CN113817060A - 用于癌症治疗的钙粘蛋白-17特异性抗体和细胞毒性细胞 - Google Patents

用于癌症治疗的钙粘蛋白-17特异性抗体和细胞毒性细胞 Download PDF

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Abstract

本公开的实施例涉及用于癌症治疗的钙粘蛋白‑17特异性抗体和细胞毒性细胞。例如，抗体可以具有针对钙粘蛋白‑17的特异性，并且包括与选自SEQ ID NO:1‑21的氨基酸序列具有至少70％相似度的氨基酸序列。

Description

用于癌症治疗的钙粘蛋白-17特异性抗体和细胞毒性细胞
本申请是2017年1月7日提交的中国发明专利申请(发明名称：用于癌症治疗的钙粘蛋白-17特异性抗体和细胞毒性细胞；申请号：2017800057586)的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请主张2016年1月9日提交的标题为“用于癌症治疗的钙粘蛋白-17特异性抗体和细胞毒性细胞”的美国临时申请第62,276,855号的优先权，其全部内容通过引用在此并入本文。
技术领域
本公开大体上涉及癌症免疫疗法的技术领域，并且更具体地，涉及用于癌症治疗的钙粘蛋白-17特异性抗体和细胞毒性细胞。
背景技术
尽管近年来药物发现和临床成像方面有所进展，但癌症仍然是人类最致命的疾病之一。我们对肿瘤如何产生、在压力下存活、移生/转移到远隔器官和部位以及对药物变得有抗性的认识仍然是有限的。据美国癌症协会估计，2014年美国新增癌症病例为160万，其中对于大多数主要类型的癌症没有认可的根治疗法。在中国，癌症是发生率和死亡率在不断增加的最致命的疾病之一，病毒/细菌性地方病(乙型肝炎病毒[HBV]和幽门螺杆菌感染)、环境污染和食品污染被认为是主要的致癌风险因素。
胃癌和肝癌在世界范围内属于最致命的恶性肿瘤，而且有超过半数的确诊发生在中国，导致全球每年142万例死亡，但是目前仍然没有有效的治疗方法。针对这些侵袭性癌症，特别是对于那些处于晚期阶段的癌症而言，未来的药物研发需要新的生物标记和治疗靶点。因此那些经证实能够消除或抑制这两种癌症生长的靶向分子将具有重要临床价值和显著市场影响。如果诊断出疾病处在早期阶段，则这些肿瘤可以通过外科手术被有效地切除。遗憾的是在通常情况下，这些癌症大部分是无症状的，在出现临床迹象时检测诊断结果往往是在非常晚期阶段。在没有有效治疗的情况下，这些患者在诊断之后不久就可能死亡或者在挽救治疗之后不久复发。
CAR-T(全名为嵌合抗原受体T细胞)细胞治疗是一种过继细胞疗法，其包括对T细胞的体外修饰以引导抗癌反应。经CAR修饰的T细胞可以被改造成能够靶向几乎任何肿瘤相关抗原。
几乎所有早期阶段的CAR-T研究集中于血癌，包括针对小儿急性淋巴细胞白血病的CART19(靶向CD19抗原的CAR-T)的验证概念的研究。但仍然要看CAR-T细胞疗法和相关技术是否能够在治疗实体肿瘤中重复相同的效果，比如肝癌、胃癌和肺癌。目前，在www.clinicaltrials.gov上总共注册有72种临床试验，在中国有登记了15项研究。超过半数的研究集中在血液癌症，同时CD19是最常见的CAR-T靶向抗原，之后是专门针对脑肿瘤和一组HER2阳性癌症的GD2和HER2。因此，针对HCC和GC的CAR-T免疫疗法明显存在巨大差距。
目前，仅有一项登记到CAR-T 1期临床试验，其使用KJgpc3-001治疗晚期HCC患者。KJgpc3-001是一种表达第三代GPC3-靶向CAR的基因修饰T细胞。GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3)在HCC中高度表达但是在正常组织中表达有限(63.6％vs.9.2％)。遗憾地是，在由罗氏(Roche)的子公司中外制药(Chugai)研发的抗-GPC3mAbGC33的1期临床试验研究中并未观察到部分或完全的反应。KJgpc3-001包括由GC33衍生的抗-GPC3scFv和由CD28/4-1ΒΒ/CD3ζ衍生的细胞内信号结构域。KJgpc3-001可以利用慢病毒载体转导到患者的T细胞内以攻击肝癌。在临床前研究中，所有利用KJgpc3-001处理的小鼠存活了超过60天，而经生理盐水处理的小鼠的中位生存期为33天。有关KJgpc3-001的关注重点是GPC3在正常组织中的表达，比如胃腺、肾小管和生殖细胞。早先，一名乳腺癌患者由于HER2在肺组织中的表达，在利用HER2-靶向CAR治疗之后死亡。该患者在细胞输注后的15分钟内经历呼吸窘迫并且在治疗后5天死亡。因此，需要将像钙粘蛋白-17特异性抗体和其细胞毒性细胞用于癌症治疗的癌症免疫疗法。
发明内容
本公开提供了钙粘蛋白-17特异性抗体和细胞毒性细胞。
本公开的实施例涉及具有针对钙粘蛋白-17的特异性的抗体，包括与选自SEQ IDNO:1-21的氨基酸序列具有至少70％相似度的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体可以包括与选自SEQ ID NO:1-21的氨基酸序列具有至少80％相似度的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体可以包括与选自SEQ ID NO:1-21的氨基酸序列具有至少95％相似度的氨基酸序列。
在一些实施例中，单克隆抗体为小鼠抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施例中，单克隆抗体是通过噬菌体库筛选分离的人抗体。
在一些实施例中，抗体可以包括轻链的可变区(VL)、重链的可变区(VH)，并且VL可以包括与选自SEQ ID NO:1、3、6、8、10、12、14以及16的氨基酸序列具有至少90％相似度的氨基酸序列。在一些实施例中，VH可以包括与选自SEQ ID NO:2、4、5、7、9、11、13以及15的氨基酸序列具有至少90％相似度的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体可以包括缀合的细胞毒性部分。在一些实施例中，缀合的细胞毒性部分可以包括伊立替康、奥瑞斯他汀、PBD、美登素、鹅膏蕈碱、剪接体抑制剂或者其组合。在一些实施例中，缀合的细胞毒性部分可以包括化学治疗剂。
在一些实施例中，抗体为双特异性抗体。
在一些实施例中，抗体可以包括针对来自细胞毒性T或NK细胞的细胞受体的特异性。在一些实施例中，抗体为具有针对钙粘蛋白-17和CD3两者的特异性的双特异性抗体。
在一些实施例中，细胞受体可以包括：4-1BB、OX40、CD27、CD40、TIM-1、CD28、HVEM、GITR、ICOS、IL12受体，IL14受体，或者其衍生物或组合。
在一些实施例中，抗体可以包括具有针对钙粘蛋白-17的特异性的第一单链可变片段(ScFv)和具有针对CD3的特异性的第二单链可变片段(ScFv)，其中第一ScFv可以包括第一VH和第一VL，第二ScFv可以包括第二VH和第二VL。在一些实施例中，第一VH可以包括选自SEQ ID NO:2、4、5、7、9、11、13以及15的氨基酸序列。在一些实施例中，第一VL可以包括选自SEQ ID NO:1、3、6、8、10、12、14以及16的氨基酸序列。
在一些实施例中，第二VH可以包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列的对应部分。
在一些实施例中，第二VL可以包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列的对应部分。
在一些实施例中，抗体可以包括针对免疫检查点抑制剂的特异性。在一些实施例中，检查点抑制剂可以包括PD-1、TIM-3、LAG-3、TIGIT、CTLA-4、PD-L1、BTLA、VISTA或其组合。
在一些实施例中，抗体可以包括针对血管生成因子的特异性。在一些实施例中，血管生成因子可以包括VEGF。
在一些实施例中，抗体配置为拮抗钙粘蛋白-17结构域6中RGD位点与整联蛋白的结合。在一些实施例中，整联蛋白可以包括α2β1。
在一些实施例中，抗体为单克隆抗体。
本公开的一些实施例涉及抗体的IgG重链，包括具有选自SEQ ID NO:2、4、5、7、9、11、13以及15的序列的氨基酸序列。
本公开的一些实施例涉及抗体的轻链，包括具有选自SEQ ID NO:1、3、6、8、10、12、14以及16的序列的氨基酸序列。
本公开的一些实施例涉及抗体的可变链，包括选自SEQ ID NO:1-16的氨基酸序列。
本公开的一些实施例涉及具有针对钙粘蛋白-17的特异性的scFv或Fab，包括与选自SEQ ID NO:1-21的氨基酸序列具有至少90％相似度的氨基酸序列。
在一些实施例中，scFv或Fab可以包括针对来自细胞毒性T或NK细胞的细胞受体的特异性。在一些实施例中，scFv或Fab可以包括针对免疫检查点抑制剂的特异性。在一些实施例中，scFv或Fab可以包括针对血管生成因子的特异性。
本公开的一些实施例涉及具有针对钙粘蛋白-17的特异性的T或NK细胞，其中T或NK细胞可以包括嵌合抗原受体，其中该嵌合抗原受体可以包括与选自SEQ ID NO:1-21的氨基酸序列具有至少90％相似度的氨基酸序列。
在一些实施例中，嵌合抗原受体可以包括选自SEQ ID NO:1-16的氨基酸序列。
本公开的一些实施例涉及对以上所述抗体、IgG重链、轻链、可变链或者scFv或Fab进行编码的分离核酸。
本公开的一些实施例涉及包括以上所述分离核酸的表达载体。在一些实施例中，载体可以在细胞中表达。
本公开的一些实施例涉及包括以上所述核酸的宿主细胞。
本公开的一些实施例涉及包括以上所述表达载体的宿主细胞。
在一些实施例中，宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
本公开的一些实施例涉及药物组合物，包括根据权利要求1至26所述的抗体和细胞毒性剂。
在一些实施例中，细胞毒性剂可以包括顺铂、吉西他滨、伊立替康或者抗肿瘤抗体。
在一些实施例中，药物组合物可以包括以上所述的抗体和药学上可接受的载体。
本公开的一些实施例涉及用于治疗患有癌症的受试者方法，包括给受试者施用有效量的根据权利要求1-26所述的抗体或者根据权利要求34至35所述的T或NK细胞。
在一些实施例中，癌症为肝癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌或其组合。
本公开的目的和优点，通过对其优选实施例的以下详细描述并结合附图将变得显而易见。
附图说明
现在可以参考附图描述根据本公开的优选实施例，其中相同的附图标记指示相同的要素。
图1示出了Lic3和Lic5的鼠源VL和VH序列(请注意，Lic3序列已经被更新，即在打印页中的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2需要被相应地替换)。
图2示出了Lic3 VL序列相对于人类VL 2-30/J1的同源性，人源化和人源化变体由Hum表示，其中圆点表示人类氨基酸，而回复突变由单个氨基酸注释表示。
图3示出了Lic 3VL序列相对于人类VL 2-24/J1以及Lic3 Vk序列相对于人类VHVk2-29的同源性，人源化和人源化变体由Hum表示，其中圆点表示人类氨基酸，而回复突变由单个氨基酸注释表示。
图4示出了Lic3 VH序列相对于人类VH 3-11/J4的同源性，人源化和人源化变体由Hum表示，其中圆点表示人类氨基酸，而回复突变由单个氨基酸注释表示。
图5示出了Lic3 VH序列相对于人类VH 3-30/J4的同源性，人源化和人源化变体由Hum表示，其中圆点表示人类氨基酸，而回复突变由单个氨基酸注释表示。
图6示出了Lic5 VL序列相对于人类VL IGKV2-30的同源性，人源化和人源化变体由Hum表示，其中圆点表示人类氨基酸，而回复突变由单个氨基酸注释表示。
图7示出了Lic5 VL序列相对于人类VL pdb4X0K的同源性，人源化和人源化变体由Hum表示，其中圆点表示人类氨基酸，而回复突变由单个氨基酸注释表示。
图8示出了Lic5 VH序列相对于人类VH IGHV3-21的同源性，人源化和人源化变体由Hum表示，其中圆点表示人类氨基酸，而回复突变由单个氨基酸注释表示。
图9示出了Lic5 VH序列相对于人类VH IGHV3-7的同源性，人源化和人源化变体由Hum表示，其中圆点表示人类氨基酸，而回复突变由单个氨基酸注释表示。
图10示出了举例说明从抗体噬菌体库分离人钙粘蛋白-17特异性抗体的方法的流程图，其中人钙粘蛋白-17特异性抗体通过多轮结合到固定化CDH17结构域1-3来从噬菌体库分离。
图11是显示从结合到CDH17的抗体噬菌体库分离的人抗体示例的图表。
图12示出了来自噬菌体库筛选的人CDH17抗体VL和VH序列。
图13示出了用于癌症免疫疗法的由CDH17抗体VH和VL产生的示范性功能结构域构造的面板；(a)CDH17特异性抗体；(b)CDH17抗体药物缀合物；(c)scFv-Fc双特异性抗体(孔中球形突出物)；(d)scFv-Fc双特异性抗体(咬合)以及(e)CART或NK细胞。
图14示出了示范性CDH17-CD3双特异性抗体(孔中球形突出物)的氨基酸序列。
图15是示出Lic5 scFv通过ELISA(酶联免疫吸附测定)结合到CDH17的曲线图。
图16是示出Lic3 scFv通过ELISA结合到CDH17的曲线图。
图17是示出通过ELISA确定的Lic3和Lic5 scFv的亲和力的曲线图，其中scFv lic3(kd):11.88nM，而scFv I ic5:22.06nM。
图18呈现了Lic5内化到人胃癌细胞作为抗体药物缀合物的照片；(a)显示在标示时间DAPI(蓝色)和Lic5-FITC(绿色)染色的照片；(b)显示在标示时间DAPI(蓝色)和Lic5-FITC(绿色)合并染色的照片；通过共聚焦显微镜确定了在37℃下经过30分钟在Ouml人胃癌细胞中的Lic5-FITC(绿色)内化；利用DAPI对细胞核染色。
图19呈现了ELISA所确定的人源化Lic3到CDH17的结合。
图20呈现了ELISA所确定的结合到CDH17或CDH17截短的CDH17单克隆抗体的示例。
图21呈现了通过FACS确定的结合到肿瘤细胞系的CDH17单克隆抗体和人源化Lic3scFvFc(h3scFv)的示例。出人意料地，许多CDH17单克隆抗体证实了结合到不同的CDH17表达肿瘤细胞系(红色方框)的不同模式。
图22呈现了对第二代CAR的设计(a)和分析(b)，包括氨基酸序列hLic3 CAR7a(SEQID NO.25)、hLic3 CAR7b(SEQ ID NO.26)、hLic3 CAR8(SEQ ID NO.27)以及hLic3 CAR9(SEQ ID NO.28)。
图23呈现了IL2产生，其作为信号传导功能。
图24示出了Lic3第2代CAR(Lic3scFv-CD28铰链+TM+内切-CD3ζ内切)的氨基酸序列(SEQ ID NO.19)。
图25示出了Lic5第2代CAR(Lic5scFv-CD28铰链+TM+内切-CD3ζ内切)的氨基酸序列(SEQ ID NO.20)。
图26示出了HLic26第2代CAR(Lic26scFv-CD28铰链+TM+内切-CD3ζ内切)的氨基酸序列(SEQ ID NO.21)。
图27示出了Lic3第3代CAR(Lic3scFv-CD28-4-lBB-CD3ζ内切)的氨基酸序列(SEQID NO.22)。
图28示出了Lic5第3代CAR(Lic5scFv-CD28铰链+TM+内切-4-lBB内切-CD3ζ内切)的氨基酸序列(SEQ ID NO.23)。
图29示出了HuLic26第3代CAR(Lic26scFv-CD28铰链+TM+内切-4-lBB内切-CD3ζ内切)的氨基酸序列(SEQ ID NO.24)。
图30示出了Lic5纯化和表征。
图31示出了Lic5的化学敏化作用。
图32示出了Lic5的轻链和重链的可变区的氨基酸序列。
具体实施方式
本申请提供了特异于钙粘蛋白-17(CDH17)的抗体、靶向肿瘤细胞的抗体以及利用此类抗体的抗肿瘤免疫疗法。此类免疫疗法包括拥有刺激T或NK细胞细胞毒性的不同模式的细胞毒性或嵌合抗原受体的抗体。
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科技术语具有本公开所属技术领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。尽管在本公开的实践或测试中可以使用与本文所述方法和材料类似或等价的任何方法和材料，仍对优选的方法和材料进行了描述。为了本公开的目的，以下对之后的术语进行定义。
在本文中冠词“一(a)”和“一个(an)”被用来指代该冠词的语法对象的一个或一个以上(即，至少一个)。举例来说，“要素”意思是一个要素或一个以上的要素。
“大约”意思是数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相对于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化了差不多30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
“编码序列”意思是促成基因的多肽产物的编码的任意核酸序列。相比而言，术语“非编码序列”指的是不促成基因的多肽产物的编码的任意核酸序列。
在本说明书全文中，除了上下文另有要求之外，词语“包括(comprise)”、“包括(compri ses)”和“包括(compri sing)”应当理解为意指包含所述步骤或要素或者步骤或要素的组，但是并不排除任何其他步骤或要素或者步骤或要素的组。
“由……组成”意思是包括但限于短语“组成”之后的任何要素。因此，短语“由……组成”表明所列出的要素是必需或强制性的并且可以不存在其他要素。
“基本上由……组成”意思是包括该短语之后所列的任何要素，但是仅限于对所列要素在公开内容中指定的活性或动作不会产生干扰或贡献的其他要素。因此，短语“基本上由……组成”表明所列要素是必需或强制性的，但是那些任选的以及可以或可以不存在的其他要素取决于它们是否影响所列要素的活性或动作。
术语“互补”和“互补性”指的是通过碱基配对原则相关联的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，序列“A-G-T”与序列“T-C-A”互补。互补性可以是“局部的”，其中核酸的碱基中只有一些根据碱基配对原则匹配。或者，核酸之间可以是“完全”或“总体”互补。核酸链间的互补性的程度会显著影响核酸链之间杂交的效率和强度。
“对应于(corresponds to)”或“对应于(corresponding to)”意思是(a)多核苷酸具有与参考多核苷酸序列的全部或一部分基本上相同或互补的核苷酸序列或者编码与肽或蛋白中氨基酸序列相同的氨基酸序列；或者(b)肽或多肽具有与参考肽或蛋白中氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。
如本文所使用的，术语“功能”和“功能性”等指的是生物的、结合或治疗功能。
“基因”意思是在染色体中占据特定位点的遗传单位，并且包含转录和/或翻译调控序列和/或编码区和/或非翻译序列(即，内含子，5'和3'非翻译序列)。
“同源性”指的是相同的或构成保守置换的氨基酸的百分比数。同源性可以利用诸如GAP(Deveraux等，1984年，核酸研究(Nucleic Acids Research)第12期，387-395页)序列比较程序来确定，其通过引用结合于此。以此方式，与本文所述的序列具有相似或实质不同长度的序列可以通过插入间隙对准来进行比较，此类间隙例如由GAP所使用的比较算法来确定。
术语“宿主细胞”包括单独的细胞或细胞培养物，其可以作为或者已经是本公开的任何重组载体或分离多核苷酸的受体。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且该后代由于自然、偶然或有意的突变和/或变化(在形态学上或DNA互补性上)不必与原始母细胞完全相同。宿主细胞包括利用本公开的重组载体或多核苷酸在体内或体外转染或感染的细胞。包括本公开的重组载体的宿主细胞为重组宿主细胞。
“分离的”抗体是已经从其自然环境的成分中识别和分离和/或回收的抗体。其自然环境的污染成分是可能干扰抗体的诊断和治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素和其他蛋白或非蛋白溶质。
“分离的”核酸分子是从抗体核酸的天然来源中通常与其结合的至少一种杂质核酸分子中识别并分离出来的核酸分子。分离的核酸分子与天然中发现的该分子的形式和结构不同。因此，分离的核酸分子与存在于天然细胞中的核酸分子相区别。然而，分离的核酸分子包括包含在细胞中的通常表达该抗体的核酸分子，例如，其中核酸分子在染色体中的位置与其在天然细胞中的不同。
表达“控制序列”指的是特定宿主生物中，表达可操作连接的编码序列所需的DNA序列。例如，适合于原核生物的控制序列包括启动子，任选地包括操纵子序列和核糖体结合位点。真核细胞已知会使用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。
当其与另一核酸序列处于功能关系时，核酸是“可操作地连接”。例如，用于前序列或分泌前导序列的DNA，如果其表达为参与多肽分泌的前蛋白，则可操作地连接至用于多肽的DNA；启动子或增强子，如果其影响序列的转录，则可操作地连接至编码序列；或者核糖体结合位点，如果其被定位成为了利于翻译，则可操作地连接至编码序列。通常，“可操作地连接”意思是被连接的DNA序列是邻近的，并且如果是分泌前导序列，是邻近并处于阅读阶段的。然而，增强子并不必须是邻近的。在便利的限制性位点处连接通过连接作用来完成。如果此类位点不存在，则根据常规做法使用合成寡核苷酸衔接子或接头。
本文所使用的“多核苷酸”或“核酸”表述指mRNA、RNA、cRNA、rRNA、cDNA或DNA。该术语通常指的是长度上具有至少10个碱基的聚合形式的核苷酸，可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，或者是任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括单链和双链形式的DNA和RNA。
术语“多核苷酸变体”和“变体”等指的与参考多核苷酸序列显示出充分序列相同性的多核苷酸，或者在本文之后定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸。这些术语还涵盖了通过添加、删除、置换至少一个核苷酸而与参考多核苷酸区别的多核苷酸。相应地，术语“多核苷酸变体”和“变体”包括其中已经添加或删除或者以不同核苷酸替代一个或多个核苷酸的多核苷酸。就这一点而言，本领域内熟知的是，可以对参考多核苷酸做出包括突变、添加、删除和置换在内的某些改变，由此改变后的多核苷酸保留了参考多核苷酸的生物功能或活性，或者相比于参考多核苷酸增强了活性(即，被优化)。多核苷酸变体包括，例如，与以上所述参考多核苷酸序列具有至少50％(以及至少51％至至少99％和它们之间的所有整数百分比，例如，90％、95％或98％)序列相同性的多核苷酸。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括天然产生的编码这些酶的等位基因变体和直系同源物。
“多肽”、“多肽片段”、“肽”以及“蛋白”在本文中可交换使用，以指代氨基酸残基的聚合体及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为合成非天然产生氨基酸的氨基酸聚合体，比如对应的天然产生氨基酸的化学类似物，以及适用于天然产生的氨基酸聚合体。在某些方面，多肽可以包括酶促多肽，或者“酶”，其通常催化各种化学反应(即，提高其速率)。
多肽“变体”的表述指的是通过添加、删除或置换至少一个氨基酸残基而与参考多肽序列区别的多肽。在某些实施例中，多肽变体通过一个或多个置换而区别于参考多肽，其可以是保守或非保守的。在某些实施例中，多肽变体包括保守置换，并且就这一点而言：本领域熟知的是，在不改变多肽活性的性质的情况下，可以将一些氨基酸改变成具有广泛相似性质的其它氨基酸。多肽变体还涵盖了其中已经添加或删除或者以不同的氨基酸残基替代一个或多个氨基酸的多肽。
术语“参考序列”通常指的是核酸编码序列，或者是将另一序列与之进行比较的氨基酸序列。本文所述的所有多肽和多核苷酸序列被包含作为参考序列。
“序列相同性”的表述，或者，例如，如本文所使用的，包括“与……50％相同的序列”，指的是，比较窗口上的序列在核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的基础上的序列相同程度。因此，“序列相同性的百分比”可以通过以下进行计算：将比较窗口上两个最优对齐序列进行比较，确定在两个序列上出现相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、lie、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、Hi s、Asp、Glu、Asn、Gin、Cys和Met)的位置的数目以得到相匹配位置的数目，将相匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数目(即，窗口大小)，将结果乘以100以产生序列相同性的百分比。包括在内的有与本文所述的任一参考序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列相同性的核苷酸和多肽(参见序列列表)，通常其中多肽变体保留了参考多肽的至少一种生物活性。
“统计上显著”，其意思是该结果不太可能偶尔发生。可以通过本领域已知的任何方法确定统计显著性。通常使用的显著性的量度包括p值，其为在零假设为真的前提下所观察事件将发生的频率或概率。如果所得到的p值小于显著性水平，则拒绝该零假设。在简单情况下，显著性水平被定义为0.05或更小的p值。
“基本上”或“实质上”意思是几乎整个或完全地，例如，某个给定数量的95％、96％、97％、98％、99％或者更大。
“处理”或“治疗”或“减轻”指的既是治疗处理又是预防措施，其中目的是为了防止或减缓(减轻)目标病理情况或紊乱。例如，对于癌症，使癌细胞数目减少或癌细胞消失；减小肿瘤大小；抑制(即，一定程度上减缓并且最好终止)肿瘤转移；一定程度上抑制肿瘤生长；增大缓解期长度，和/或一定程度上减轻与特定癌症相关联的一种或多种症状；降低发病率和死亡率，以及改善生活质量问题。疾病的征候或症状的减轻还可以由患者感受到。治疗可以实现完全的反应，定义为癌症的所有征候消失，或者实现部分反应，其中肿瘤的大小被减小优选超过50％，更优选地75％。如果患者病情稳定，那么该患者也视为得到治疗。在优选实施例中，一年之后，优选地15个月之后，癌症患者癌症仍然无进展。用于评估疾病的成功治疗和改善的这些参数易于通过本领域具有适当技能的医师所熟悉的常规流程测量。
术语“调节”和“改变”包括通常以相对于对照而言统计上显著或生理上显著的量或程度“增加”和“提高”以及“减少”或“降低”。在特定实施例中，与血液代用品的移植相关的免疫排斥相对于未修饰或不同修饰的干细胞减少了至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％或至少1000％。
“增加”或“提高”的量通常是“统计上显著”的量，并且可以包括增加了本文所述量或水平的1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50倍或更多倍(例如，100、500、1000倍)(包括在它们之间且在1以上的所有整数和小数点，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)。
“减少”或“降低”或“较少”的量通常是“统计上显著”的量，并且可以包括减少了本文所述量或水平的1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50倍或更多倍(例如，100、500、1000倍)(包括在它们之间且在1以上的所有整数和小数点，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)。
“从……得到”意思是从特定来源(比如期望生物体或期望生物体内的特定组织)分离或从其衍生的标本，比如例如多核苷酸或多肽。“从……得到”还可以指的是其中从特定生物体或生物体内的组织分离或从其衍生多核苷酸或多肽序列的情况。例如，编码本文所述参考多肽的多核苷酸序列可以从各种原核或真核生物分离，或者从特定真核生物内的特定组织或细胞分离。“治疗有效量”指的是能够有效“治疗”受试者疾病或紊乱的抗体或药物的量。在癌症的情况下，药物的治疗有效量可以减少癌细胞的数目；减小肿瘤大小；抑制(即，一定程度上减缓并且最好终止)癌症细胞侵入周围器官；抑制(即，一定程度上减缓并且最好终止)肿瘤转移；一定程度上抑制肿瘤生长；和/或一定程度上减轻与癌症相关联的一种或多种症状。参见之前对“治疗”的定义。“慢性”给药指的是以相对于急性模式的连续模式进行药剂的给药，以便将初始的治疗效果(活性)维持经延长的一段时间。“间歇性”给药是一种并非不间断连续进行的治疗，而是实质上循环的。
“载体”包括穿梭载体和表达载体。通常，质粒构建还将包括复制的起点(例如，复制的ColEl起点)和可选择的标记(例如，氨苄青霉素或四环素抗性)，以用于在细菌中分别复制和选择质粒。“表达载体”指的是包含用于在细菌或真核细胞中表达包括本公开抗体片段的抗体所必须的控制序列或调节要素的载体。下文中公开了合适的载体。
术语“抗体”以最广泛的含义使用并且具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)以及抗体片段，只要它们呈现出期望的生活活性或功能。
“抗体片段”包括全长抗体的一部分，通常为抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由具有以紧密非共价缔合的一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。通过这两个结构域的折叠，发散出六个高度可变环(3个环各自形成H链和L链)，其为抗原结合贡献了氨基酸残基并且给予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单可变结构域(或者Fv的一半，仅包括特异于抗原的三个互补决定区(CDR))，也具有识别和结合抗原的能力，即使在比完整结合位点更低的亲和力下。
本文所使用的术语“单克隆抗体”指的是从基本上同质的抗体群中获得的抗体，即除了可能以很少量存在的天然产生突变外，包含该群的各个抗体是相同的。单克隆抗体具有指向单个抗原性位点的高度特异性。此外，相比于通常包括指向不同决定子(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备，每个单克隆抗体都指向抗原上的单个决定子。修饰词“单克隆”表示该抗体的特征为从基本上同质的抗体群获得并且不应解释为需要通过任何特定的方法产生该抗体。例如，根据本公开使用的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法制备，该方法由Kohler等在《自然(Nature)》(256:495(1975))中首次描述，或者可以通过重组DNA方法制备(参见，例如美国专利第4,816,567号)。例如，“单克隆抗体”还可以利用Clackson等在《自然(Nature)》(352:624-628(1991))以及Marks等在《J.Mol.Biol.222:581-597(1991)》中描述的技术从噬菌体抗体库分离。
术语“可变”指的是抗体之间可变结构域(V结构域)的某些片段在序列方面广泛地不同。V结构域介导抗原结合并限定了特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在可变结构域的10-氨基酸跨度上不是均匀分布的。相反，V区由被称为构架区(FR)的相对不变的延伸组成，具有15至30个氨基酸，其由具有极度可变性被称为“高变区”的较短区域隔开，该高变区每个长度约9至12个氨基酸。天然重链和轻链的可变结构域各自包括四个构架区(FR)，大多采用β片构造，由三个高变区连接，形成环形连接，并且在一些情况下形成β片结构的一部分。每条链的高变区通过FR紧邻保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，《具有免疫重要性的蛋白序列(Sequences ofProteins of Immunological Interest)》，第5版，公共健康服务、国家健康机构，贝塞斯达，马里兰州(1991))。恒定区不直接涉及抗体与抗原的结合，但呈现出多种效应子功能，比如抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
当在本文使用时，术语“高变区”指的是抗体负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包括来自CDR的氨基酸残基(例如，在VL中大约在残基24-34(LI)、50-56(L2)和89-97(L3)附近，和在VH中大约在残基31-35B(HI)、50-65(H2)和95-102(H3)附近)(Kabat等，《具有免疫重要性的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》，第5版，公共健康服务、国家健康机构，贝塞斯达，马里兰州(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(例如，VL中的残基26-32(LI、50-52(L2)和91-96(L3)，以及VH中的26-32(HI)、52A-55(H2)和96-101(H3))(Chothia和Lesk，《Mol.Biol.196:901-917(1987)》)。
“嵌合”抗体(免疫球蛋白)具有与源自特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源的重链和/或轻链的一部分，而链的剩余部分与源自另一个物种或属于另一个抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们呈现出期望的生物学活性(美国专利第4,816,567号；Morrison等，《Proc.NatlAcad.Sci.USA81:6851-6855(1984)》)。本文所使用的人源化抗体是嵌合抗体的子集。
非人(例如，小鼠)抗体的“人源化”形式是包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在一些实施例中，人源化抗体是人类免疫球蛋白(受体或受体抗体)，其中受体的高变区残基由来自非人物种(供体抗体)的高变区残基所取代，比如具有期望特异性、亲和性、和性能的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类。在一些实施例中，人源化抗体为源自人类细胞或具有表达人抗体基因的转基因动物(通常为小鼠)的抗体。
在一个方面，本文所提供的为具有针对CDH-17的特异性的抗体或其抗原结合片段。通过抑制其肿瘤生长促进活性并通过向肿瘤细胞引导细胞毒活性，肿瘤相关抗原可以作为抗肿瘤免疫疗法的靶点。钙粘蛋白-17是1类质膜糖蛋白，其属于细胞粘附分子的钙粘蛋白总科。它是非经典钙粘蛋白，在其胞外域中拥有7个钙粘蛋白或钙粘蛋白状重复。钙粘蛋白-17(CDH-17)是参与肿瘤生长的肿瘤相关抗原。通常限于结肠、小肠以及胰管的肠上皮细胞的CDH-17表达在一些肿瘤类型中过度表达，包括结肠腺癌、胃腺癌、肝细胞癌和胰腺腺癌。肿瘤生长促进活性可能涉及CDH17结构域6中RGD基序与诸如α2βι的整联蛋白之间的结合。血液和外来体中CDH-17水平的异常增加可以作为预后癌症标记。
通过利用蛋白质组学和癌症基因组学方法，本文公开了治疗靶点、肝肠钙粘蛋白或钙粘蛋白-17(CDH17)。在大多数胃癌(GC)和肝细胞癌以及在(HCC)胰腺癌、结肠癌、卵巢癌以及肺癌中，靶点被过度表达。在建立的HCC小鼠模型(异种移植和原位)中，CDH17基因的RNAi沉默可以抑制肿瘤生长和转移扩散。基本的抗肿瘤机制是基于Wnt信号传导的灭活伴随肿瘤抑制因子路径再激活。
在该应用中存在的抗-CDH17抗体已经在肝癌和胃癌的体内和体内系统中成倍显示出抗肿瘤效果。此类抗体具有体内和体外纯化、检测、诊断以及治疗用途。此类抗体可以发展为通过选择性结合到肿瘤细胞支持抗肿瘤活性和刺激补体固定、抗体依赖性细胞毒性、通过缀合要素介导的细胞毒性、淋巴细胞介导的细胞毒性以及NK介导的细胞毒性。本文提供的是抗体和人源化抗体、抗原结合片段或嵌合抗体蛋白，包括具有按以下提供的对应SEQ ID阐述的氨基酸序列的重链可变区。
CDH17抗体序列可以包括各种类型的抗体，比如小鼠抗体(Lic3和Lic5；图1)和它们的人源化变体(图2至图9)、从噬菌体库筛选分离的人抗体(图10至图12)、具有支持ADCC、补体结合的同种型的单特异性抗体以及针对细胞毒性抗癌活性的药物缀合物(优选的缀合部分为伊立替康、奥瑞斯他汀、PBD、美登素、鹅膏蕈碱、剪接体抑制剂以及其他化学治疗剂)(图13)、双特异性抗体，包括各种工程抗体片段(Fab、scFv、双抗体等)。优选的形式包括孔中球形突出物和“刺入”(图14中的示例性序列)。
在一些实施例中，大鼠CDH17抗体、Lic5 scFv和Lic3 scFv在ELISA试验中分别显示出了它们结合CDH17的能力(图15至图16)。还可以通过ELISA确定Lic3和Lic5 scFv的结合亲和力，其中scFV Lic3和scFv Lic5的Kd分别为11.88nM和22.06nM。
在另一个方面，Lic5内化到人胃癌细胞内表明了用于抗体药物缀合物的候选，如图18中所示；(a)显示在标示时间DAPI(蓝色)和Lic5-FITC(绿色)染色的照片；(b)显示在标示时间DAPI(蓝色)和Lic5-FITC(绿色)合并染色的照片；通过共聚焦显微镜确定了在37℃下经过30分钟在Ouml人胃癌细胞中的Lic5-FITC(绿色)内化；利用DAPI对细胞核染色。
在一些实施例中，通过标准杂交瘤技术产生超过200个CDH17单克隆抗体。通过利用四个cDNA表达构建克隆((hL3.1-3.4)转染的CHO细胞来表达人源化Lic3scFvFc。将来自转染或模拟转染的CHO的培养基添加到具有CDH17Fc的96孔板。利用抗小鼠Fc HRP缀合物确定结合。将结合与同样在CHO细胞中产生的小鼠Lic3 scFvFc(mLic3scFv)的结合进行比较(图19)。
在一个方面，利用支配与经修饰人lgG4 Fc(CDH17Fc)融合的7个钙粘蛋白重复(D1-7)的完整胞外域的重组CDH17使小鼠免疫。杂交瘤培养基是用于结合到CDH17Fc并且无法结合到lgG4 Fc的筛选。通过标准PCR方法产生支配D1、D1-2、D1-3、D3-4、D6和D5-7的CDH17Fc截短。识别出具体结合到各个截短的CDH17抗体并在图20中给出了示例。针对与支配所有7个胞外域或者支配结构域1-2、结构域3-4、结构域5-6或结构域6的结合，通过ELISA对一组13个新颖CDH17单克隆抗体进行分析。抗体表位被定位到不同的结构域。出人意料地，发现某些抗体的结合被约束于CHO细胞中产生的CDH17，而发现其他抗体的结合被约束于293F细胞中产生的CDH17。
在另一方面，识别出抗体结合到已经涉及依赖CDH17的同型和异型相互作用的D1、D6以及D1和D6结构域。CDH17抗体通过流式细胞术与CDH17阳性肿瘤细胞系的结合，产生了不曾预料的结果(图21)。观测到许多不同的结合谱，表明有不同形式的CDH17按照细胞类型特定方式表达。这种概念通过CDH17抗体与CHO细胞中产生的相对于与293细胞中产生的重组CDH17的差异性结合而得到进一步支持。因此，这些新颖CDH17抗体可以用于选择性地靶向在一个组织而不是另一中表达的CDH17。
在一些实施例中，设计并分析第二代CAR，其中CAR7、7b、8以及9利用人源化Lic3scFv、CD8或IgGl铰链、CD8或CD28跨膜结构域、CD137或CD28胞外结构域和CD3ζ(同种型1/2或3/4)胞外结构域构建CAR(图22A)。通过FACS分析对慢病毒转导之后第4天的胞株细胞进行分析，由可溶性重组CDH17Fc结合显示出了GFP表达和CAR表达(图22B)。通过利用抗Fc荧光染料缀合物确定CDH17与CAR的结合。此外，在涂覆有CDH17Fc、EGFRFc(对照)或没有蛋白(NA)的96孔板中接种表达不同CAR的胞株细胞。向一些含有胞株细胞的未涂覆孔添加Immunocult(CD3-CD28复合物)。在刺激的48小时之后，通过ELISA测量培养基中的11-2水平，表明IL2产生可以作为信号传导的函数评估。
在一些实施例中，CDH17抗体可以拮抗CDH17结构域6中RGD位点与包括α2β1的整联蛋白的结合。
在另一方面，公开了具有针对CDH17的特异性的双特异性抗体。该双特异性抗体可以具有以下特征中的至少一个，包括但不限于：通过以活化细胞细胞毒性的方式连接肿瘤细胞(CDH17)与细胞毒性T或NK细胞受体(例如，CDH17/CD3)来杀死肿瘤细胞，通过结合淋巴/NK/单核细胞活化剂(例如，4-1BB、OX40、CD27、CD40、TIM-1、CD28、HVEM、GITR、ICOS、IL12受体、IL14受体)刺激细胞毒性或趋化因子产生以及免疫细胞募集来增强抗癌活性，阻止免疫检查点抑制剂(PD-1、TIM-3、LAG-3、TIGIT、CTLA-4、PD-L1、BTLA、VISTA)，阻止血管生成因子(例如，VEGF)。CDH17可以结合治疗与细胞毒性药物(例如，顺铂、吉西他滨、伊立替康)或者其他抗肿瘤抗体一起使用。
在一些实施例中，CDH17特异性scFv被改造为第二或第三代嵌合抗原受体(CAR)以支持T和NK细胞介导的肿瘤细胞细胞毒性(图24至图26中的序列和设计)。CDH17特异性CAR-T和CAR NK细胞可以杀死不同类型的实体肿瘤，包括但不限于肝、胃、结肠、胰腺和肺的实体肿瘤。因此，CDH17可以用于例如与肝和胃癌症有关的各种状况。
CDH17是一种在肝癌和胃癌两者中过度表达的突出癌症标记，但是在正常的健康成人组织中不会。CDH17在癌症的转移性表型中高度表达，并且阻断CDH17明显降低了HCC的肺部转移。靶向CDH17标记的单克隆抗体能够抑制肝和胃肿瘤的生长。利用CDH17生物标记在肿瘤组织和/或血清标本中的指示，CDH17人源化抗体可以临床上用来治疗癌症患者。针对体内模型研究的概念验证，选择抗CDH17scFv分子来产生CART载体。
针对具有针对肿瘤限制CDH17表位的特异性的抗体，选择源自临床标本的肿瘤抗原。如此，Lic5和Lic3mAbs两者均显示为仅结合HCC和GC的肿瘤细胞。通过降低和/或改变抗体亲和性(通过计算机建模)，CDH17-CAR-T细胞将与肿瘤细胞表面的结合将具有增强的差异。
大部分实体肿瘤被脉管系统和免疫细胞包围，其以免疫抑制环境表征。大量调节T细胞的存在以及癌症中免疫检查点因子(PD1和TIM-3)的阻断将有利于可能影响CAR-T细胞有效性的免疫耐受条件。为了解决该问题，在CAR-T载体中形成抗PDI/抗Tim3双特异性成分，从而导致避开了免疫检查点阻挡层。此外，一旦该抗PDI/抗Tim3成分在肿瘤微环境中接合，则其将转成CAR-T细胞的抗肿瘤细胞毒性活性以增强疗效和提高安全性。
嵌合抗原受体(CAR)，也被称为人造T细胞受体，被改造为免疫受体，其为将单克隆抗体的特异性移植到由逆转录病毒载体促进的T细胞上。经CAR改造的T细胞可以识别并杀死癌细胞并且展示了显著的临床意义。
本文公开了用于临床应用的嵌合IgGFc融合蛋白。示例性的嵌合IgG融合蛋白包括ICAM-1和ICAM-2的可溶形式以用于对自身免疫性疾病和病毒感染的治疗性干预。CAR-T载体利用源自mAb的scFv结构域、键以及胞质结构域构建，其中不同代的CAR-T载体由含有3个ITAM的CD3-ζ(用于活化和共同刺激信号)简单形式进化到包含CD28和OX40的最近第3代以提供增殖/存活信号。由本文所公开的CDH17-特异性克隆(Lic3和Lic5)，scFv段被设计为用于克隆到第3代基于慢病毒的CAR-T载体内。
示例
将参考以下示例进一步描述本公开。除非另行指出，这些示例仅被提供为用于说明的目的而并不旨在进行限制。因此，本公开决不应被解释为限制于以下示例，而是，应当被解释为涵盖任何和全部变型，由于本文所提供的教导这将是显而易见的。
示例1研究设计和方法
利用原位肿瘤异种移植模型来测试Lic5单独或结合顺铂或表柔比星对肿瘤生长抑制和动物存活的影响。使用了人HCC细胞系MHCC97-L(97L)和PLC/PRF/5(PLC)。单独的Lic5、顺铂和表柔比星处理利用细胞增殖试验抑制了培养的HCC细胞的生长，而当顺铂或表柔比星与Lic5被一起使用时，观察到了更显著的降低。当应用相同的实验组来处理原位荷瘤裸鼠时，观察到了类似的生长抑制趋势。
当与对照组进行比较时，Lic5的处理增强了原位荷瘤裸鼠的存活。在所有实验组中，组合的Lic5和表柔比星组产生了最佳存活。为了下一阶段的抗体人源化，识别Lic5的轻链和重链上可变区上的互补性决定区(CDR)。两种细胞系均在杜尔贝科(Dulbecco)的改良伊格尔培养基(DMEM)(生命技术公司，美国纽约，格兰德岛)中培养，其补充有10％的热灭活胎牛血清(FBS)(生命技术公司)、100单位/毫升的青霉素和链霉素(生命技术公司)。在37℃下含有5％二氧化碳的加湿空气中维持经培养的细胞。
示例2Lic5的产生和表征，针对CDH17的内部单克隆抗体
如[5]所述产生分泌Lic5的内部杂交瘤细胞系。在补充有10％的FBS以及100单位/毫升的青霉素和链霉素的DMEM中维持杂交瘤细胞。为了收集Lic5，在无血清的杂交瘤-SFM(生命技术公司)中培养杂交瘤细胞6天。利用蛋白G柱(生命技术公司)收集并纯化经培养的上清液。利用RC DC蛋白试验(伯乐公司，美国加州，赫拉克勒斯)估计经纯化的Lic5的浓度。在还原条件下通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)评价Lic5的纯度，之后进行考马斯蓝染色。通过利用97L细胞溶解产物的蛋白质印迹和通过利用石蜡包埋的人HCC组织的免疫组织化学法确认Lic5的免疫反应性和特异性。将临床标本用于研究得到了香港大学的机构审查委员会/医院管理局香港西联网(HKU/HA HKW IRB)的批准。SDS-PAGE、考马斯蓝染色以及蛋白质印迹的程序按照常规执行，而用于免疫组织化学法的方法在以下进行描述。
示例3体内细胞增殖试验
将预定数目的97L和PLC细胞接种到96孔培养板上1天。150μg/ml的小鼠IgG(西格玛奥德里奇公司，美国密苏里州，圣路易斯)作为Lic5的对照。处理之后，利用细胞增殖试剂盒I(罗氏公司，美国印第安纳州，印第安纳波利斯)按照上文所述测量经处理细胞的增殖。简言之，利用经处理的细胞培养MTT试剂4小时。随后在添加10％的SDS之后测量比色信号。为了确认结果执行独立的细胞增殖MTT试验至少两次。
示例4原位异种移植模型
雄性裸鼠从香港的香港大学实验动物单位获得。在12小时光照/12小时黑暗周期下将动物饲养在单独的通风笼中，并使其能够自由获得高压灭菌水和食物。在本研究中执行的动物实验由委员会批准，允许我们学院在教学和研究(CULATR)中使用活体动物。为了允许在体内观察正在生长的原位肝肿瘤，使用了预先建立的荧光素酶标记97L细胞系。5x106的荧光素酶标记97L细胞被皮下注射到裸鼠体内以允许皮下肿瘤的生长。当其大小达到200-300mm3时收获这些皮下肿瘤，并按照标准程序将其用作肿瘤接种以在裸鼠的分离组中建立原位肝肿瘤。原位肿瘤植入后5天，通过腹膜内给药3次/周持续3周，小鼠接受以下各种处理(每组中10-11只小鼠)：(2)1mg/kg的顺铂；(3)1mg/kg的表柔比星；(4)Lic5和顺铂的组合处理；(5)Lic5和表柔比星的组合处理；(6)6mg/kg的小鼠IgG作为Lic5对照。处理后的每周，在腹膜内注射150mg/kg氢氧化钾萤光素(黄金生物技术公司，美国密苏里州，圣路易斯)后，通过在活体成像系统(珀金埃尔默公司，美国马萨诸塞州，沃尔瑟姆)的IVIS100中活体成像来监测原位肿瘤生长和转移。对于每一次测量，针对每个肿瘤获得净光子计数。在实验结束时，收集原位肿瘤并使其经受福尔马林固定和石蜡包埋。
示例5动物存活研究
利用97L细胞如上所述建立原位肝肿瘤。原位荷瘤小鼠腹膜内接受以下处理3次/周持续3周(每组中11-15只小鼠)：(1)8mg/kg的Lic5；(2)1mg/kg的顺铂；(3)1mg/kg的表柔比星；(4)Lic5和顺铂的组合处理；(5)Lic5和表柔比星的组合处理；(6)8mg/kg的小鼠IgG作为Lic5对照。连续监测动物存活直到处理后的6周。
示例6免疫组织化学
在石蜡包埋的上述原位肿瘤移植物和人HCC标本上进行免疫组织化学。简言之，制备6μm的切片用于脱蜡和再水合。在抗原修复和过氧化氢处理之后，在利用针对α-连环蛋白(1:200；维百奥公司(BD Bioscience)，美国加州，圣何塞)的小鼠单克隆抗体和Lic5((0.0625μg/ml)在4℃下通宵染色前，利用3％的牛血清白蛋白将切片封闭。利用EnVi sion+System-HRP标记的抗小鼠聚合物(达科公司(Dako)，美国加州，卡平特里亚)检测信号并利用液态DAB+基质色原系统(Liquid DAB+Substrate Chromogen System)(Dako)将其可视化。利用苏木精进行对比染色。利用DXM1200F数码相机(尼康公司，美国纽约州，梅尔维尔)捕获图像。
示例7Lic5可变区的克隆
利用TRIzol试剂(生命技术公司)从分泌Lic5的杂交瘤细胞提取总RNA并利用superscriptIII第一链合成系统(生命技术公司)将其转换为cDNA。利用Ig-Primer套件(Novagen，德国)和铂Taq DNA聚合酶高保真(生命技术公司)扩增来自Lic5的重链和轻链的可变区cDNA片段。轻链的可变区通过5'可变区引物(5'-ATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3')和恒定区上的3'引物扩增，而重链的可变区通过5'可变区引物(5'-ATGAACTTYGGGYTSAGMTTGRTTT-3'，其中Y＝C/T，S＝C/G，M＝A/C，以及R＝A/G)和恒定区上的3'引物得到。PCR产物在1.5％的琼脂糖凝胶上分解之后被纯化和测序(BGI，香港)。
示例8Lic5的CDR的识别
Lic5的重链和轻链的可变区的核苷酸序列被用来衍生氨基酸序列，随后根据卡巴特编号方案对其进行编号。根据卡巴特定义(www.bioinf.org.uk)识别CDR。
示例9统计分析
利用SPSS版本19(SPSS公司，美国伊利诺伊州，芝加哥)进行统计分析。在条形图中呈现的数据被表示为平均值±SD/SEM。同时在细胞增殖MTT试验和动物肿瘤异种移植实验两者中，使用斯图登f检验来计算处理组和对照组之间差异的显著性。针对存活分析采用卡普兰-梅尔分析(Kaplan-Meier)法，同时利用时序检验(log-ranktest)计算存活中的差异。小于0.05的p值被认为是统计上显著的。
示例10由杂交瘤细胞培养上清液建立并纯化大量的Lic5
为了获得具有高纯度和数量的Lic5以用于体外和体内实验，在无血清培养基中培养分泌Lic5的杂交瘤细胞。迄今为止，对Lic5纯化已经实现了用于建立流水线的良好抗体纯度和产率。考马斯蓝染色结果显示出两个突出的约55kDa和27kDa的条带，对应于第6天培养上清液上抗体的重链和轻链，而在第1天培养上清液上并未观测到这些条带。随着出现可检测水平的抗体，在第6天对收集的培养上清液进行蛋白G亲和层析以用于抗体纯化。当将第6天培养上清液加载到柱上之后在流穿液中未检测到抗体存在时，确认抗体成功地结合到了蛋白G柱上。在不同级分上进行的抗体洗脱(洗脱液E1至E4)显示，第二和第三洗脱级分含有最丰富的抗体。对应于抗体的重链和轻链的两个染色条带是在蛋白凝胶上检测到的主要条带，暗示了我们的抗体纯度超过了90％(图30(A))。利用我们的抗体纯化流水线，从在第6天收集的每升培养上清液，可以收集有利抗体的量为23.88±6.96mg的Lic5。
经纯化的Lic5证实了针对CDH17的高免疫反应性。当Lic5被用作蛋白质印迹的初级抗体时，在CDH17表达97L细胞中检测到和CDH17的表观分子量相对应的大约120kDa的单个条带(图30(B))。当Lic5被用于免疫组织化学以在人HCC组织中检测CDH17时，在细胞膜和细胞质出现离散的染色(图30(C))。在本研究中通过使用Lic5产生的免疫组织化学染色类似于先前通过将针对CDH17的商用抗体用于免疫组织化学的报告。
示例11Lic5的存活益处
检查Lic5对另一种化学治疗药物表柔比星的化学致敏效果。在原位肿瘤异种移植模型中进行具有或没有Lic5的药物检验。
在利用经纯化的Lic5处理原位荷瘤小鼠之前，在经培养的HCC细胞系体外利用细胞增殖MTT试验检查Lic5单独或者与顺铂或表柔比星组合的抗肿瘤效果(图31(A))。当在经培养的97L细胞进行细胞增殖试验时，利用顺铂和表柔比星处理2天分别引起31.6％和21.9％的生长抑制。与Lic5组合进一步增强了生长抑制效果，对于顺铂是1.74倍而对于表柔比星是1.98倍，从而分别引起55.1％和43.3％的生长抑制(图31(A)，左侧图)在经培养的PLC细胞中观察到了类似的生长抑制，其中利用顺铂处理引起37.6％的生长抑制并且利用Lic5的组合处理进一步将生长抑制增强了1.73倍(65.2％)。不同于表柔比星对经培养97L细胞的显著生长抑制，该药物仅将经培养PLC细胞的生长抑制了8.1％。同样，其与Lic5的组合将生长抑制增强了4.62倍并且导致37.4％的显著抑制(图31(B)右侧图)。
由分泌Lic5的杂交瘤细胞系的培养上清液利用蛋白G亲和层析纯化Lic5。图31(A)显示，在考马斯蓝染色凝胶上，来自第6天(D6)的培养上清液(培养S/N)含有比第1天(D1)更高的抗体量。在凝胶上显现了与抗体的重链和轻链相对应的55kDa和27kDa的两个染色条带。在使第6天的培养上清液在蛋白G柱上经过之后，在流穿液(FT)中未检测到抗体。在4个级分(E1至E4)上进行抗体洗脱。最丰富的抗体是在级分E2和E3中洗脱的，其被收集并合并。此外，图31(A)显示，当与细胞增殖MTT试验中的小鼠IgG处理细胞进行比较时，单用Lic5、顺铂或表柔比星处理2天抑制了经培养的97L和PLC细胞的生长。当在Lic5与顺铂或表柔比星的组合处理下对经培养的细胞处理时，观察到了进一步的生长抑制。各柱表示平均值+SD。
图31(B)显示，当在97L细胞溶解产物上将经纯化的Lic5用于蛋白质印记时，显示出与CDH17的表观分子量相对应的单个条带。在图31(B)中，荧光素酶标记的97L细胞被用来在裸鼠中建立原位肿瘤异种移植。对这些动物应用具有或不具有化学治疗药物顺铂或表柔比星的单一和组合Lic5处理3周。所显示的数据为处理3周之后获得的相对于对照IgG组的净光子计数。单一处理得到肿瘤生长抑制，而当Lic5与顺铂或表柔比星组合时，观察到了肿瘤生长的进一步减少。各柱表示平均值+SEM。
图31(C)呈现，当在人HCC组织上将经纯化的Lic5用于免疫组织化学时，检测到了与CDH17的膜和细胞质位置相对应的离散染色。在图31(C)中，利用97L细胞在裸鼠中建立原位肿瘤异种移植。利用Lic5和表柔比星的单一或组合处理对这些动物进行了处理。Lic5和表柔比星的组合处理引起了最有利的存活，如卡普兰-梅尔分析曲线中所揭示的。当将组合处理组与小鼠IgG对照组进行比较时，存活方面达到了统计上显著的差异(p＝0.017)。所使用的缩写：C，顺铂；E，表柔比星；**，p<0.05；ns，统计上不显著。
在通过利用细胞增殖MTT试验确认了经培养HCC细胞上Lic5对顺铂和表柔比星处理的化学致敏效果之后，接下来的步骤为通过动物异种移植实验检验是否可以在体内环境中观察到类似的生长抑制。荧光素酶标记的97L细胞被用于产生用于处理的原位肿瘤异种移植，因为这能够实现对肿瘤生长的活体监测。当与IgG对照组进行比较时，顺铂处理将异种移植生长抑制了48.6％。当与Lic5组合时此类处理进一步将异种移植生长抑制增加1.64倍达到79.6％。尽管有这样的抑制，当与对照组进行比较时，组合处理数据仍未产生统计上显著的值(p＝0.08)。对于表柔比星而言，其与Lic5的组合处理显示，异种移植生长从单一表柔比星处理的37.9％进一步减少到86.4％(即，2.28倍)。然而，异种移植生长方面这样的下降仍然未达到统计上显著的值(p＝0.07)(图31(B))。在该实验结束时，收集原位肿瘤以用于分析α-连环蛋白的表达和定位，其已知为CDH17的下游分子并且是Wnt信号传导途径的关键。当与化学治疗药物的单一治疗进行比较时，Lic5与顺铂或表柔比星的两种组合治疗均减少了α-连环蛋白的总表达和细胞质定位。这样的免疫组织化学结果进一步加强了由Lic5通过其改变α-连环蛋白表达和定位的作用所介导的肿瘤抑制效果。
如图31(B)中所示，当与对照组进行比较时，针对每一个处理组均观察到了肿瘤生长减少的趋势。将针对每个处理组的原位荷瘤小鼠的存活率相对于对照组进行比较。Lic5组的动物存活率达到63.6％，其远高于对照组的存活率(26.6％)。尽管在对照组和表柔比星组之间存活率近似(26.6％相对于25％)，当与对照组进行比较时，在所有实验组中，Lic5和表柔比星的组合处理引起存活率的最显著增加，达到81％(p＝0.017)(图31(C))。然而，当与对照组进行比较时，顺铂组以及利用Lic5的顺铂组在存活方面如此显著的差异仍然未达到任何统计上显著的值。总体来看，该组动物实验已经证实了Lic5在肿瘤生长抑制和存活率诱导上的化学致敏效果，特别是对表柔比星而言。
示例13Lic5可变区上CDR的识别
每种单克隆抗体在重链和轻链上具有其唯一的可变区，它们中的每一个由确定该抗体的抗原结合特性的氨基酸序列组成。为了从Lic5的重链和轻链获得可变区序列，利用离散的引物对对每个可变区扩增(图32，左侧图)。在对扩增后产物进行桑格测序之后，通过电脑模拟方法将核苷酸序列翻译成氨基酸序列。采用Kabat编号方案和CDR定义，以利用推定的氨基酸序列识别Lic5的重链和轻链的可变区上的三种CDR(图32，右侧图)。桑格测序之前的PCR被用来从由Lic5分泌杂交瘤细胞制备的cDNA获得Lic5的轻链和重链的可变区序列(图32，左侧图)。基于Kabat编号方案和CDR定义，识别出两个可变区(VL:SEQ ID NO.29和VH:SEQ ID NO.30)上六种CDR并以不同的颜色将其突出显示(图32，右侧图)。
来自示例的结果已经证实了Lic5在治疗HCC异种移植物中的抗肿瘤和化学致敏效果，显示出本文公开的单克隆抗体可以用于治疗除了HCC之外的其他癌症。Lic5是通过利用CDH17的重组胞外域1-2作为免疫原与Lic3并行产生的单克隆抗体。Lic5靶向CDH17的细胞外区域；当用于治疗目的时，其可以与CDH17的完整形式或羧基端截短形式结合。因此，Lic5可以用于靶向具有CDH17过度表达的其他癌症。除了HCC之外，许多癌症被发现过度表达CDH17，包括胃腺癌、食管腺癌和结直肠癌。在这些癌症类型中，在大多数结直肠癌和食管腺癌中存在CDH17过度表达。如此，这些CDH17过度表达癌症可能易受Lic5的作用的影响。一些进行CDH17抑制的研究抵制了肿瘤形成，表现为在处理之后减少了经培养细胞或肿瘤异种移植物的生长。因此，除了HCC之外，靶向CDH17以抵制肿瘤形成在其他过度表达CDH17的癌症中效果很好。
来自示例的结果显示，CDH17似乎与α-连环蛋白相关网络连接。在一个实施例中，利用Lic5靶向CDH17通过干扰诸如α-连环蛋白的轴心成分的表达和定位，使CDH17/-连环蛋白轴心失活。在另一种癌症类型中，由于CDH17的固有整联蛋白结合亲和性，在结肠直肠肿瘤形成期间CDH17桥接到整联蛋白相关途径。CDH17还影响和Ras/Raf/MEK/ERK以及NFyB有关的两个其他肿瘤形成途径，使得其抑制作用在胃癌中使这些途径失活。鉴于这些观察，仍然要确定Lic5是否也能够阻断这些途径而作为抑制肿瘤形成的手段。
除了检验Lic5的抗肿瘤效果之外，识别Lic5的重链和轻链上每个可变区上的三种CDR。这些CDR负责决定抗体接合亲和性和特异性。
药物组合物
术语“有效量”指的是用来有效获得期望效果的药物量，例如为了减轻受试者的疾病。在疾病是癌症的情况下，有效量的药物可以抑制(例如，在一定程度上减缓、抑制或终止)以下示例性特征中的一种或多种，包括但不限于，癌细胞生长、癌细胞增殖、癌细胞运动、癌细胞侵入周围器官、肿瘤转移以及肿瘤生长。在疾病是癌症的情况下，当向受试者给药时有效量的药物可以实现以下中的一种或多种：减缓或终止肿瘤生长、减小肿瘤大小(例如，体积或质量)、在一定程度上减轻和癌症相关的一种或多种症状、延长无进展存活、引起目标反应(包括，例如，局部反应或完整反应)以及增大总体存活时间。就该药物可以阻止生长和/或杀死已存在的癌细胞而言，其为细胞抑制性和/或细胞毒性。
关于用于向受试者(比如，需要治疗的人类患者)给药的合适组合物的配方，本文所公开的抗体可以根据所选择的给药途径与本领域已知的药物学上可接受的载体混合或组合。对本文所公开抗体的应用没有特别的限制，并且对合适给药途径和合适组合物的选择在本领域是已知的而不需要过度的实验。
尽管许多给药的形式是可能的，示例性给药形式可以是溶液或注射液，特别是用于静脉内或动脉内注射。通常，用于注射的合适药物组合物可以包括药物学上合适的载体或赋形剂，例如但不限于，缓冲剂、表面活性剂或稳定剂。示例性缓冲剂可以包括但不限于醋酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂。示例性表面活性剂可以包括但不限于聚山梨醇酯。示例性稳定剂可以包括但不限于人白蛋白。
类似地，本领域技术人员具有确定本文所公开抗体的有效量或浓度以有效治疗诸如癌症的疾病的能力。其他参数，比如药物组合物的各种成分的比例、给药剂量和频率，可以由本领域技术人员获得而无需过度的实验。例如，用于注射的合适溶液可以包含但不限于，每毫升从约1至约20、从约1至约10毫克的抗体。示例性剂量可以为但不限于，每公斤体重从约0.1至约20、从约1至约5毫克。示例性给药频率可以是但不限于，每天1次或每周3次。
尽管已经参考特定实施例或示例描述了本公开，但是应当理解的是，这些实施例是说明性的并且公开范围并不受限于此。本公开的替代实施对于本公开所涉及技术领域的普通技术人员而言将变得显而易见。此类替代实施例被认为涵盖在本公开的范围内。因此，本公开的范围由所附权利要求书所限定并且能为前述说明书所支持。
总之，新型CDH17抗体，其可变结构域衍生自CDH17mAb，将能够产生用于癌症治疗的独特CAR。CDH17抗体的细胞类型特异性可以相对于在正常细胞或组织中表达的CDH17，实现对表达肿瘤细胞的CDH17更有特异性的靶向。还可以产生表达两种CAR的T细胞或NK细胞，其中一种CAR对肿瘤细胞上的CDH17更有特异性，而第二种CAR对相同肿瘤细胞上的肿瘤相关抗原(TAA)具有中等特异性。组合特异性能够实现对肿瘤细胞标记更有选择性的靶向。替代地，CDH17 CAR可以通过不同的机制支持对中等特异性肿瘤特异性TAACAR的更有特异性的靶向。例如，中等特异性结肠癌或胃癌TAA CAR可以融合到CD3ζ内切结构域。该第一代CAR可能不支持强健的杀死响应并且具有1周至数周的较短体内半衰期。CDH17 CAR可以共表达成融合至CD28或者CD28和CD137内切结构域，这将为第1代CAR提供更强的共刺激信号。CDH17 CAR将在其中CDH17正常表达的结肠和胃中结合并激活强健的肿瘤杀死反应。共表达的第1代CAR将被选择用于和结肠或胃(或者其中CDH17正常表达的其他组织)中未正常表达的靶点结合并且由此将被可选择地活化以杀死结肠癌或胃癌细胞。
尽管已经参考特定实施例描述了本公开，但是应当理解的是，这些实施例是说明性的并且公开范围并不受限于此。本公开的替代实施对于本公开所涉及技术领域的普通技术人员而言将变得显而易见。此类替代实施例被认为涵盖在本公开的范围内。因此，本公开的范围由所附权利要求书所限定并且能为前述说明书所支持。
实施例仅仅是为了说明本公开而并不旨在限制本公开的范围。本技术领域人员应当理解，在不脱离本公开原理的情况下，可以做出某些修改和改进并且应当被认为在本公开的保护之下。
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<210> 1
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> Lic3 VL
<400> 1
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<212> PRT
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20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Phe Asp Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Thr Asp Arg Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Pro Ala Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 3
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Lic5 VL
<400> 3
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Thr Leu Ser Leu Asn Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg Ala Asp
115
<210> 4
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Lic5 VH
<400> 4
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Pro Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ser Phe Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Phe Asp Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Thr Asp Arg Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Pro Ala Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
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<213> 人工序列
<220>
<223> HuLica26 VH
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1 5 10 15
Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser
20 25 30
Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ser Arg Phe Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
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<213> 人工序列
<220>
<223> HuLica26 VL
<400> 6
Met Phe Val Met Ser Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Asn Val Phe Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Glu Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Trp Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
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<213> 人工序列
<220>
<223> HuLica30 VH
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1 5 10 15
Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser
20 25 30
Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
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100 105 110
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<220>
<223> HuLica30 VL
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Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg
1 5 10 15
Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr
20 25 30
Gly Val Gln Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Asp Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly
100
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<211> 110
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<213> 人工序列
<220>
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Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser
20 25 30
Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Gln Gly Ser Gly Trp Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
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<213> 人工序列
<220>
<223> HuLica66 VL
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Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Gly Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Thr Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Ser Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Asn Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Trp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
100 105 110
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<220>
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Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly
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Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Arg
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Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
35 40 45
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50 55 60
Phe Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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Cys Ala Arg Gly Arg Arg Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
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<213> 人工序列
<220>
<223> HuLica78 VL
<400> 12
Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu
1 5 10 15
Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Arg Asn
20 25 30
Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
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Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Gln Ile Ser
65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala Leu
85 90 95
Leu Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
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Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
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Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser
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Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
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Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
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Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
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Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Leu Val Tyr Ser
20 25 30
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Met Gln Gly
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Thr His Trp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
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Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
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Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser
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Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
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Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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Cys Ala Gln Gly Ser Gly Trp Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
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<213> 人工序列
<220>
<223> HuLica94 VL
<400> 16
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Gly Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Thr Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Ser Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Asn Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Trp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
100 105 110
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDH17 arm
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Phe Asp Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Thr Asp Arg Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Pro Ala Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu
130 135 140
Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln
145 150 155 160
Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln
165 170 175
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Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
195 200 205
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
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Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr
225 230 235 240
Lys Leu Glu Leu Lys Gly Ala Pro Gly Gly Gly Ser Gly Glu Pro Lys
245 250 255
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
260 265 270
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
275 280 285
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
290 295 300
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305 310 315 320
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
325 330 335
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
340 345 350
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
355 360 365
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
370 375 380
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Pro Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
385 390 395 400
Val Ser Leu Tyr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
405 410 415
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
420 425 430
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
435 440 445
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
450 455 460
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
465 470 475 480
Leu Ser Leu Gly Lys
485
<210> 18
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 arm
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu
180 185 190
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
225 230 235 240
Val Glu Ile Lys Arg Thr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Ser Gly Glu Pro
245 250 255
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
260 265 270
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
275 280 285
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
290 295 300
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
305 310 315 320
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
325 330 335
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
340 345 350
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
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Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
370 375 380
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Pro Glu Glu Met Thr Lys Asn
385 390 395 400
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
405 410 415
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
420 425 430
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Thr Ser Arg
435 440 445
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
450 455 460
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
465 470 475 480
Ser Leu Ser Leu Gly Lys
485
<210> 19
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Lic2 2nd generation CAR
<400> 19
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asp Tyr
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Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Phe Asp Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Thr Asp Arg Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Arg Pro Ala Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Thr
130 135 140
Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
145 150 155 160
Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Arg
165 170 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr
210 215 220
Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly
245 250 255
Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Trp Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
260 265 270
Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Leu Leu Phe Trp Val Arg Ser
275 280 285
Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
290 295 300
Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg
305 310 315 320
Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg
325 330 335
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
340 345 350
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
355 360 365
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn
370 375 380
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
385 390 395 400
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
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His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
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Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
435 440
<210> 20
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Lic5 2nd generation CAR
<400> 20
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Pro Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ser Phe Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ser Phe Asp Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Thr Asp Arg Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Arg Pro Ala Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Thr Leu Ser Leu Asn Val
130 135 140
Ser Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val
145 150 155 160
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly
165 170 175
Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe
210 215 220
Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu
225 230 235 240
Leu Lys Arg Ala Asp Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser
245 250 255
Lys Pro Phe Trp Val Leu Trp Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
260 265 270
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Leu Leu Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg
275 280 285
Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro
290 295 300
Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe
305 310 315 320
Ala Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
325 330 335
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
340 345 350
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
355 360 365
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln
370 375 380
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Val
385 390 395 400
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
405 410 415
Gly Leu Val Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
420 425 430
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
435 440
<210> 21
<211> 431
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLic26 2nd generation CAR
<400> 21
Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser
20 25 30
Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Val
85 90 95
Cys Ala Ser Arg Phe Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Phe Val
115 120 125
Met Ser Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala
130 135 140
Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asp Gly Asn
145 150 155 160
Thr Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg
165 170 175
Leu Ile Tyr Asn Val Phe Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
180 185 190
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Glu Ile Ser Arg Val
195 200 205
Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly Thr His Trp
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Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Leu Cys Pro Ser Pro
225 230 235 240
Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Trp Val Gly Gly
245 250 255
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Leu Leu Phe
260 265 270
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Val Gln Gln Gly Gln Asn
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Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Val Asp Val
340 345 350
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln
355 360 365
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
370 375 380
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385 390 395 400
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
405 410 415
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<210> 22
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Lic3 3rd generation CAR
<400> 22
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Ala Arg Asp Arg Pro Ala Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
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115 120 125
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Thr
130 135 140
Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
145 150 155 160
Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Arg
165 170 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr
210 215 220
Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly
245 250 255
Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala
260 265 270
Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg
275 280 285
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
290 295 300
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305 310 315 320
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Gly Arg Gly Arg Lys Lys
325 330 335
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
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<211> 488
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<213> 人工序列
<220>
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Ser Leu Lys Leu Pro Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ser Phe Ser Asp Phe
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35 40 45
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Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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325 330 335
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340 345 350
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370 375 380
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450 455 460
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<211> 471
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<220>
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Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu
130 135 140
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Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
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Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr
225 230 235 240
Lys Leu Glu Leu Lys Gly Ala Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
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260 265 270
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
275 280 285
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
290 295 300
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly
305 310 315 320
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
325 330 335
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
340 345 350
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
355 360 365
Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
370 375 380
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
385 390 395 400
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
405 410 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
420 425 430
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
435 440 445
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
450 455 460
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 27
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> synthesized
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Pro Ala Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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130 135 140
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Lys Leu Glu Leu Lys Gly Ala Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
245 250 255
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
260 265 270
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
275 280 285
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
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Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser Lys
305 310 315 320
Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg
325 330 335
Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp
340 345 350
Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
355 360 365
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
370 375 380
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
385 390 395 400
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
405 410 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
420 425 430
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
435 440 445
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
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Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 28
<211> 459
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> synthesized
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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65 70 75 80
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Ala Arg Asp Arg Pro Ala Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu
130 135 140
Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln
145 150 155 160
Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln
165 170 175
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg
180 185 190
Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
195 200 205
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
210 215 220
Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr
225 230 235 240
Lys Leu Glu Leu Lys Gly Ala Pro Gly Gly Gly Ser Gly Glu Pro Lys
245 250 255
Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
260 265 270
Leu Gly Gly Pro Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
275 280 285
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
290 295 300
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
305 310 315 320
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
325 330 335
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
340 345 350
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
355 360 365
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
370 375 380
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn
385 390 395 400
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
405 410 415
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
420 425 430
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435 440 445
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<210> 29
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> synthesized
<400> 29
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Thr Leu Ser Leu Asn Val Ser Leu Gly
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Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg Ala
<210> 30
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> synthesized
<400> 30
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Pro Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ser Phe Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Phe Asp Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Thr Asp Arg Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Pro Ala Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala Ala
115

Claims (42)

1.一种具有针对钙粘蛋白-17的特异性的抗体，包括与选自SEQ ID NO:9-12、17-28的氨基酸序列具有至少90％相似度的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体，包括与选自SEQ ID NO:9-12、17-28的氨基酸序列具有至少95％相似度的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体，其中单克隆抗体为小鼠抗体、人源化抗体或人抗体。
4.根据权利要求1所述的抗体，其中单克隆抗体是通过噬菌体库筛选分离的人抗体。
5.根据权利要求1所述的抗体，包括轻链的可变区(VL)、重链的可变区(VH)，其中所述VL包括与选自SEQ ID NO:10、12的氨基酸序列具有至少90％相似度的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的抗体，其中所述VH包括与选自SEQ ID NO:9、11的氨基酸序列具有至少90％相似度的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的抗体，进一步包括缀合的细胞毒性部分。
8.根据权利要求7所述的抗体，其中所述缀合的细胞毒性部分包括伊立替康、奥瑞斯他汀、PBD、美登素、鹅膏蕈碱、剪接体抑制剂或者其组合。
9.根据权利要求7所述的抗体，其中所述缀合的细胞毒性部分包括化学治疗剂。
10.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体为双特异性抗体。
11.根据权利要求10所述的抗体，具有针对来自细胞毒性T或NK细胞的细胞受体的特异性。
12.根据权利要求11所述的抗体，其中所述抗体为具有针对钙粘蛋白-17和CD3两者的特异性的双特异性抗体。
13.根据权利要求11所述的抗体，其中所述细胞受体包括：4-1BB、OX40、CD27、CD40、TIM-1、CD28、HVEM、GITR、ICOS、IL12受体，IL14受体，或者其衍生物或组合。
14.根据权利要求11所述的抗体，包括具有针对钙粘蛋白-17的特异性的第一单链可变片段(ScFv)和具有针对CD3的特异性的第二单链可变片段(ScFv)，其中所述第一ScFv包括第一VH和第一VL，所述第二ScFv包括第二VH和第二VL。
15.根据权利要求14所述的抗体，其中所述第一VH包括选自SEQ ID NO:9、11的氨基酸序列。
16.根据权利要求14所述的抗体，其中所述第一VL包括选自SEQ ID NO:10、12的氨基酸序列。
17.根据权利要求14所述的抗体，其中所述第二VH包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列的对应部分。
18.根据权利要求14所述的抗体，其中所述第二VL包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列的对应部分。
19.根据权利要求10所述的抗体，具有针对免疫检查点抑制剂的特异性。
20.根据权利要求19所述的抗体，其中所述检查点抑制剂包括PD-1、TIM-3、LAG-3、TIGIT、CTLA-4、PD-L1、BTLA、VISTA或其组合。
21.根据权利要求10所述的抗体，具有针对血管生成因子的特异性。
22.根据权利要求21所述的抗体，其中所述血管生成因子包括VEGF。
23.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体配置为拮抗钙粘蛋白-17结构域6中RGD位点与整联蛋白的结合。
24.根据权利要求23所述的抗体，其中所述整联蛋白包括α2β1。
25.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。
26.一种具有针对钙粘蛋白-17的特异性的scFv或Fab，包括与选自SEQ ID NO:9-12、17-28的氨基酸序列具有至少90％相似度的氨基酸序列。
27.根据权利要求26所述的scFv或Fab，具有针对来自细胞毒性T或NK细胞的细胞受体的特异性。
28.根据权利要求26所述的scFv或Fab，具有针对免疫检查点抑制剂的特异性。
29.根据权利要求26所述的scFv或Fab，具有针对血管生成因子的特异性。
30.一种具有针对钙粘蛋白-17的特异性的T或NK细胞，其中所述T或NK细胞包括嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包括与选自SEQ ID NO:9-12、17-28的氨基酸序列具有至少90％相似度的氨基酸序列。
31.根据权利要求30所述的T或NK细胞，其中所述嵌合抗原受体包括选自SEQ ID NO:9-12的氨基酸序列。
32.一种分离核酸，其对根据权利要求1至25所述的抗体、或者根据权利要求26至29所述的ScFv或Fab进行编码。
33.一种包括根据权利要求32所述的分离核酸的表达载体。
34.根据权利要求33所述的表达载体，其中所述载体可以在细胞中表达。
35.一种包括根据权利要求32所述的核酸的宿主细胞。
36.一种包括根据权利要求33所述的表达载体的宿主细胞。
37.根据权利要求36所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
38.一种药物组合物，包括根据权利要求1至25所述的抗体和细胞毒性剂。
39.根据权利要求38所述的药物组合物，其中所述细胞毒性剂包括顺铂、吉西他滨、伊立替康或抗肿瘤抗体。
40.包括根据权利要求1至25所述的抗体和药物学可接受的载体的药物组成物。
41.根据权利要求1-25所述的抗体或者根据权利要求30至31所述的T或NK细胞在制备用于治疗受试者癌症的药物中的用途。
42.根据权利要求41所述的用途，其中所述癌症为肝癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌或其组合。
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