CN113796542A - 海参卵黄蛋白在制备缓解结肠炎的功能性食品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种海参卵黄蛋白在制备缓解结肠炎的功能性食品中的应用，属于功能食品技术领域。基于海参蛋白肽对结肠炎的缓解作用，进一步分离纯化海参卵黄蛋白，结合临床病理特征和炎症因子水平变化等方面进一步考察了卵黄蛋白对结肠炎小鼠的缓解作用。实验结果表明，海参卵黄蛋白可显著改善结肠组织结构，促进抗炎因子的分泌，尤其是IL4和IL‑10，IL‑10分泌量增加了33.4％，因此海参卵黄蛋白可以作为良好缓解结肠炎的功能性食品。

Description

海参卵黄蛋白在制备缓解结肠炎的功能性食品中的应用

技术领域

本发明涉及一种海参卵黄蛋白在制备缓解结肠炎的功能性食品中的应用，属于功能食品技术领域。

背景技术

结肠炎是一种病因尚未明确的发生在结肠和回肠末端的非特异性炎症性病变，以腹痛，腹泻，粘液，脓血便为主要临床表现。该病在欧洲，北美等发达国家发病率和死亡率较高，近年来随着我国国民生活质量的提升，结肠炎的发病率呈现逐年升高的趋势。其临床病程漫长，易反复发作，并具有潜在的癌变风险，严重影响着病人的生活质量。目前对该疾病的治疗方法主要有水杨酸类制剂，类固醇激素和免疫抑制剂等用于缓解炎症，虽有一定的疗效，但长期服用存在损伤胃黏膜，紊乱激素调控等副作用，另外停药后还存在反复发作等缺点。因此寻找有效且副作用小的功能性食品类物质成为缓解结肠炎临床研究的重点。

发明内容

【技术问题】

本发明实际要解决的技术问题是：分析海参中主要发挥抗炎活性的成分，并提供一种能够有效缓解或辅助改善结肠炎且副作用小的抗炎活性食品。

【技术方案】

为了解决上述问题，本发明提供海参主成分的分离方法，并基于三大主成分对DSS诱导的结肠炎的小鼠进行干预，通过临床评价分析海参中主要发挥抗炎活性的主成份。基于海参蛋白肽具有缓解结肠炎的功能，进一步探究卵黄蛋白在干预溃疡性结肠炎的功能性食品中的应用，本发明通过采用三步沉淀法提取海参体壁的卵黄蛋白对DSS诱导的结肠炎小鼠进行治疗，通过临床病症评价，分析海参卵黄蛋白可以改善结肠组织病理学，降低血清中的促炎因子和升高血清中的抗炎因子，进而发挥抗炎作用。

本发明的第一个目的是提供一种海参卵黄蛋白在制备缓解或辅助改善结肠炎的功能性食品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，海参卵黄蛋白的剂量为100-300mg/kg。

优选地为荣成好当家海参。

本发明的第二个目的是提供一种海参卵黄蛋白在制备缓解或辅助改善结肠炎的药物中的应用。

在本发明的一种实施方式中，海参卵黄蛋白的剂量为50-300mg/kg。

在本发明的一种实施方式中，所述海参卵黄蛋白是采用三步沉淀法提取得到的，包括以下步骤：步骤1)海参体壁预处理；步骤2)蛋白粗提取；步骤3)三氯乙酸和丙酮混合沉淀；步骤4)用Sevage试剂除去非糖蛋白；步骤5)硫酸铵沉淀蛋白；步骤6)透析除盐；步骤7)冷冻干燥。

本发明的第四个目的是提供一种具有缓解或改善肠道炎症的组合物，所述组合物包括海参卵黄蛋白、羟丙基甲基纤维素、木糖醇、蔗糖和环糊精。

在本发明的一种实施方式中，所述海参卵黄蛋白、羟丙基甲基纤维素、木糖醇、蔗糖和环糊精的质量比为2：2：2：5：2。

在本发明的一种实施方式中，所述组合物为食品或药物。

在本发明的一种实施方式中，所述的药物或食品的剂型为医学上认可的任意一种，包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、脂质体纳米粒、缓释剂、分散片或者肠溶颗粒。

本发明的第五个目的是提供一种肠溶颗粒，配方为卵黄蛋白10g、羟丙基甲基纤维素10g、木糖醇10g、蔗糖25g、环糊精10g，经造粒干燥制备得到缓释肠溶颗粒。该肠溶颗粒对于缓解或改善肠道炎症具有较好的效果。

本发明的有益效果：

本发明采用葡聚糖硫酸钠诱导结肠炎小鼠模型，从粪便性状，粪便潜血和结肠病理结构等方面考察海参主成分对模型小鼠的影响。实验结果表明，相比于模型组，海参蛋白肽组和海参多糖组可显著改善结肠炎症状、减轻炎性反应、促进结肠粘膜的修复，尤其是海参卵黄蛋白组，效果更佳明显可以筛选出海参中主要的抗炎活性成分。

基于海参蛋白肽对结肠炎的缓解作用，进一步分离纯化海参卵黄蛋白，结合临床病理特征和炎症因子水平变化等方面进一步考察了卵黄蛋白对结肠炎小鼠的缓解作用。实验结果表明，海参卵黄蛋白可显著改善结肠组织结构，促进抗炎因子的分泌，尤其是IL4和IL-10，IL-10分泌量增加了33.4％，因此海参卵黄蛋白可以作为良好缓解结肠炎的功能性食品。

附图说明

图1为海参主成分提取的工艺流程图；

图2为海参主成分缓解葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎小鼠体重变化；

图3实施例2中小鼠粪便和潜血评分结果；

图4实施例2中小鼠食用海参主成分结肠组织中HE染色结果；

图5为海参卵黄蛋白缓解葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎小鼠体重变化；

图6实施例1中小鼠粪便和潜血评分结果(*表示与模型组相比差异极显著，p<0.05；**表示与模型组相比差异极显著，p<0.05)；

图7小鼠结肠组织中HE染色结果。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。

本发明用到的海参卵黄蛋白是参照公开号为CN 112480226 A的专利中的三步沉淀法提取的海参，蛋白的纯度均在83％以上。

实施例1：海参主成分的分离制备

海参中次主成分提取部分的制备流程如图1所示，具体制备方法如下：称取200mg的冷冻干燥的海参原料，用3倍体积的90％乙醇浸泡过夜，离心得到上清液，采用真空旋转蒸发仪浓缩冻干，得到海参醇提物。同时收集残留物，在通风橱中将乙醇挥发，将醇提残渣分别用模拟胃消化液酶解1h(料液比1：20，加酶量)，后经胰蛋白酶酶解(料液比，加酶量)酶解2小时，离心(5000g/min，15min)收集上清液，加入3倍体积的乙醇，后离心，收集沉淀即为海参粗多糖。将除去上清液浓缩至一定浓度后冻干，即为海参蛋白肽。

海参多糖和海参蛋白肽是海参体壁中的主要组成成分，具有较高的提取率。而海参醇提物中主要是海参中脂类物质，在海参中相对于多糖和蛋白，其含量较低。海参中的蛋白质和多糖一般以聚合体的形式存在，因此在分离中我们采用胃蛋白酶和胰蛋白酶双酶解的方式进行2次酶解，才可将蛋白和多糖进行有效分离。

表1海参主成分的基本化学组成

实施例2：海参主成分对DSS诱导的结肠炎的缓解作用

以不同剂量的实施例1制备得到的海参主成分为原料进行动物实验：

利用3.0％葡聚糖硫酸钠自由饮水造模，将90只小鼠平均分成9组，每组10只小鼠，分别为对照组，模型组，阳性美沙拉嗪组，海参全粉组(100mg/kg海参全粉)，海参醇提物组(100mg/kg海参醇提物)，低剂量海参多糖组(100mg/kg海参多糖)，高剂量海参多糖组(300mg/kg海参多糖)，低剂量海参蛋白肽组(100mg/kg海参蛋白肽)，和高剂量海参蛋白肽(300mg/kg海参蛋白肽)，所有小鼠均经过3天适应性喂养，从第4天开始对其进行相应灌胃生理盐水，美沙拉嗪或者相应的海参主成分，除对照组外，其他所有组从第8天开始均通过自由饮用3.0％DSS进行造模。每2天称取小鼠的体重，测量相关指标，在造模后的第8天处死小鼠，取小鼠的结肠远端部位，用4％中性甲醛固定，石蜡包埋，后进行组织切片，取一部分进行HE染色，光镜下对其进行分析。

实验方法：在动物实验期间，每隔1天就称量小鼠的体重，绘制体重变化曲线，每日计算小鼠的体重变化，另外收集小鼠的粪便，对粪便性状和粪便潜血进行测定，在解剖后测定小鼠的结肠长度，HE组织切片，粘膜厚度以及采用ELISA对小鼠血清中的抗炎因子(IL-4和IL-10)以及促炎因子(IL-6，IFN-γ，TNF-α和TGF-β)进行测定分析。

实验结果：空白组的小鼠体重基本保持恒定，而添加DSS后的小鼠体重均下降，但是海参全粉组和海参醇提物组的体重下降较明显，说明海参醇提物和海全粉组无法缓解结肠炎；而海参多糖和海参蛋白肽组的下降较缓慢，间接表明海参多糖和海参蛋白具有缓解结肠炎的潜力。对临床评分而言，海参多糖和海参蛋白肽以及阳性组美沙拉嗪组的评分较低，同样证明海参多糖和海参蛋白肽可以减轻结肠炎患病程度。灌胃低剂量和高剂量海参多糖结肠长度分别是5.4cm和5.0cm，而分别灌胃低剂量和高剂量的海参蛋白肽时5.0cm和5.4cm，而模型组的结肠长度仅为4.7cm，这些结果均可证明海参蛋白和多糖均可缓解结肠炎症状，尤其是海参蛋白肽随添加量的增加而增加。从HE组织切片同样可以看出海参蛋白肽组的上皮结构较完整，而且炎症细胞浸润较少。总之，从临床病理特征来看，高剂量的海参蛋白肽和低剂量的海参多糖均具有缓解结肠炎的潜力。

海参主成分促进抗炎因子的分泌抑制促炎因子水平

实验方法：在动物实验结束时采用小鼠眼眶采血置于1.5mL Ep管中，静止2小时，4℃3000g离心10min，取上清液。利用ELISA试剂盒(上海酶联免疫)，测定血清中IL-4和IL-10的含量。

表2各组小鼠抗炎因子的比较

实验结果：海参主成分处理的DSS诱导小鼠，其血清中抗炎因子IL-4和IL-10较DSS小鼠高，各组之间存在统计学差异，尤其是中高剂量海参蛋白肽，效果更明显。

实验显示高剂量海参蛋白肽和低剂量多糖能够有效促进抗炎因子IL-10的分泌，进而发挥抗炎反应。

海参主成分促进DSS诱导结肠炎小鼠中促炎因子的分泌

实验方法：在动物实验结束时采用小鼠眼眶采血置于1.5mL Ep管中，静止2小时，4℃3000g离心10min，取上清液。利用ELISA试剂盒(上海酶联免疫)，测定血清中IL-6，IFN-γ，TNF-α和TGF-β的含量。

表3各组小鼠促炎因子的比较

实验结果：海参主成分处理的DSS诱导小鼠，其血清中促炎因子IL-6，IFN-γ，TNF-α和TGF-β较DSS模型组小鼠低，各组之间存在统计学差异，尤其是中高剂量海参蛋白肽组，效果更明显。

实验显示高剂量海参蛋白肽和低剂量多糖能够有效降低促炎因子IL-6，IFN-γ，TNF-α和TGF-β的分泌，进而发挥抗炎反应。

实施例3：海参卵黄蛋白的制备方法

参照公开号为CN 112480226 A的专利中的方法制备海参卵黄蛋白，包括以下步骤：

步骤1)海参体壁预处理：将新鲜海参解剖去除体腔内容物，洗净沥干水分，经匀浆机搅碎，得到海参泥；

步骤2)蛋白粗提取：将步骤(1)得到的海参泥与PBS缓冲液按1：3-5g/mL进行混合，0-10℃浸提12-20h，之后离心，离心后所得的蛋白上清液即为蛋白粗体液，此过程重复2-3次，并合并上清液；

步骤3)三氯乙酸和丙酮混合沉淀：将步骤2)得到的混合上清液在50-70℃下进行浓缩，浓缩至原体积的1/3-1/5，将所得浓缩液边搅拌边加入三氯乙酸，使得三氯乙酸的终浓度为10％-15％，同时加入浓缩液1-1.5倍体积的丙酮，搅拌均匀后，0-10℃静置3-5h，离心后收集沉淀，此过程重复2～3次，合并沉淀物；

步骤4)用Sevage试剂除去非糖蛋白：将步骤3)得到的沉淀物复溶于8-10倍体积的PBS缓冲液，调pH至7.2-7.4，所得溶液采用Sevage试剂除去杂蛋白，得到海参体壁主要卵黄蛋白；

步骤5)将步骤4)得到的海参体壁主要卵黄蛋白边搅拌边加入硫酸铵沉淀目标蛋白，使得硫酸铵的终浓度为30％-40％，4-10℃条件下，磁力搅拌器中震荡30-50min，再经离心后，收集所得沉淀；

步骤6)透析除盐：将步骤5)所得沉淀中加入3-5倍体积的PBS缓冲液中复溶，对盐溶液进行透析除盐，透析袋选用分子量为8000-10000Da，透析时间24-36h，即得主要卵黄蛋白溶液；

步骤7)冷冻干燥：将步骤6)中所得的主要卵黄蛋白溶液进行冷冻干燥，得到主要卵黄蛋白干粉。

制备得到的海参卵黄蛋白纯度为83％，分子量为2.0×10⁶Da。

实施例4：海参卵黄蛋白在缓解DSS诱导的小鼠结肠炎方面的应用

以不同剂量的实施例3制备得到的海参卵黄蛋白为原料进行动物实验：

利用3.0％葡聚糖硫酸钠自由饮水造模，将70只小鼠平均分成7组，每组10只小鼠，分别为对照组，营养组(100mg/kg海参卵黄蛋白)，模型组，阳性美沙拉嗪组，低剂量海参卵黄蛋白组(50mg/kg海参卵黄蛋白)，中剂量海参卵黄蛋白组(100mg/kg海参卵黄蛋白)和高剂量海参卵黄蛋白组(300mg/kg海参卵黄蛋白)，所有小鼠均经过3天适应性喂养，从第4天开始对其进行相应灌胃生理盐水，美沙拉嗪或者海参卵黄蛋白，除对照组和营养组外，其他所有组均通过自由饮用3.0％DSS进行造模。每2天称取小鼠的体重，测量相关指标，在造模后的第7天处死小鼠，取小鼠的结肠远端部位，用4％中性甲醛固定，石蜡包埋，后进行组织切片，取一部分进行HE染色，光镜下对其进行分析。

实验方法：在动物实验期间，每隔1天就称量小鼠的体重，绘制体重变化曲线，每日计算小鼠的体重变化，另外收集小鼠的粪便，对粪便性状和粪便潜血进行测定，在解剖后测定小鼠的结肠长度，HE组织切片，粘膜厚度以及采用ELISA对小鼠血清中的抗炎因子(IL-4和IL-10)以及促炎因子(IL-6，IFN-γ，TNF-α和TGF-β)进行测定分析。

实验结果：在未进行造模前，小鼠灌胃海参卵黄蛋白时，小鼠的体重显著增加，在进行DSS造模后，灌胃海参卵黄蛋白的小鼠体重下降最少，间接反映海参卵黄蛋白能够减轻DSS诱导的小鼠结肠炎的患病程度。另外高剂量小鼠的粪便性状和便血评分较低，说明海参卵黄蛋白能缓解小鼠结肠炎的临床疾病性状，而模型组的小鼠评分接近4.0，说明小鼠潜血严重，粪便稀疏，粪便的含水量显著增加。灌胃海参卵黄蛋白的小鼠结肠长度(7.12cm)长于DSS诱导的结肠炎小鼠(5.93cm)，说明海参缓解了DSS诱导的结肠炎导致结肠缩短的临床症状。另外不同剂量的卵黄蛋白对小鼠结肠的抑制作用也不同，在实验中发现高剂量的海参卵黄蛋白的缓解作用最好(结肠长度为6.95cm)，次之的是中剂量(6.40cm)和低剂量(6.04cm)。小鼠的肠粘膜损伤也是结肠炎的患病特征，从粘膜层厚度分析，发现空白组(79.4μm)和营养组(88.4μm)较模型组(55.3μm)有显著差异，另外当补充卵黄蛋白后，随补充量的增加，粘膜厚度增加，低中高剂量组分别为57.64μm、86.15μm、91.02μm。

海参卵黄蛋白促进DSS诱导结肠炎小鼠中抗炎因子的分泌

实验方法：在动物实验结束时采用小鼠眼眶采血置于1.5mL Ep管中，静止2小时，4℃3000g离心10min，取上清液。利用ELISA试剂盒(上海酶联免疫)，测定血清中IL-4和IL-10的含量。

表4各组小鼠抗炎因子的比较

实验结果：海参卵黄蛋白处理的DSS诱导小鼠，其血清中抗炎因子IL-4和IL-10较DSS小鼠高，各组之间存在统计学差异，尤其是中高剂量组，效果更明显。

实验显示海参卵黄蛋白能够有效促进抗炎因子的分泌，进而发挥抗炎反应。

改变步骤3)的沉淀试剂，验证其沉淀效果。沉淀试剂分别为添加三氯乙酸(TCA)至终浓度为10％、10％TCA+1倍体积丙酮、加1M盐酸调节pH为3.7、加1M盐酸调节pH为3.7+1倍体积丙酮、2倍体积丙酮。

表5各组小鼠促炎因子的比较

海参卵黄蛋白促进DSS诱导结肠炎小鼠中促炎因子的分泌

实验方法：在动物实验结束时采用小鼠眼眶采血置于1.5mL Ep管中，静止2小时，4℃3000g离心10min，取上清液。利用ELISA试剂盒(上海酶联免疫)，测定血清中IL-6，IFN-γ，TNF-α和TGF-β的含量。

实验结果：海参卵黄蛋白处理的DSS诱导小鼠，其血清中促炎因子IL-6，IFN-γ，TNF-α和TGF-β较DSS小鼠无显著性变化，说明海参卵黄蛋白不改变促炎因子的分泌。

实施例5：一种肠溶颗粒

一种肠溶颗粒，所述肠溶颗粒包括10g的海参卵黄蛋白、羟丙基甲基纤维素10g、25g木糖醇、25g蔗糖、10g环糊精加入68％乙醇用20目筛造粒，60℃干燥1.5小时，干燥后的整粒分装，即得海参卵黄蛋白肠溶颗粒。制备得到的肠溶颗粒具有缓解小鼠结肠炎功效。

对比例1：

对比Sigma公司获得鸡蛋来源的鸡蛋卵黄蛋白(货号：P1253)，在控制卵黄蛋白含量相同的情况下，进行动物实验，发现海参卵黄蛋白处理组的小鼠大便的性状、潜血情况转好，结肠更长，炎症因子浸润更少，促炎因子分泌的更少，抗炎因子分泌的更多，说明海参卵黄蛋白的抗肠炎效果更优于鸡蛋卵黄蛋白。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种海参卵黄蛋白在制备缓解或辅助改善结肠炎的功能性食品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，海参卵黄蛋白的剂量为100-300mg/kg。

3.一种海参卵黄蛋白在制备缓解或辅助改善结肠炎的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，海参卵黄蛋白的剂量为50-300mg/kg。

5.根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于，所述海参卵黄蛋白是采用三步沉淀法提取得到的，包括以下步骤：步骤1)海参体壁预处理；步骤2)蛋白粗提取；步骤3)三氯乙酸和丙酮混合沉淀；步骤4)用Sevage试剂除去非糖蛋白；步骤5)硫酸铵沉淀蛋白；步骤6)透析除盐；步骤7)冷冻干燥。

6.一种具有缓解或改善肠道炎症的组合物，其特征在于，所述组合物包括海参卵黄蛋白、羟丙基甲基纤维素、木糖醇、蔗糖和环糊精。

7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述海参卵黄蛋白、羟丙基甲基纤维素、木糖醇、蔗糖和环糊精的质量比为2：2：2：5：2。

8.根据权利要求6或7所述的组合物，其特征在于，所述组合物为食品或药物。

9.根据权利要求6-8任一项所述的组合物，其特征在于，所述的药物或食品的剂型为医学上认可的任意一种，包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、脂质体纳米粒、缓释剂、分散片或者肠溶颗粒。

10.一种肠溶颗粒，其特征在于，配方为卵黄蛋白10g、羟丙基甲基纤维素10g、木糖醇10g、蔗糖25g、环糊精10g，经造粒干燥制备得到缓释肠溶颗粒。

Images