CN113999308A

CN113999308A - 靶向钙粘蛋白17的纳米抗体及其应用

Info

Publication number: CN113999308A
Application number: CN202111648151.4A
Authority: CN
Inventors: 梁真; 李志杰; 徐小龙; 王继刚; 马静博; 徐承超
Original assignee: Shenzhen Peoples Hospital
Current assignee: Shenzhen Peoples Hospital
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2041-12-30
Also published as: CN113999308B

Abstract

本发明公开了一种靶向钙粘蛋白17的纳米抗体及其应用。靶向钙粘蛋白17的纳米抗体的氨基酸序列的互补决定区包括如SEQ ID NO:1所示的CDR1、如SEQ ID NO:2所示的CDR2、如SEQ ID NO:3所示的CDR3。结合说明书具体实施例部分的数据，Cell ELISA检测结果表明本发明的靶向钙粘蛋白17的纳米抗体与CDH17阳性细胞MKN45及IM95细胞有着较强的亲和力，biacore检测结果表明本发明的靶向钙粘蛋白17的纳米抗体与CDH17的结合KD=17.62 nM。由此可以看出，本发明的靶向钙粘蛋白17相对于传统的抗体具有更高的亲和力。

Description

靶向钙粘蛋白17的纳米抗体及其应用

技术领域

本发明涉及免疫学或分子生物学技术领域，尤其是涉及一种靶向钙粘蛋白17的纳米抗体及其应用。

背景技术

钙粘蛋白17（Cadherin 17, CDH17）也被称为肝肠钙粘蛋白（Liver intestine-cadherin, LI-cadherin），是一个具有独特结构和功能的钙粘蛋白超家族中的一员。经典钙粘蛋白家族成员中的E，N和P钙粘蛋白（E, N, P-Cadherins）均含有五个重复的蛋白序列构成细胞外段和一个由150-160个氨基酸构成的胞浆内段。然而，CDH17由七个钙粘蛋白重复序列构成细胞外段，细胞内段则仅由24个氨基酸构成，并且这24个氨基酸构成的胞浆段与经典的钙粘蛋白家族蛋白缺乏同源性。CDH17的组织分布展现一定程度的种属差异。在大鼠中，肝脏和小肠表达一定量的CDH17，这也是CDH17 被称为肝肠钙粘蛋白的原因[6]。而小鼠的CDH17则仅限于胃和小肠，而且表达量有限。人的结肠，小肠和胰腺被发现表达一定量的CDH17，其余正常组织以及正常的肝和胃组织几乎检测不到CDH17的表达。功能上，与经典钙粘蛋白类似，CDH17可介导钙离子依赖性的细胞间的粘附，但这一功能并不通过细胞内连环蛋白（Catenin）和细胞骨架来实现，后二者是经典钙粘蛋白介导细胞间粘附的关键机制。近来的研究显示，CDH17主要通过与α2β1整合素（α2β1 integrin）相互作用来调节细胞的粘附。CDH17 也参与多肽的转运以及胚胎时期消化道的发育。

近年来，全球不同的研究机构已经证实，在消化系统的肿瘤如胃癌、大肠癌、胰腺癌及部分肝癌中，CDH17在相当比例的上述癌症组织呈现高表达水平；特别是腺癌中尤其明显。而且高表达CDH17分子的原发癌继发转移后，转移灶中肿瘤组织依然保持高水平表达CDH17，这些结果提示CDH17有极大潜力作为消化系统恶性肿瘤（包括大肠癌）以及转移瘤的治疗新靶点。基于TCGA数据的分析，揭示几乎100%的大肠癌组织表达CDH17基因，且高于相应正常肠道组织，而且正常其他脏器均处于极低的表达水平；由于CDH17可以在转移瘤中保持高表达，这使得 CDH17在相关肿瘤特别是消化系统肿瘤中成为一个潜在治疗靶点。

噬菌体展示筛选技术是一种高通量快速鉴定与特定靶标分子结合的多肽或者抗体片段的方法。应用常规的分子生物技术，可以将大容量的多肽或者蛋白/抗体片段基因构建到噬菌体基因组中，利用噬菌体基因表型与蛋白表型的直接对应关系，从而将基因对应的多肽、蛋白/抗体片段表达在噬菌体外壳蛋白上。研究者可以在较短的时间内通过几轮的结合-漂洗-洗脱-扩增的生物筛选，得到和既定靶标分子的结合多肽、蛋白或者抗体片段。因此，如果研究者使用各种疾病的靶点蛋白作为研究对象，将纯化的蛋白包被在固体介质（譬如ELISA板中），筛选噬菌体多肽或者抗体文库，经过三到四轮的筛选，就可以得到与这一靶标蛋白特异结合的多肽或者抗体，而这些得到的多肽或者抗体1）可以作为载体，标记造影剂对疾病做分子图像诊断；2）可以与各种各样的化学药物、生物药（细胞因子、蛋白、免疫毒素）等偶联，对疾病做靶向治疗，降低药物使用量和副作用；3）某些多肽或者抗体，本身就具有激动或拮抗靶标蛋白功能的作用。目前为止，已有大量的通过噬菌体筛选鉴定的多肽或者抗体进入临床或者临床前试验阶段，被用于各种疾病的治疗或者作为载体进行靶向分子诊断和靶向治疗。

单域抗体（Single-domain antibody，sdAb）是一类仅由重链构成的抗体，是在驼类和软骨鱼类中天然存在的一种抗体形式。与传统抗体相比，单域抗体缺乏CH1结构域以及轻链；其功能仅仅依靠重链可变区来识别抗原。去除Fc段的单域抗体也称为纳米抗体，其晶体宽为2.5nm，长4nm，分子量仅为传统完整抗体的1/10（约15kDa），但依然具有完整的抗原识别能力。由于纳米抗体与人类抗体的VH的序列存在高度相似性，所以其作为治疗性抗体对人体并不具有很强的免疫原性。纳米抗体由于较小的分子量，其具有易于使用原核系统表达纯化，强的组织穿透性，并且展示较好的溶解度和对一定范围pH和温度的稳定性。同时纳米抗体易于通过基因工程进行修饰和改造或者进行各种化学标记，可以在较短时间内产生功能性抗体制剂。

目前，现有技术中心尚未有靶向钙粘蛋白17的纳米抗体的报导，而传统的抗体的亲和力比纳米抗体差。

发明内容

基于此，有必要提供一种亲和力更高的靶向钙粘蛋白17的纳米抗体。

此外，还有必要提供一种靶向钙粘蛋白17的纳米抗体的应用。

一种靶向钙粘蛋白17的纳米抗体，所述靶向钙粘蛋白17的纳米抗体的氨基酸序列的互补决定区包括如SEQ ID NO:1所示的CDR1、如SEQ ID NO:2所示的CDR2、如SEQ ID NO:3所示的CDR3。

在一个实施例中，所述靶向钙粘蛋白17的纳米抗体的氨基酸序列的框架区包括SEQ ID NO:4所示的FR1、如SEQ ID NO:5所示的FR2、如SEQ ID NO:6所示的FR3以及如SEQID NO:7所示的FR4。

在一个实施例中，所述靶向钙粘蛋白17的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

一种核酸，包括编码上述的靶向钙粘蛋白17的纳米抗体的核酸序列或其互补序列。

一种表达载体，包括上述的核酸。

一种宿主细胞，包括上述的表达载体。

在一个实施例中，所述宿主细胞为大肠杆菌。

一种上述的靶向钙粘蛋白17的纳米抗体在制备靶向钙粘蛋白17的检测试剂、活体成像探针、嵌和抗原受体修饰的细胞治疗产品或治疗性抗体中的应用。

结合说明书具体实施例部分的数据，Cell ELISA检测结果表明本发明的靶向钙粘蛋白17的纳米抗体与CDH17阳性细胞MKN45及IM95细胞有着较强的亲和力，biacore检测结果表明本发明的靶向钙粘蛋白17的纳米抗体与CDH17的结合KD=17.62 nM。

由此可以看出，本发明的靶向钙粘蛋白17相对于传统的抗体具有更高的亲和力。

附图说明

图1A为胃癌细胞表面的CDH17蛋白表达的免疫荧光照片。

图1B为胃癌细胞、结肠癌细胞、肝癌细胞和胰腺癌细胞中CDH17蛋白表达的免疫组化分析图，其中，score 0为免疫组化评分0； score 1为免疫组化评分1；score 2为免疫组化评分2；score 3为免疫组化评分3。

图2A为CDH17蛋白结构域示意图，其中，KDa为分子量单位千道尔顿。

图2B为CDH17蛋白细胞外段1~3 结构域表达纯化后电泳考马斯亮蓝染色图，其中，KDa为分子量单位千道尔顿。

图2C为CDH17纳米抗体文库筛选图，其中，pfu为噬斑形成单位；1st round为第一轮扩增；2nd round为第二轮扩增；3rd round为第三轮扩增。

图3A为前十条高频纳米抗体分布情况，其中，seq1-seq10为计数排名前十的序列编号。

图3B为前十条纳米抗体以及对照纳米抗体的表达纯化图，其中，M为蛋白分子量标准；control为用作对照的纳米抗体。

图3C为表达纯化的纳米抗体的初步ELISA验证实验结果图，其中，hCDH17为人源钙粘蛋白17；OD450 Value为酶联免疫反应底物反应后后在450纳米波长光波的吸收值；pM为物质量浓度单位，皮摩尔每升。

图4为Nb193号纳米抗体进行了表达纯化的检测图，其中，从右至左依次为Nb193号纳米抗体SDS-PAGE、HA-tag和His-tag的western-blot检测，control nanobody为对照用纳米抗体；Nb193 nanobody为筛选出的CDH17编号为193的纳米抗体；α-HA-Tag为用抗HA标签蛋白抗体孵育；α-His -Tag为用抗His标签抗体孵育。

图5A为Nb193与CDH17的结合的ELISA检测图，其中，Control9 Nb为对照纳米抗体；OD450 Value为酶联免疫反应底物反应后后在450纳米波长光波的吸收值；pM为物质量浓度单位，皮摩尔每升。

图5B为Nb193与IM95和MKN45细胞的结合的Cell ELISA检测图，其中，IM95为胃癌IM95细胞系；MKN45为胃癌MKN45细胞系；nM为纳摩尔每升；control nanobody为对照纳米抗体；Nb193 Nanobody为编号为193的CDH17蛋白纳米抗体。

图5C为Nb193与IM95和MKN45细胞的结合的细胞免疫荧光检测图，其中，IM95为胃癌IM95细胞系；MKN45为胃癌MKN45细胞系；Nb193为编号为193的CDH17蛋白纳米抗体。

图5D为MKN45原位移植瘤切片Nb193纳米抗体免疫荧光染色照片，其中，DAPI为4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色，用于染细胞的细胞核； Nb193为编号为193的CDH17蛋白纳米抗体染色；Merge为通道叠加信号；Magnified为图像局部放大。

图5E为Nb193纳米抗体与CDH17蛋白的亲和力的Biacore检测图，其中，KD为平衡解离常数；ka为结合常数；kd为解离常数。

图6A为敲降CDH17的MKN45细胞中Nb193的染色分布的免疫荧光照片，其中，DAPI为4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色，用于染细胞的细胞核；CDH17为钙粘蛋白17免疫荧光染色；Nb193为编号为193的CDH17蛋白纳米抗体染色；Merge为通道叠加信号；shNC为CDH17基因敲降对照细胞；shCDH17#1为敲降靶序列编号1的CDH17敲降细胞；shCDH17#2为敲降靶序列编号2的CDH17敲降细胞；shCDH17#3为敲降靶序列编号3的CDH17敲降细胞。

图6B为敲降CDH17的MKN45细胞中CDH17的蛋白表达水平的Western-blot检测图，其中，shNC为CDH17基因敲降对照细胞；shCDH17#1为敲降靶序列编号1的CDH17敲降细胞；shCDH17#2为敲降靶序列编号2的CDH17敲降细胞；shCDH17#3为敲降靶序列编号3的CDH17敲降细胞；CDH17为钙粘蛋白17免疫印迹；GAPDH为内参基因GAPDH的蛋白免疫印迹。

图6C为敲降CDH17的MKN45细胞中Nb193与MKN45细胞的亲和力的Cell ELISA检测图，其中，shNC为CDH17基因敲降对照细胞；shCDH17#1为敲降靶序列编号1的CDH17敲降细胞；shCDH17#2为敲降靶序列编号2的CDH17敲降细胞；shCDH17#3为敲降靶序列编号3的CDH17敲降细胞；CDH17 antibody为CDH17商品化抗体免疫荧光染色；nM为纳摩尔每升。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步地描述。

本发明公开了一实施方式的靶向钙粘蛋白17的纳米抗体，靶向钙粘蛋白17的纳米抗体的氨基酸序列的互补决定区包括如SEQ ID NO:1所示的CDR1、如SEQ ID NO:2所示的CDR2、如SEQ ID NO:3所示的CDR3。

优选的，靶向钙粘蛋白17的纳米抗体的氨基酸序列的框架区包括SEQ ID NO:4所示的FR1、如SEQ ID NO:5所示的FR2、如SEQ ID NO:6所示的FR3以及如SEQ ID NO:7所示的FR4。

本发明中，依次连接的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4组成了靶向钙粘蛋白17的纳米抗体的氨基酸序列。

具体来说，本发明的靶向钙粘蛋白17的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

本发明还公开了一实施方式的核酸，其包括编码上述的靶向钙粘蛋白17的纳米抗体的核酸或其互补序列。

本发明还公开了一实施方式表达载体，包括上述的核酸。

本发明还公开了一实施方式宿主细胞，包括上述的表达载体。

一般来说，宿主细胞可以为大肠杆菌。

本发明还公开了一实施方式的上述的靶向钙粘蛋白17的纳米抗体在制备靶向钙粘蛋白17的检测试剂、活体成像探针、嵌和抗原受体修饰的细胞治疗产品或治疗性抗体中的应用。

以下为具体实施例。

需要指出的是，实施例中未特别说明的材料、设备和方法，均采用本领域常规选择。

实施例1癌细胞CDH17的表达情况

复苏AGS和IM95细胞，传代3次后将细胞接种在24孔板中用于后续实验。具体步骤如下：

a)，将细胞置于冰上，用PBS洗涤3次，4％多聚甲醛固定10分钟；

b)，用PBS洗涤3次，4％驴血清封闭1小时；

c)，用封闭液按1：100稀释CDH17抗体，与细胞共孵育1小时；

d)，预冷PBS洗涤3次，用封闭液按1：1000稀释Alexa 488偶联的二抗，与细胞共孵育1小时；

e)，预冷PBS洗涤3次，用含DAPI的封片剂封片，荧光倒置显微镜检测CDH17蛋白的表达情况，得到图1A和图1B。

由图1A可以看出，免疫荧光检测到IM95胃癌细胞表面的CDH17高表达；由图1B可以看出，利用免疫组化证明胃癌、结肠癌、肝癌和胰腺癌中CDH17均呈现高表达状态。

实施例2 CDH17蛋白胞外结构域纳米抗体的筛选及验证

1）CDH17结构域表达纯化

参考图2A，根据CDH17的胞外结构，设计并合成CDH17蛋白1~3结构域基因并表达纯化蛋白用于纳米抗体筛选。

表达纯化步骤如下：

a)，为防止形成包涵体和蛋白降解，拟通过不同浓度的IPTG在16℃低温进行诱导条件摸索；

b)，根据预实验诱导条件进行大量诱导表达，高压破菌仪工作条件1000 W进行破菌；

c)，17000 g，4℃离心30 min，取上清与Ni填料4℃共孵育1小时；

d)，Ni柱纯化后进行分子筛分离，AKTA参数设置0.5 mL流速/分钟，每1 mL收集一次；

e)，根据电泳结果确定目的蛋白纯度，BCA法测定蛋白浓度，检测结果如图2B所示。

结合图2A，CDH17 1~3结构域蛋白大小约 40 kD，较适合作为纳米抗体筛选的靶蛋白。密码子优化后合成CDH17 1-3D基因进行大肠杆菌诱导表达纯化，为了避免蛋白降解和包涵体的产生，我们用0.2 mM的IPTG在16℃低温过夜进行诱导，最后通过Ni柱和分子筛纯化。

结合图2B，我们得到了高纯度的目的蛋白用于后续纳米抗体筛选。

2）纳米抗体筛选

采用免疫管法对天然的羊驼源噬菌体展示纳米抗体文库进行筛选，所选择的噬菌体展示库容量为2×10⁹。

筛选步骤如下：

a)，将目的蛋白按50 μg/mL浓度包被在免疫管上，进行3轮富集筛选；

b)，使用第三轮噬菌体洗脱液对文库编码抗体的基因进行扩增，进行深度测序，检测结果如图2C所示。

包被CDH17 1-3结构域进行三轮天然羊驼纳米抗体文库的筛选，三轮筛选后，噬菌体滴度显示文库被高度富集。

结合图2C，提示有与CDH17结合的纳米抗体被扩增。

实施例3 纳米抗体文库的深度测序

在纳米抗体噬菌体展示技术通过噬菌体ELISA筛选克隆的基础上，通过深度测序可以挖掘到更多具有潜在结合能力的克隆。

深度测序具体步骤如下：

a), 将三轮富集筛选出的噬菌体提取基因组，通过PCR对纳米抗体序列进行扩增富集建立文库；

b), 通过高通量测序分析文库中富集的序列；

c), 将测序的序列比对到用于噬菌体展示的纳米抗体序列文库，对序列的富集程度进行分析排序。

通过深度测序技术，我们得到了21兆左右的纳米抗体序列数据，具体如下表1所示。

表1：深度测序鉴定筛选的纳米抗体序列

由表1可以看出，特异性的纳米抗体序列有1.8兆数据。

经过对上述数据进行通过排序，我们筛选出富集程度最高的10条。参考图3A，其中seq1到seq10对应对应号纳米抗体号分别为Nb2，Nb5，Nb8，Nb59，Nb112，Nb16，Nb535，Nb289，Nb193，Nb332。

进一步分别表达纯化这十条纳米抗体以及对照纳米抗体，结合图3B，除Nb16未获得蛋白外，其余均获得高纯度重组蛋白。

使用纯化所得纳米抗体，进行ELISA初步验证，结合图3C，发现Nb2，Nb5，Nb535，Nb289，Nb193，Nb332均显示与CDH17结合。

序列比对发现Nb193具有特异的互补决定区（CDR）并具有较好的蛋白获取效率以及稳定性，被进一步进行后续验证分析。

接下来将针对Nb193纳米抗体进行进一步的纯化表达、亲和力检测和特异性检测。

需要指出的是，Nb193纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

具体来说，Nb193纳米抗体的互补决定区包括如SEQ ID NO:1所示的CDR1、如SEQID NO:2所示的CDR2、如SEQ ID NO:3所示的CDR3，Nb193抗体的框架区包括SEQ ID NO:4所示的FR1、如SEQ ID NO:5所示的FR2、如SEQ ID NO:6所示的FR3以及如SEQ ID NO:7所示的FR4。

上述依次连接的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4组成了Nb193纳米抗体的氨基酸序列。

实施例4 Nb193纳米抗体的纯化表达

将Nb193纳米抗体基因序列克隆入PET-14B载体，同时融合表达血凝素标签（hemagglutinin HA tag）用于后续检测。

表达纯化步骤如下：

a)，为防止形成包涵体和蛋白降解，使用0.2mM浓度的IPTG在16℃低温进行诱导；

c)，17000 g，4℃离心30 min，取上清与Ni填料4℃共孵育1小时；

d)，Ni柱纯化后进行分子筛分离，AKTA参数设置0.5 mL流速/分钟，每1 mL收集一次。

通过原核表达纯化对Nb193号纳米抗体进行了表达纯化，并通过HA-tag和His-tag的抗体进行western-blot鉴定。

结合图4，SDS-PAGE表明193号纳米抗体大小约为15 kDa，纯化的193号纳米抗体带HA-tag和His-tag。

实施例5 Nb193纳米抗体的亲和力检测

表面等离子共振实验（surface plasmon resonance，SPR）

此实验用来验证在体外表达纯化的纳米抗体与体外纯化的抗原蛋白直接相互作用，并计算二者的平衡常数。纯化抗原蛋白被固定在芯片上，不同浓度的纳米抗体被被顺序加入来分析与抗原蛋白的亲和力，记录360秒内的反应信号，制作动力学曲线，计算各相关参数。

结合图5A，通过ELISA检测了193号纳米抗体与CDH17的1-3 domain的结合，结果表明Nb193相对于对照抗体与CDH17有着较强的亲和。

结合图5B，Cell ELISA检测结果表明Nb193与CDH17阳性细胞MKN45及IM95细胞有着较强的亲和力。

结合图5C，纳米抗体免疫荧光结果表明Nb193主要结合在细胞膜表面。

结合图5D，组织切片结果表明，Nb193主要结合在MKN45细胞原位移植瘤组织的肿瘤细胞膜表面。

结合图5E，进一步的biacore检测结果表明Nb193与CDH17的结合KD=17.62 nM。

实施例6 Nb193纳米抗体特异性检测

1）纳米抗体对细胞的靶向性检测

复苏CDH17阳性的MKN45和IM95细胞，传代3次后将细胞接种在96孔板中用于后续实验。

具体步骤如下：

b)，用PBS洗涤3次，4％驴血清封闭1小时；

c)，用封闭液将纳米抗体依次稀释为不同浓度梯度（0~125nM），与细胞共孵育1小时；

d)，预冷PBS洗涤3次，用封闭液按1：100稀释anti-HA一抗，与细胞共孵育1小时；

e)，预冷PBS洗涤3次，用封闭液按1：1000稀释Alexa 488偶联的二抗，与细胞共孵育1小时；

f)，预冷PBS洗涤3次，用全自动电泳荧光免疫分析仪检测细胞表面纳米抗体的结合情况。

2）193号纳米抗体的组织染色

取CDH17阳性细胞MKN45建立的胃原位肿瘤进行OCT包埋冰冻切片进行后续实验，具体步骤如下：

a), 用丙酮固定冰冻切片5分钟；

b), TBS缓冲液洗2次, 4％驴血清封闭1小时；

c), 用封闭液将纳米抗体稀释至1μM浓度与组织切片共孵育1小时；

d), TBS洗3次，用封闭液按1：1000稀释Alexa 488偶联的二抗，与组织共孵育1小时；

e), TBS洗3次，用含DAPI的封片剂封片，用激光共聚焦显微镜观察纳米抗体在组织切片上的荧光分布。

3）CDH17纳米抗体敲降MKN45细胞系的建立

为了说明193号纳米抗体的特异性，需要建立CDH17敲降的MKN45细胞系进行后续实验。

稳定细胞系建立的具体步骤如下：

a), 设计3条CDH17的shRNA表达序列构建慢病毒载体；

b), 在293T细胞中包装慢病毒，并测定病毒滴度；

c), 慢病毒感染MKN45细胞48h后用嘌呤霉素进行筛选；

d),Western-blot检测CDH17蛋白表达，检测其敲降情况；

e), 检测193号纳米抗体与CDH17敲降细胞的结合能力。

为了进一步说明Nb193纳米抗体靶向CDH17的特异性，建立了CDH17敲降的MKN45细胞系，通过细胞免疫荧光检测CDH17的表达和Nb193的荧光分布。

结合图6A，结果表明敲降CDH17，细胞表面CDH17和Nb193的荧光同时减弱。

结合图6B，通过western-blot检测到CDH17蛋白被成功敲降。

结合图6C，Cell ELISA结果表明敲降CDH17的细胞Nb193的结合强度也相应减弱。

以上数据表明，Nb193号纳米抗体可以与CDH17特异性结合。

以上所述实施方式仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 深圳市人民医院

<120> 靶向钙粘蛋白17的纳米抗体及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Ser Thr Leu Glu Arg Tyr Ala

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Arg Gly Gly Asn Ile Asn

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Gly Ser Arg Phe Gly Tyr

1 5

<210> 4

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser

20 25

<210> 5

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Val Tyr Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala

1 5 10 15

Gly Ile

<210> 6

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Tyr Ala

1 5 10 15

Lys Asn Thr Leu Ile Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala

35

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 8

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Thr Leu Glu Arg

20 25 30

Tyr Ala Val Tyr Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu

35 40 45

Val Ala Gly Ile Met Arg Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Tyr Ala Lys Asn Thr Leu Ile

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Ala Gly Gly Ser Arg Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

Claims

1.一种靶向钙粘蛋白17的纳米抗体，其特征在于，所述靶向钙粘蛋白17的纳米抗体的氨基酸序列的互补决定区包括如SEQ ID NO:1所示的CDR1、如SEQ ID NO:2所示的CDR2、如SEQ ID NO:3所示的CDR3。

2.根据权利要求1所述的靶向钙粘蛋白17的纳米抗体，其特征在于，所述靶向钙粘蛋白17的纳米抗体的氨基酸序列的框架区包括SEQ ID NO:4所示的FR1、如SEQ ID NO:5所示的FR2、如SEQ ID NO:6所示的FR3以及如SEQ ID NO:7所示的FR4。

3.根据权利要求2所述的靶向钙粘蛋白17的纳米抗体，其特征在于，所述靶向钙粘蛋白17的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

4.一种核酸，其特征在于，包括编码如权利要求1~3中任意一项所述的靶向钙粘蛋白17的纳米抗体的核酸序列或其互补序列。

5.一种表达载体，其特征在于，包括如权利要求4所述的核酸。

6.一种宿主细胞，其特征在于，包括如权利要求5所述的表达载体。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。

8.一种权利要求1~3任意一项所述的靶向钙粘蛋白17的纳米抗体在制备靶向钙粘蛋白17的检测试剂、活体成像探针、嵌和抗原受体修饰的细胞治疗产品或治疗性抗体中的应用。