具体为：取葛根的干燥根经粉碎、过筛后，于15倍量60％乙醇回流提取3次，每次提取30-90min，过滤得滤液，将滤液浓缩，用乙酸乙酯进行萃取，浓缩，室温放置，沉淀过滤，于400mmHg，70℃减压干燥、粉碎、过筛得到葛根提取物。

在本申请公开的免疫护肝茶的制备方法中，所述步骤S11中，猴头菇的提取方法具体为：取猴头菇子实体经净选、粉碎和过筛后，于20倍量水中浸泡30-60min，100℃提取2次，每次2-4h，过滤得到滤液，将滤液浓缩，喷雾干燥，进风温度180-220℃，出风温度95-100℃，干燥后过筛，得猴头菇提取物。

在本申请公开的免疫护肝茶的制备方法中，所述步骤S11中，铁皮石斛的提取方法具体为：取铁皮石斛的干燥根经粉碎、过筛后，于90℃水煎煮提取3次，第1次10倍量水提取1-3h，第2次5倍量水提取0.5-1.5h，第3次3倍量水提取20-40min，过滤得滤液，将滤液浓缩，加入95％乙醇进行醇沉，静置3h，过滤得醇沉物，减压干燥，干燥条件为80-90℃，-0.06～-0.08Mpa，干燥后粉碎、过筛得到铁皮石斛提取物。

在本申请公开的免疫护肝茶的制备方法中，所述步骤S12具体为：将红枣和山楂果分别去籽，洗净，于低温下进行冷冻，冷冻后粗破碎，然后于30℃下干燥至粗颗粒水分含量小于5％，再将粗颗粒进行研磨，过60-100目筛，得红枣细粉和山楂果细粉；将枸杞子洗净，干燥，置入中药粉碎机中进行粉碎，过60-100目筛，得枸杞子细粉。

本发明的有益效果是：

(1)本发明将灵芝提取物、黄芪提取物、灰树花提取物、葛根提取物、猴头菇提取物、铁皮石斛提取物、红枣粉、枸杞子粉、山楂果粉以及辅料配合，且经提取、粉碎、过筛、称量、混合、制软材、制粒、干燥、整粒、混合、包装等工艺步骤制成免疫护肝茶。该免疫护肝茶采用多种天然中药材提取物，绿色环保，健康无害，同时具有增强免疫力、对化学性肝损伤有辅助保护功能的保健功能。

(2)本发明的免疫护肝茶连续灌胃小鼠30天后，对小鼠的体重、脏器/体重比值无明显影响，对小鼠的单核-巨噬细胞吞噬功能试验结果阴性，对小鼠的NK细胞活性试验结果阴性；对小鼠的细胞免疫试验结果阳性，对小鼠的体液免疫试验结果阳性。由此可见:免疫护肝茶对动物具有增强免疫力的功能。

(3)本发明的免疫护肝茶连续30天经口灌胃给予雌性SD大鼠后，可见动物生长发育正常。在酒精性肝损伤模型成立的基础上，中、高剂量组能显著降低大鼠肝匀浆中的过氧化脂质降解产物丙二醛含量(P<0.05，P<0.05)；中、高剂量组大鼠肝匀浆中的还原型谷胱甘肽含量升高有显著性差异(P<0.05，P<0.01)；而各剂量组大鼠肝匀浆中的甘油三酯含量与模型对照组之间无显著性差异(P>0.05)；三个剂量组的脂肪染色评分降低有显著性差异(P<0.01，P<0.01，P<0.01)，组织病理学检查结果为阳性。依据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中之规定，免疫护肝茶对雌性SD大鼠具有酒精性肝损伤辅助保护功能。

具体实施方式

在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。

下面对本发明的实施例进行详细说明。

实施例1

一种免疫护肝茶，按照重量份数计，包括以下原料：

灵芝提取物10份、黄芪提取物25份、灰树花提取物15份、葛根提取物25份、猴头菇提取物20份、铁皮石斛提取物5份、红枣粉3份、枸杞子粉3份、山楂果粉3份以及辅料150份。辅料为酸处理淀粉。酸处理淀粉应符合GB 29928《食品安全国家标准食品添加剂酸处理淀粉》的要求。

前述的免疫护肝茶的制备方法，包括如下步骤：

S1.原料的制备

S11.提取物的制备

灵芝的提取：取灵芝的干燥子实体经净选、粉碎和过筛后，于20倍量水中浸泡30min，100℃提取2次，每次2h，过滤得到滤液，将滤液浓缩，加入4-8倍量乙醇醇沉，静置24h，过滤后喷雾干燥，进风温度180-220℃，出风温度95-100℃，干燥后过筛，得灵芝提取物。

黄芪的提取：取黄芪的干燥根经粉碎、过筛后，于14倍量水中，90-95℃提取2h，再于12倍量水中，90-95℃提取2h，过滤得到滤液，将滤液浓缩，减压干燥，干燥条件为80-90℃，-0.06～-0.08Mpa，干燥后粉碎、过筛得到黄芪提取物。

灰树花的提取：取灰树花的干燥子实体经净选、粉碎和过筛后，于20倍量水中浸泡30min，100℃提取2次，每次2h，过滤得到滤液，将滤液浓缩，加入4-8倍量乙醇醇沉，静置24h，过滤后喷雾干燥，进风温度180-220℃，出风温度95-100℃，干燥后过筛，得灰树花提取物。

葛根的提取：取葛根的干燥根经粉碎、过筛后，于15倍量60％乙醇回流提取3次，每次提取30min，过滤得滤液，将滤液浓缩，用乙酸乙酯进行萃取，浓缩，室温放置，沉淀过滤，于400mmHg，70℃减压干燥、粉碎、过筛得到葛根提取物。

猴头菇的提取：取猴头菇子实体经净选、粉碎和过筛后，于20倍量水中浸泡30min，100℃提取2次，每次2h，过滤得到滤液，将滤液浓缩，喷雾干燥，进风温度180-220℃，出风温度95-100℃，干燥后过筛，得猴头菇提取物。

铁皮石斛的提取：取铁皮石斛的干燥根经粉碎、过筛后，于90℃水煎煮提取3次，第1次10倍量水提取1h，第2次5倍量水提取0.5h，第3次3倍量水提取20min，过滤得滤液，将滤液浓缩，加入95％乙醇进行醇沉，静置3h，过滤得醇沉物，减压干燥，干燥条件为80-90℃，-0.06～-0.08Mpa，干燥后粉碎、过筛得到铁皮石斛提取物。

将灵芝提取物、黄芪提取物、灰树花提取物、葛根提取物、猴头菇提取物和铁皮石斛提取物分别进行粉碎，过60目筛，得细粉，备用。

S12.果粉的制备

将红枣去核，洗净，于低温下进行冷冻，冷冻后粗破碎，然后于30℃下干燥至粗颗粒水分含量小于5％，再将粗颗粒进行研磨，过60目筛，得红枣细粉。

将山楂果去籽，洗净，于低温下进行冷冻，冷冻后粗破碎，然后于30℃下干燥至粗颗粒水分含量小于5％，再将粗颗粒进行研磨，过60目筛，得山楂果细粉。

将枸杞子洗净，干燥，置入中药粉碎机中进行粉碎，过60目筛，得枸杞子细粉。

S2.混料，按重量份数，称取原料，将灵芝提取物细粉、黄芪提取物细粉、灰树花提取物细粉、葛根提取物细粉、猴头菇提取物细粉、铁皮石斛提取物细粉、红枣细粉、枸杞子细粉和山楂果细粉预混合5min得混合粉1；混合粉1与酸处理淀粉在总混合机中混合20min后得总混合粉。

S3.制粒，将总混合粉置于槽混机中加入60％乙醇搅拌均匀制软材，软材用摇摆式颗粒机通过20目筛网制粒，得湿颗粒；将湿颗粒平铺于烘盘中于60℃以下烘至大量乙醇挥发后，将烘箱升温至70℃继续干燥至颗粒水分小于5％，过20目筛网整粒，得干颗粒。

S4.总混合，将整粒后的干颗粒混合8min，得总混颗粒。

制备过程中，所用设备名称及型号：槽型混合机，CH-200，江阴市伟翔机械制造有限公司；摇摆式颗粒机，YK-60，无锡臣力粉体设备有限公司。

实施例2

一种免疫护肝茶，按照重量份数计，包括以下原料：

灵芝提取物15份、黄芪提取物30份、灰树花提取物20份、葛根提取物30份、猴头菇提取物25份、铁皮石斛提取物8份、红枣粉4份、枸杞子粉4份、山楂果粉4份以及辅料165份。辅料为酸处理淀粉。酸处理淀粉应符合GB 29928《食品安全国家标准食品添加剂酸处理淀粉》的要求。

前述的免疫护肝茶的制备方法，包括如下步骤：

S1.原料的制备

S11.提取物的制备

灵芝的提取：取灵芝的干燥子实体经净选、粉碎和过筛后，于20倍量水中浸泡60min，100℃提取2次，每次3h，过滤得到滤液，将滤液浓缩，加入4-8倍量乙醇醇沉，静置24h，过滤后喷雾干燥，进风温度180-220℃，出风温度95-100℃，干燥后过筛，得灵芝提取物。

黄芪的提取：取黄芪的干燥根经粉碎、过筛后，于14倍量水中，90-95℃提取3h，再于12倍量水中，90-95℃提取2h，过滤得到滤液，将滤液浓缩，减压干燥，干燥条件为80-90℃，-0.06～-0.08Mpa，干燥后粉碎、过筛得到黄芪提取物。

灰树花的提取：取灰树花的干燥子实体经净选、粉碎和过筛后，于20倍量水中浸泡60min，100℃提取2次，每次3h，过滤得到滤液，将滤液浓缩，加入4-8倍量乙醇醇沉，静置24h，过滤后喷雾干燥，进风温度180-220℃，出风温度95-100℃，干燥后过筛，得灰树花提取物。

葛根的提取：取葛根的干燥根经粉碎、过筛后，于15倍量60％乙醇回流提取3次，每次提取60min，过滤得滤液，将滤液浓缩，用乙酸乙酯进行萃取，浓缩，室温放置，沉淀过滤，于400mmHg，70℃减压干燥、粉碎、过筛得到葛根提取物。

猴头菇的提取：取猴头菇子实体经净选、粉碎和过筛后，于20倍量水中浸泡45min，100℃提取2次，每次3h，过滤得到滤液，将滤液浓缩，喷雾干燥，进风温度180-220℃，出风温度95-100℃，干燥后过筛，得猴头菇提取物。

铁皮石斛的提取：取铁皮石斛的干燥根经粉碎、过筛后，于90℃水煎煮提取3次，第1次10倍量水提取2h，第2次5倍量水提取1h，第3次3倍量水提取30min，过滤得滤液，将滤液浓缩，加入95％乙醇进行醇沉，静置3h，过滤得醇沉物，减压干燥，干燥条件为80-90℃，-0.06～-0.08Mpa，干燥后粉碎、过筛得到铁皮石斛提取物。

将灵芝提取物、黄芪提取物、灰树花提取物、葛根提取物、猴头菇提取物和铁皮石斛提取物分别进行粉碎，过80目筛，得细粉，备用。

S12.果粉的制备

将红枣去核，洗净，于低温下进行冷冻，冷冻后粗破碎，然后于30℃下干燥至粗颗粒水分含量小于5％，再将粗颗粒进行研磨，过80目筛，得红枣细粉。

将山楂果去籽，洗净，于低温下进行冷冻，冷冻后粗破碎，然后于30℃下干燥至粗颗粒水分含量小于5％，再将粗颗粒进行研磨，过80目筛，得山楂果细粉。

将枸杞子洗净，干燥，置入中药粉碎机中进行粉碎，过80目筛，得枸杞子细粉。

S2.混料，按重量份数，称取原料，将灵芝提取物细粉、黄芪提取物细粉、灰树花提取物细粉、葛根提取物细粉、猴头菇提取物细粉、铁皮石斛提取物细粉、红枣细粉、枸杞子细粉和山楂果细粉预混合10min得混合粉1；混合粉1与酸处理淀粉在总混合机中混合30min后得总混合粉。

S4.总混合，将整粒后的干颗粒混合10min，得总混颗粒。

实施例3

一种免疫护肝茶，按照重量份数计，包括以下原料：

灵芝提取物20份、黄芪提取物35份、灰树花提取物25份、葛根提取物35份、猴头菇提取物30份、铁皮石斛提取物10份、红枣粉5份、枸杞子粉5份、山楂果粉5份以及辅料180份。辅料为酸处理淀粉。酸处理淀粉应符合GB 29928《食品安全国家标准食品添加剂酸处理淀粉》的要求。

前述的免疫护肝茶的制备方法，包括如下步骤：

S1.原料的制备

S11.提取物的制备

灵芝的提取：取灵芝的干燥子实体经净选、粉碎和过筛后，于20倍量水中浸泡90min，100℃提取2次，每次4h，过滤得到滤液，将滤液浓缩，加入4-8倍量乙醇醇沉，静置24h，过滤后喷雾干燥，进风温度180-220℃，出风温度95-100℃，干燥后过筛，得灵芝提取物。

黄芪的提取：取黄芪的干燥根经粉碎、过筛后，于14倍量水中，90-95℃提取4h，再于12倍量水中，90-95℃提取2h，过滤得到滤液，将滤液浓缩，减压干燥，干燥条件为80-90℃，-0.06～-0.08Mpa，干燥后粉碎、过筛得到黄芪提取物。

灰树花的提取：取灰树花的干燥子实体经净选、粉碎和过筛后，于20倍量水中浸泡90min，100℃提取2次，每次4h，过滤得到滤液，将滤液浓缩，加入4-8倍量乙醇醇沉，静置24h，过滤后喷雾干燥，进风温度180-220℃，出风温度95-100℃，干燥后过筛，得灰树花提取物。

葛根的提取：取葛根的干燥根经粉碎、过筛后，于15倍量60％乙醇回流提取3次，每次提取90min，过滤得滤液，将滤液浓缩，用乙酸乙酯进行萃取，浓缩，室温放置，沉淀过滤，于400mmHg，70℃减压干燥、粉碎、过筛得到葛根提取物。

猴头菇的提取：取猴头菇子实体经净选、粉碎和过筛后，于20倍量水中浸泡60min，100℃提取2次，每次4h，过滤得到滤液，将滤液浓缩，喷雾干燥，进风温度180-220℃，出风温度95-100℃，干燥后过筛，得猴头菇提取物。

铁皮石斛的提取：取铁皮石斛的干燥根经粉碎、过筛后，于90℃水煎煮提取3次，第1次10倍量水提取3h，第2次5倍量水提取1.5h，第3次3倍量水提取40min，过滤得滤液，将滤液浓缩，加入95％乙醇进行醇沉，静置3h，过滤得醇沉物，减压干燥，干燥条件为80-90℃，-0.06～-0.08Mpa，干燥后粉碎、过筛得到铁皮石斛提取物。

将灵芝提取物、黄芪提取物、灰树花提取物、葛根提取物、猴头菇提取物和铁皮石斛提取物分别进行粉碎，过100目筛，得细粉，备用。

S12.果粉的制备

将红枣去核，洗净，于低温下进行冷冻，冷冻后粗破碎，然后于30℃下干燥至粗颗粒水分含量小于5％，再将粗颗粒进行研磨，过100目筛，得红枣细粉。

将山楂果去籽，洗净，于低温下进行冷冻，冷冻后粗破碎，然后于30℃下干燥至粗颗粒水分含量小于5％，再将粗颗粒进行研磨，过100目筛，得山楂果细粉。

将枸杞子洗净，干燥，置入中药粉碎机中进行粉碎，过100目筛，得枸杞子细粉。

S2.混料，按重量份数，称取原料，将灵芝提取物细粉、黄芪提取物细粉、灰树花提取物细粉、葛根提取物细粉、猴头菇提取物细粉、铁皮石斛提取物细粉、红枣细粉、枸杞子细粉和山楂果细粉预混合15min得混合粉1；混合粉1与酸处理淀粉在总混合机中混合40min后得总混合粉。

S4.总混合，将整粒后的干颗粒混合12min，得总混颗粒；

实施例4

本发明实施例2所制备的免疫护肝茶进行增强免疫力功能试验。

1.材料和方法

1.1样品

实施例2所制备的免疫护肝茶，成人每日推荐量为3g/日，试验时，用蒸馏水做溶剂配制受试物，冷藏保存。

1.2实验动物

由四川省中医药科学院实验动物中心提供的昆明种小鼠160只，全雌，体重18-22g，生产许可证号为SCXK(川)2013-19 SPF级；饲料来源于四川省医学科学院.四川省人民医院实验动物研究所，生产许可证号为SCXK(川)2015-01。试验动物房为屏障系统，使用许可证号为SYXK(川)2016-043。温度20-25℃，相对湿度40-70％。

1.3剂量选择与受试物给予方式

设500.00mg/kg·BW、1000.00mg/kg·BW、1500.00mg/kg·BW三个剂量组(分别相当于人体推荐摄入量的10倍、20倍、30倍)，分别量取6.25g、12.50g、18.75g受试物，加蒸馏水至250mL混匀，用完再配，另设蒸馏水阴性对照组，每组40只动物。分为免疫一组、二组、三组、四组，其中一组用于小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验；二组用于NK细胞活性测定及淋巴细胞转化实验；三组用于抗体生成细胞实验、血清溶血素测定和迟发性变态反应实验；四组用于小鼠碳廓清实验。小鼠按20mL/kg·BW体重一次经口灌胃，至少连续给予30天，每周称一次体重，调整灌胃体积。

1.4主要仪器与试剂

100μL微量注射器、二氧化碳培养箱、电子分析天平、723分光光度仪、离心机、2010型酶标仪、手术器械、SRBC、Hank's液、DNFB、S_A缓冲液、琼脂糖、印度墨汁、Na₂CO₃、RPMI1640等。

1.5试验方法

1.5.1脏器/体重比值测定

试验结束时称体重后处死动物，取脾脏和胸腺在电子分析天平上称重，并计算脏/体比值。

1.5.2迟发型变态反应(DTH)(足跖增厚法)

给小鼠腹腔注射2％压积SRBC(0.2mL/每鼠)致敏4天后，测量左后足跖厚度，然后在测量部位皮下注射20％(v/v)SRBC(20μL/每鼠)，于注射后24h测量左后足跖厚度，同一部位测量三次，取平均值，以攻击前后足跖厚度差值(足跖肿胀度)来表示DTH的程度。

1.5.3ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(MTT法)

无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，制成细胞悬液，经200目筛网过滤。用Hank's液洗2次，每次离心10分钟(1000r/min)。然后将细胞悬浮于1mL完全培养液中，计数活细胞数，用RPMI 1640培养液调整细胞浓度为3×10⁶个/mL。再将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，在其中一孔加75μL ConA液(相当于7.5μg/mL)，另一孔作为对照，置5％CO₂，37℃二氧化碳孵箱培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI 1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔作3个平行孔，用酶标仪，以570nm波长测定光密度值(OD)。

1.5.4抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)

每只小鼠腹腔汪射2％压积SRBC 0.2mL，将免疫5天后的小鼠颈椎脱臼处死，取脾，轻轻磨碎，用Hank's液制成细胞悬液，200目筛网过滤，洗涤、离心2次，最后将细胞悬浮在5mL RPMI1640培养液中，台酚兰染色计数(应在95％以上)，并将细胞浓度调整为5×10⁶个/mL，制成脾细胞悬液。将琼脂糖配制成1％水溶液，水浴煮30min，与等量Hank's液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加入10％(用S_A缓冲液配制)压积SRBC 50μL，脾细胞悬液各20μL做两个平行样，迅速混匀后，倾倒于琼脂糖薄层玻片上，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1.5h，计数溶血空斑数。补体制备是采集豚鼠血，分离出血清(至少5只豚鼠的混合血清)，将1mL压积SRBC加入到5mL豚鼠血清中，4℃冰箱放置30min，经常振荡，离心取上清，分装，-70℃保存。用时以S_A缓冲液按1：15稀释。

1.5.5血清溶血素测定(血凝法)

每只小鼠腹腔注射2％SRBC 0.2mL免疫，继续灌胃5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置1小时，剥离，2000r/min离心10分钟，收集血清，用生理盐水将血清作倍比稀释，每份稀释12孔，将不同稀释度的血清置于血凝板中，每孔100μL，再加入0.5％SRBC悬液100μL，混匀，置湿盒37℃3小时后观察结果，记录每孔的凝集程度。计算抗体积数。

1.5.6小鼠碳廓清试验

于小鼠尾静脉注射用5倍生理盐水稀释的印度墨汁，按0.1mL/10g墨汁注入后立即计时，于注入墨汁后第2、10min分别从内眦静脉丛取血20μL，加到2mL Na₂CO₃溶液中，以Na₂CO₃溶液作空白对照，用723分光光度计在600nm处测定光密度值。取血后将小鼠处死，取肝、脾称重，计算吞噬指数。

1.5.7小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验(半体内法)

每只小鼠腹腔注射用NS洗涤3次后的20％鸡红细胞悬液1mL，30分钟后，颈椎脱臼处死，将其固定在鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2mL，转动鼠板1分钟，吸出腹腔洗液1mL，平均滴于2张载玻片上，置湿盒37℃30分钟，取出在生理盐水漂洗、晾干、固定，4％GiemsaPBS染色3分钟，蒸馏水漂洗晾干，镜检。计算吞噬百分率及吞噬指数。

1.5.8NK细胞活性的测定(乳酸脱氢酶测定法)

受试小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，制成脾细胞悬液，用Hank's液洗3次，每次离心10min(1000r/min)，弃上清将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌水20秒，裂解红细胞，用台酚兰染色计数(活细胞数应在95％以上)，用RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为2×10⁷个/mL。将各只小鼠的细胞悬液取300μL分置于96孔培养板中，每孔100μL，每孔加靶细胞(YAC-1细胞，4×10⁵个/mL)100μL，同时做靶细胞自然释放孔(靶细胞和培养液各100μL)及最大释放孔(靶细胞和2.5％Triton各100μL)各3孔，于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μL置另一培养板中，同时加入基质液100μL，10min后每孔加入1mol/L的HCl 30μL终止反应，在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)，计算NK细胞活性率。

1.6实验数据统计

试验数据采用SPSS 10.0 for Windows软件包处理。对照组与剂量组的数据经方差齐性检验，方差齐，进行方差分析，如P值小于0.05，则用Dunnett法进行两两比较；若方差不齐，则进行数据转换，仍不齐，改用秩和检验，如P值小于0.05，则用Dunnett's T3法进行两两比较。

1.7结果判定

在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有增强免疫力功能作用。

2结果

2.1免疫护肝茶对小鼠体重的影响

表1免疫护肝茶各组小鼠初始体重

表2免疫护肝茶各组小鼠中期体重

表3免疫护肝茶各组小鼠结束体重

表4免疫护肝茶各组小鼠体重增重的影响

由表1-4可见，免疫护肝茶免疫一组、免疫二组、免疫三组及免疫四组动物的初始体重与阴性对照组相比，经方差齐性检验，方差齐(P>0.05)，且方差分析结果(P>0.05)，说明各组动物与阴性对照组之间的初始体重是均衡的。免疫一、二、三、四组各剂量组动物试验中期、末期的体重以及试验期间小鼠体重的增长与阴性对照组相比较均无显著性差异(P>0.05)。

2.2免疫护肝茶对小鼠脏器/体重比值的影响

表5免疫护肝茶对小鼠脏器/体重比值的影响

由表5可见，连续灌胃30天后，三个剂量组动物的脾脏/体重比值、胸腺/体重比值与阴性对照组相比，经统计学处理，均无显著性差异(P>0.05)。

2.3免疫护肝茶对小鼠细胞免疫功能的影响

2.3.1免疫护肝茶对小鼠迟发型变态反应(DTH))的影响

表6免疫护肝茶对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响

由表6可见，连续灌胃30天后，三个剂量组动物的足跖肿胀度与阴性对照组相比，经统计学处理，中，高剂量组动物有显著性差异(P<0.01，P<0.01)。

2.3.2免疫护肝茶对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化试验的影响

表7免疫护肝茶对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化试验的影响

由表7可见，连续灌胃30天后，三个剂量组动物的淋巴细胞增殖能力与阴性对照组相比，经统计学处理，均无显著性差异(P>0.05)。

免疫护肝茶对小鼠细胞免疫试验结果阳性。

2.4免疫护肝茶对小鼠体液免疫功能的影响

2.4.1免疫护肝茶对小鼠抗体生成细胞数的影响

表8免疫护肝茶对小鼠抗体生成细胞数的影响

由表8可见，连续灌胃30天后，三个剂量组动物的溶血空斑数与阴性对照组相比，经统计学处理，中，高剂量组动物均有显著性差异(P<0.01，P<0.01)。

2.4.2免疫护肝茶对小鼠血清溶血素的影响

表9免疫护肝茶对小鼠血清溶血素的影响

由表9可见，连续灌胃30天后，三个剂量组动物的抗体积数与阴性对照组相比，经统计学处理，低、中、高剂量组动物均无显著性差异(P>0.05)。

免疫护肝茶对小鼠体液免疫试验结果阳性。

2.5免疫护肝茶对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响

2.5.1免疫护肝茶对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清功能的影响

表10免疫护肝茶对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清功能的影响

由表10可见，连续灌胃30天后，三个剂量组动物的碳廓清能力与阴性对照组相比，经统计学处理，无显著性差异(P>0.05)。

2.5.2免疫护肝茶对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响

表11免疫护肝茶对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响

由表11可见，连续灌胃30天后，三个剂量组动物的吞噬率和吞噬指数与阴性对照组相比，经统计学处理，无显著性差异(P>0.05)。

免疫护肝茶对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能试验结果阴性。

2.6免疫护肝茶对小鼠NK细胞活性的影响

表12免疫护肝茶对小鼠NK细胞活性的影响

由表12可见，连续灌胃30天后，三个剂量组动物的NK细胞活性与阴性对照组相比，经统计学处理，无显著性差异(P>0.05)。

免疫护肝茶对小鼠NK细胞活性试验结果阴性。

3结论

免疫护肝茶连续灌胃小鼠30天后，对小鼠的体重、脏器/体重比值无明显影响，对小鼠的单核-巨噬细胞吞噬功能试验结果阴性，对小鼠的NK细胞活性试验结果阴性；对小鼠的细胞免疫试验结果阳性，对小鼠的体液免疫试验结果阳性。由此可见:免疫护肝茶对动物具有增强免疫力的功能。

实施例5

本发明实施例2所制备的免疫护肝茶进行护肝功能动物试验。

1材料和方法

1.1样品

实施例2所制备的免疫护肝茶，成人每日推荐量为3g/60kg·BW，试验时，用蒸馏水做溶剂配制受试物，冷藏保存。

1.2实验动物

由四川省中医药科学院实验动物中心提供的雌性SD大鼠50只，体重184-220g，生产许可证号为SCXK(川)2013-19SPF级；饲料来源于四川省医学科学院.四川省人民医院实验动物研究所，生产许可证号为SCXK(川)2015-01。试验动物房为屏障系统，使用许可证号为SYXK(川)2016-043。温度20-25℃，相对湿度40-70％。

1.3剂量选择与受试物给予方式

将雌性SD大鼠随机分为5组，每组10只，试验设250.00mg/kg·BW、750.00mg/kg·BW、1500.00mg/kg·BW三个剂量组(分别相当于人体推荐摄入量的5倍、15倍、30倍)，分别量取6.25g、18.75g、37.5g受试物，加蒸馏水至250mL混匀，用完再配，另设蒸馏水阴性对照组和50％乙醇模型对照组。用乙醇(分析纯)造成肝损伤模型，乙醇浓度为50％(以蒸馏水稀释)，灌胃量14mL/kg·BW(折合乙醇的剂量为7000mg/kg·BW)。按10mL/kg.·BW每天经口灌胃一次，至少连续给予30天，每周称两次体重，以此调整给药量。

1.4试验方法

采用酒精性肝损伤模型法，三个剂量组给予不同剂量的受试物，阴性对照组和模型对照组给予蒸馏水。试验结束时将模型对照组和三个剂量组一次经口灌胃给予50％乙醇溶液，剂量为14mL/kg·BW，阴性对照组给予同体积的蒸馏水，禁食16h后处死动物取肝脏称重，计算脏体比，并用肝脏进行生化指标检测及组织病理学检查。

2.检测指标

2.1肝匀浆中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)及甘油三酯(TG)的测定

MDA和GSH测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；TG测定试剂盒由德国奥林巴斯(欧洲)诊断有限公司提供。

2.2肝脏称重及脏器系数的计算

2.3肝脏组织病理学诊断标准

2.3.1病理观察材料

从动物肝左叶中部做横切面取材、切片、染色、镜下观察脂滴在肝脏中的分布、范围和面积。

2.3.2病理观察方法

每例动物肝组织用40倍物镜连续观察组织切片，根据阳性细胞多少和分布的范围，按0、1、2、3、4分进行评分。将所得分数的平均值作为该例肝组织的脂肪染色评分。

2.3.3病理诊断标准

病理组织学观察以肝细胞脂滴染色作为观察指标，并根据病理改变程度“0”、“1”、“2”、“3”、“4”量化，进行肝损伤程度的评价。

2.3.4肝细胞脂肪染色共分为五级

2.4试验数据统计

试验数据统计采用SPSS 11.0for windows软件包处理。对照组与各剂量组的数据经方差齐性检验，方差齐，进行方差分析，如P值小于0.05，则用Dunnett法进行两两比较；若方差不齐，则进行数据转换，仍不齐，改用秩和检验，如P值小于0.05，，则用Dunnett's T3法进行两两比较。阴性对照组与模型对照组数据则采用T检验。

2.5结果判定

肝脏MDA、还原性GSH和TG三项检测指标结果阳性或肝脏MDA、还原性GSH和TG三项指标中任两项指标阳性和病理组织学检查结果阳性。满足以上任一条件，可判定该受试样品具有对酒精性肝损伤有辅助保护作用。

3.试验结果

3.1免疫护肝茶对大鼠体重、肝重、肝体比的影响

由表13可见，免疫护肝茶各剂量组大鼠的初始体重与阴性对照组及模型对照组比较，方差齐(P>0.05)，方差分析结果(P>0.05)，说明各组动物初始体重是均衡的。模型对照组的中期体重、终重、肝重、肝体比与阴性对照组比较，除肝重、肝体比显著升高(P<0.01，P<0.01)外，其余指标无显著性差异(P>0.05)。各剂量组动物的中期体重、终重、肝重及肝体比与模型对照组比较，无显著性差异(P>0.05)。

表13免疫护肝茶对大鼠体重、肝重、肝体比的影响

3.2免疫护肝茶对大鼠肝匀浆中MDA、GSH、TG含量的影响

由表2可见，模型对照组大鼠肝匀浆中的MDA、GSH、TG含量与阴性对照组比较，经t检验，MDA、TG含量显著升高(P<0.01，P<0.05)，GSH含量显著降低(P<0.01)，表明该模型是成功的，实验系统可靠。三个剂量组的MDA、GSH、TG含量与模型对照组比较，可见中、高剂量组的MDA显著降低(P<0.05，P<0.05)，中、高剂量组的GSH显著升高(P<0.05，P<0.01)，三个剂量组的TG与模型对照组之间无显著性差异(P>0.05)。

表14免疫护肝茶对大鼠肝匀浆中MDA、GSH、TG含量的影响

注:Δ表示与阴性对照组比较P<0.05，ΔΔ表示与阴性对照组比较P<0.01；*表示与模型对照组比较P<0.05，**表示与模型对照组比较P<0.01。

3.3肝脏组织病理学检查结果

结果见表15，模型对照组大鼠的肝细胞脂肪染色评分与阴性对照组比较，升高有极显著性差异(P<0.01)，表明该模型是成功的，实验系统可靠。三个剂量组大鼠的肝细胞脂肪染色评分与模型对照组比较，三个剂量组降低有显著性差异(P<0.01，P<0.01，P<0.01)。

表15免疫护肝茶对大鼠肝脏组织病理学检查结果

注:ΔΔ表示与阴性对照组比较P<0.01；**表示与模型对照组比较P<0.01。

4结论

免疫护肝茶至少连续30天经口灌胃给予雌性SD大鼠后，可见动物生长发育正常。在酒精性肝损伤模型成立的基础上，中、高剂量组能显著降低大鼠肝匀浆中的过氧化脂质降解产物丙二醛含量(P<0.05，P<0.05)；中、高剂量组大鼠肝匀浆中的还原型谷胱甘肽含量升高有显著性差异(P<0.05，P<0.01)；而各剂量组大鼠肝匀浆中的甘油三酯含量与模型对照组之间无显著性差异(P>0.05)；三个剂量组的脂肪染色评分降低有显著性差异(P<0.01，P<0.01，P<0.01)，组织病理学检查结果为阳性。依据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中之规定，免疫护肝茶对雌性SD大鼠具有酒精性肝损伤辅助保护功能。

Claims

1.一种免疫护肝茶，其特征在于，按照重量份数计，包括以下原料：

2.根据权利要求1所述的免疫护肝茶，其特征在于，所述辅料为酸处理淀粉。

3.一种免疫护肝茶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.原料的制备

S3.制粒，将总混合粉置于槽混机中加入60%乙醇搅拌均匀制软材，软材用摇摆式颗粒机通过20目筛网制粒，得湿颗粒；将湿颗粒干燥，过筛，整粒得到干颗粒；

S4.总混合，将整粒后的干颗粒混合8-12min，得总混颗粒；

4.根据权利要求3所述的免疫护肝茶的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，将湿颗粒平铺于烘盘中于60℃以下烘至大量乙醇挥发后，将烘箱升温至70℃继续干燥至颗粒水分小于5%，过20目筛网整粒，得干颗粒。

5.根据权利要求3所述的免疫护肝茶的制备方法，其特征在于，所述步骤S11中，灵芝与灰树花的提取方法相同，具体为：取灵芝或灰树花的干燥子实体经净选、粉碎和过筛后，于20倍量水中浸泡30-90min，100℃提取2次，每次2-4h，过滤得到滤液，将滤液浓缩，加入4-8倍量乙醇醇沉，静置24h，过滤后喷雾干燥，进风温度180-220℃，出风温度95-100℃，干燥后过筛，得灵芝提取物或灰树花提取物。

6.根据权利要求3所述的免疫护肝茶的制备方法，其特征在于，所述步骤S11中，黄芪的提取方法具体为：取黄芪的干燥根经粉碎、过筛后，于14倍量水中，90-95℃提取2-4h，再于12倍量水中，90-95℃提取2h，过滤得到滤液，将滤液浓缩，减压干燥，干燥条件为80-90℃，-0.06~-0.08Mpa，干燥后粉碎、过筛得到黄芪提取物。

7.根据权利要求3所述的免疫护肝茶的制备方法，其特征在于，所述步骤S11中，葛根的提取方法具体为：取葛根的干燥根经粉碎、过筛后，于15倍量60%乙醇回流提取3次，每次提取30-90min，过滤得滤液，将滤液浓缩，用乙酸乙酯进行萃取，浓缩，室温放置，沉淀过滤，于400mmHg，70℃减压干燥、粉碎、过筛得到葛根提取物。

8.根据权利要求3所述的免疫护肝茶的制备方法，其特征在于，所述步骤S11中，猴头菇的提取方法具体为：取猴头菇子实体经净选、粉碎和过筛后，于20倍量水中浸泡30-60min，100℃提取2次，每次2-4h，过滤得到滤液，将滤液浓缩，喷雾干燥，进风温度180-220℃，出风温度95-100℃，干燥后过筛，得猴头菇提取物。

9.根据权利要求3所述的免疫护肝茶的制备方法，其特征在于，所述步骤S11中，铁皮石斛的提取方法具体为：取铁皮石斛的干燥根经粉碎、过筛后，于90℃水煎煮提取3次，第1次10倍量水提取1-3h，第2次5倍量水提取0.5-1.5h，第3次3倍量水提取20-40min，过滤得滤液，将滤液浓缩，加入95%乙醇进行醇沉，静置3h，过滤得醇沉物，减压干燥，干燥条件为80-90℃，-0.06~-0.08Mpa，干燥后粉碎、过筛得到铁皮石斛提取物。

10.根据权利要求3所述的免疫护肝茶的制备方法，其特征在于，所述步骤S12具体为：将红枣和山楂果分别去籽，洗净，于低温下进行冷冻，冷冻后粗破碎，然后于30℃下干燥至粗颗粒水分含量小于5％，再将粗颗粒进行研磨，过60-100目筛，得红枣细粉和山楂果细粉；将枸杞子洗净，干燥，置入中药粉碎机中进行粉碎，过60-100目筛，得枸杞子细粉。