CN113789409A - 樱花ssr分子标记引物及在145个樱花品种鉴定中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了樱花SSR分子标记引物及在145个樱花品种鉴定中的应用，本发明基于前期课题组对李属SSR引物的搜集，筛选出8对扩增条带清晰、稳定、重复性好的多态性引物，对145个品种进行鉴定，结果验证这8对引物组合能将其中的141个樱花品种进行区分鉴定，区分率达97.24％；另外还筛选出了最佳引物组合SG8+SG6+SG4，可以鉴定出127个樱花品种，区分率为87.59％；可见，本发明能够选用很少的引物组合对多个樱花品种，丰富了樱花品种分子标记鉴定的类型，由于选用的引物对少而鉴定的品种多，可以大大提高鉴定效率。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及樱花SSR分子标记引物及在145个樱花品种鉴定中的应用。
背景技术
樱花为蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus sensu lato)樱亚属植物(subgenusCerasus)的统称。樱花是世界著名观花乔木，盛开时繁花满树，末花时落英缤纷；作为经济价值较高的果木和高雅的园林花木，具有广阔的开发利用前景。近百年来，通过自然变异筛选和人工杂交培育出600多个樱花园艺品种。但是，由于许多品种间形态相似性较高、品种来源记载不详、同物异名与异物同名现象频发；且多数樱花先花后叶，花叶不同期，易于杂交，形态变异丰富多样，生活史长、花期相对较短，缺乏快速准确的鉴定方法(王贤荣，2014，Shi et al.，2013)。
近百年来，人们通过自然变异筛选和杂交培育的方式获得了600多个樱花园艺品种(袁冬明等，2018)。针对这些园艺品种，分类学家先后根据树形、花、果、叶、冬芽等形态特性提出三级、五级分类标准及花期、花色分类标准(时玉娣，2007，藤木俊雄，2009，张琼等，2012)。由于不同学者对形态性状的判断标准不一样，品种间性状交叉、重叠及在不同环境中具有很强的可塑性，造成形态学鉴定的困难，从而造成品种名混淆，同物异名、异物同名等现象时常发生。
植物品种遗传多样性主要通过遗传标记的多态性来反映，分子标记是以核酸的多态性为基础的遗传标记。其不受组织类别、发育时期、环境条件等干扰，具有数量极多、多态性高等优点，是理想的遗传标记。分子标记已广泛应用于种质资源研究、杂种鉴定、遗传图谱构建、目的基因定位、遗传多样性、亲缘关系研究以及标记辅助选择育种。其中，微卫星(mirosatellite)，即简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)，是由2-6个核甘酸串联重复片段构成的均匀分布于基因组中的简单重复序列；具有多态性高、稳定性好、多等位基因、共显性、数量丰富、基因组覆盖性好和操作简单等优点。已应用于中国李(Prunussalicina)、桃(Prunus persica)、黑果枸杞(Lycium ruthenicum)和枇杷(Eriobotryajaponica)等植物的亲缘关系、遗传多样性分析、品种指纹图谱绘制、品种鉴定和DNA指纹图谱构建等研究中。本研究组对樱花品种的鉴定工作不断推进，最开始对少量的24个樱花品种品种进行鉴定，采用两个分子标记引物可以将24个品种中的20个品种完全区分开，随着研究的深入，又利用SSR标记完成了常见的42种樱花品种遗传多样性的研究及相关品种的鉴定。随着园林应用中樱花品种的不断扩增，前期筛选出的SSR引物及部分组合，已无法满足大量樱花品种的区分鉴定。因此，本研究在李属SSR标记搜集的基础上，筛选出多态性较高的引物8对，对国内145种樱花品种进行遗传多样性研究，筛选最优的品种鉴定引物组合，并构建樱花品种SSR特征指纹，为樱花品种鉴定以及分子标记辅助育种提供重要依据。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种樱花SSR分子标记引物。
本发明的目的之二在于提供樱花SSR分子标记引物在樱花品种鉴定中的作用。
本发明目的之三在于提供一种鉴定樱花的试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
樱花SSR分子标记引物，所述分子标记引物包括如下8对，其正向引物和反向引物的核苷酸序列具体如下：
(1)SG1：正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；
(2)SG3：正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物序列如SEQ ID NO.4所示；
(3)SG4：正向引物序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物序列如SEQ ID NO.6所示；
(4)SG5：正向引物序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物序列如SEQ ID NO.8所示；
(5)SG6：正向引物序列如SEQ ID NO.9所示，反向引物序列如SEQ ID NO.10所示；
(6)SG7：正向引物序列如SEQ ID NO.11所示，反向引物序列如SEQ ID NO.12所示；
(7)SG8：正向引物序列如SEQ ID NO.13所示，反向引物序列如SEQ ID NO.14所示；
(8)SG9：正向引物序列如SEQ ID NO.15所示，反向引物序列如SEQ ID NO.16所示。
上述樱花SSR分子标记引物在樱花品种鉴定中的应用，本发明采用上述8对分子标记引物对145个樱花品种品种进行鉴定，所选用的樱花品种具体见表1，通过实验验证，本发明所选用的8对引物组合，除了P034河津樱与P100苔清水、P058江户彼岸P077奈良八重樱无法区分开外，能够将其余的141个樱花品种区完全分开。另外，还筛选出了最佳引物组合SG8+SG6+SG4，可以鉴定出127个樱花品种，区分率为87.59％，未能区分的分为8组，分别为P031与P037，P039与P092，P091与P096，P004、P038与P088，P032与P046，P008与P102，P022、P034与P100，P058与P077。
表1 145个樱花品种信息
一种鉴定樱花品种的试剂盒，包含所述的樱花SSR分子标记引物。
本发明的有益效果是：
本发明基于前期课题组对李属SSR引物的搜集，筛选出8对扩增条带清晰、稳定、重复性好的多态性引物，对145个品种进行鉴定，结果验证这8对引物组合能将其中的141个樱花品种进行区分鉴定，可见，本发明能够选用很少的引物组合就能鉴别出141个樱花品种，另外还筛选出了最佳引物组合SG8+SG6+SG4，可以鉴定出127个樱花品种，区分率为87.59％；丰富了樱花品种分子标记鉴定的类型，由于选用的引物对少而鉴定的品种多，可以大大提高鉴定效率。
附图说明
图1A、图1B、图1C是基于8对SSR标记构建的145个樱花品种聚类树状图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以通过商业途径获得。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
1材料与方法
1.1试验地和试验材料
试验地设于浙江省林业科学研究院樱花育种圃，北纬30°13′12″，东经120°01′11″。地属亚热带季风气候区，四季分明，年温适中，年平均气温15.9～17.0℃，极端最高气温39.8～42.9℃，极端最低气温-7.1～-15.0℃；光照充足，年平均日照时数1710～2100h；空气湿润，年平均相对湿度76％～81％；雨量充沛，年平均雨量在980～2000mm；无霜期199～328d。
于2015年12月，从福建省、贵州省、山东省、湖北省、上海市、云南省和浙江省7个省的樱花育种基地采集樱花品种种植于浙江省林业科学研究院樱花育种圃(见表1)。采集品种的DNA样品，分别将新鲜、无病害的幼嫩叶片置于装有硅胶的自封袋中迅速干燥，然后保存于-20℃冰柜中备用。
1.2DNA提取方法
利用Bioteke公司生产的快速植物基因组DNA提取试剂盒(型号DP3112)提取145份供试材料的基因组DNA，提取前利用缓冲液对样品进行预处理，以去除大量的多糖、色素等杂质。利用1％的琼脂糖凝胶电泳法检测DNA质量，用Nanodrop超微量分光光度计测定DNA浓度，并将其稀释到50ng·μL-1，置于-20℃冰箱中保存备用。
1.3SSR引物
基于前期课题组对李属SSR引物的搜集，最终筛选出8对扩增条带清晰、稳定、重复性好的多态性引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，SSR引物信息见表2。
表2 SSR引物信息
1.4PCR扩增
PCR扩增体系为25μL：50ng·μL-1 DNA模板2μL，2xTSINGKE Master MIX(blue)12.5μL(由北京擎科生物科技有限公司生产)，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，ddH2O 9.5μL。PCR反应在Applied Biosystem Veriti Thermal Cycler PCR(香港Gene Company Limited基因有限公司)仪器上进行，反应程序为：95℃5min；95℃45s，55～58℃45s，72℃45s，共35个循环；72℃7min；最后4℃保存。PCR扩增产物通过2％琼脂糖凝胶电泳筛选条带清晰的产物。
1.5毛细管电泳
将条带清晰稳定的PCR产物吸取1μL，通过Qsep100TM全自动核酸蛋白分析仪进行毛细管电泳检测。毛细管电泳所使用的卡匣为S1高分辨率卡夹，分子大小标准参照物为1KSize marker，两者均由广州吉源生物科技有限公司生产。
1.6数据分析
将全自动核酸蛋白分析仪输出的各品种峰值进行比较分析，得到片段大小，数据分析用GeneMarker 2.2.0软件。利用Covert软件将序列长短数据转换为基因型。计算SSR引物等位基因数(number of alleles，Na)，观察杂合度(observed heterozygosity，Ho)，Nei′s遗传多样性(Nei′s gene diversity，H)，Shannon′s信息指数(Shannon′sinformation index，I)和多态性信息含量(polymorphism information content，PIC)，统计分析用PopGene 32软件。利用MG软件将片段大小数值转化为0、1数据矩阵，利用Ntsys2.1软件计算各样品间的遗传相似系数(Coefficient)，并采用UPGMA法进行聚类。
2结果
2.1分子标记多态性分析
用NanoDrop超微量分光光度计和1.0％琼脂糖凝胶电泳对提取的DNA进行检测，145个樱花品种叶片提取物的A260/A280都介于1.8～2.0，A260/A230均大于2.0，DNA浓度范围在550ng·μL-1-950ng·μL-1，说明提取的DNA样品中蛋白质、色素、酚类物质等含量较低，DNA样品纯度较高，可满足后续检测需求。
利用筛选出的8对SSR引物分别对145个樱花品种的基因组DNA进行扩增及毛细管电泳，得出不同引物检测出15-41个多态性等位基因，平均每对引物可检测出28.75个多态性等位基因；有效等位基因为5.92-21.93，平均为12.04个。其中，引物SG5对所有品种扩增的多态性等位基因数和有效等位基因数最多，说明该引物更能反映不同品种的差异。8对引物的观察纯合度为0.04-0.48，观察杂合度为0.52-0.96，期望纯合度为0.04-0.17，期望杂合度为0.83-0.96。Shannon′s信息指数为2.08-3.34，平均为2.75；Nei′s遗传多样性指数为0.83-0.95。其中，引物SG5香农多样性指数和Nei′s遗传多样性均最高，引物SG1最低。
表3 8对SSR标记在145种樱花品种中的遗传信息
2.2基于SSR标记的樱花品种遗传关系分析
基于8对SSR引物扩增出的条带对145个樱花品种进行聚类，结果显示，当遗传相似系数为0.88时，145种樱花品种聚在一起；当遗传相似系数为0.883时，145个品种分为3组。其中，P034河津樱与P100苔清水、P058江户彼岸P077奈良八重樱遗传相似系数为1.00，现有引物无法将其分开，具体分组情况参见图1(图1A、图1B、图1C)，可见采用8对SSR引物可以将145个品种中的141个品种完全区分开。
2.3分子标记对樱花品种的区分度
8对SSR引物在145个樱花品种的相应位点上共检测出483个基因型。引物SG1检测出31种基因型，纯合型为8种；SG3检测出63种基因型，纯合型为13种；SG4检测出74种基因型，纯合型为10种；SG5检测出59种基因型，纯合型为5种；引物SG6检测出67种基因型，杂合型为56种；SG7检测出56种基因型，纯合型为9种；SG8检测出73种基因型，纯合型6种；SG9检测出60种基因型，杂合型为50种。
8对SSR引物可以区分的樱花品种从10-45个不等，平均为35.25个。其中，引物SG1区分的品种数量最少，区分率仅为6.90％，仅可区分八重红大岛、风车、高盆樱0218号、高盆樱0440号、华中樱0270号、毛叶山樱花0035号、欧洲酸樱桃0150号、雪妃、朱雀和紫婉10个品种。引物SG8区分率最高，为31.03％，可区分45个品种；其次为引物SG6和SG4，区分率分别为30.34％和29.66％，分别可区分44个和43个樱花品种。
表4分子标记对樱花品种的区分
2.4最佳引物组合的筛选
8对SSR引物可以鉴定出141个樱花品种，区分率达97.24％；其中，仅有P034河津樱与P100苔清水、P058江户彼岸P077奈良八重樱无法区分开。从8对引物中选取区分率最高的2对引物SG8和SG6进行组合，SG8+SG6组合可以鉴定出145个樱花品种中的99种，区分率可达68.28％，其中，P089市原虎尾未扩增出条带，未能区分开的45种樱花分为14个组。从8对引物中选取区分率最高的3对引物，SG8+SG6+SG4组合可以鉴定出127个樱花品种，区分率为87.59％。从8对引物中选取区分率最高的4对引物，SG8+SG6+SG4+SG5组合可以鉴定出127个樱花品种，区分率为87.59％，可见在SG8+SG6+SG4基础上继续增加SG5，鉴定的品种个数没有增加。继续增加引物数量，SG8+SG6+SG4+SG5+SG9组合可以鉴定出137种樱花，区分率为94.48％。
其中SG8+SG6+SG4组合可以鉴定出127个樱花品种为：P001、P002、P003、P005、P006、P007、P009、P010、P011、P012、P013、P014、P015、P016、P017、P018、P019、P020、P021、P023、P024、P025、P026、P027、P028、P029、P030、P033、P035、P036、P040、P041、P042、P043、P044、P045、P047、P048、P049、P050、P051、P052、P053、P054、P055、P056、P057、P059、P060、P061、P062、P063、P064、P065、P066、P067、P068、P069、P070、P071、P072、P073、P074、P075、P076、P078、P079、P080、P081、P082、P083、P084、P085、P086、P087、P089、P090、P093、P094、P095、P097、P098、P099、P101、P103、P104、P105、P106、P107、P108、P109、P110、P111、P112、P113、P114、P115、P116、P117、P118、P119、P120、P121、P122、P123、P124、P125、P126、P127、P128、P129、P130、P131、P132、P133、P134、P135、P136、P137、P138、P139、P140、P141、P142、P143、P144、P145；未能区分的分为8组，分别为P031与P037，P039与P092，P091与P096，P004、P038与P088，P032与P046，P008与P102，P022、P034与P100，P058与P077。
综合考虑引物组合的数量及区分率，选择3对引物SG8、SG6和SG4作为樱花品种SSR特征指纹的应用组合。基于SG8+SG6+SG4组合和每个品种对应的基因型，将(引物_基因型/引物_基因型/引物_基因型)组合作为樱花品种的SSR特征指纹，具体参加表5，这些特征指纹将为樱花品种的鉴定提供独特的指纹标识。
表5 145个樱花品种的SSR特征指纹(引物_基因型)
注：“..”表示未扩增出条带
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江省林业科学研究院
<120> 樱花SSR分子标记引物及在145个樱花品种鉴定中的应用
<130> 2021
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Prunus sensu lato
<400> 1
tggctggtgg agacggagga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Prunus sensu lato
<400> 2
atgataccca gcctcccggg 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Prunus sensu lato
<400> 3
gccaccaatg gttcttcc 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Prunus sensu lato
<400> 4
agcaccagat gcacctga 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Prunus sensu lato
<400> 5
gtgcatcgtt aggaactgcc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Prunus sensu lato
<400> 6
gcccctgaga tacaactgca 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Prunus sensu lato
<400> 7
aagccataaa ctcagcactc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Prunus sensu lato
<400> 8
ccaaaaacca aaaccaaagg 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Prunus sensu lato
<400> 9
cactgtctcc caggttaaac t 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Prunus sensu lato
<400> 10
cctgagcttt tgacacatgc 20
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Prunus sensu lato
<400> 11
gcaattcgag ctgtatttca gatg 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Prunus sensu lato
<400> 12
cagttggcgg ctatcatgtc ttac 24
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Prunus sensu lato
<400> 13
ctggcttaca actcgcaagc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Prunus sensu lato
<400> 14
cgtcgaccaa ctgagactca 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Prunus sensu lato
<400> 15
gtaacgctcg ctaccacaaa 20
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> Prunus sensu lato
<400> 16
cctgcatatc accacccag 19
Claims (5)
1.樱花SSR分子标记引物，其特征在于，所述分子标记引物包括如下8对，其正向引物和反向引物的核苷酸序列具体如下：
(1)SG1：正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；
(2)SG3：正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物序列如SEQ ID NO.4所示；
(3)SG4：正向引物序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物序列如SEQ ID NO.6所示；
(4)SG5：正向引物序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物序列如SEQ ID NO.8所示；
(5)SG6：正向引物序列如SEQ ID NO.9所示，反向引物序列如SEQ ID NO.10所示；
(6)SG7：正向引物序列如SEQ ID NO.11所示，反向引物序列如SEQ ID NO.12所示；
(7)SG8：正向引物序列如SEQ ID NO.13所示，反向引物序列如SEQ ID NO.14所示；
(8)SG9：正向引物序列如SEQ ID NO.15所示，反向引物序列如SEQ ID NO.16所示。
2.如权利要求1所述的樱花SSR分子标记引物在樱花品种鉴定中的应用，所述品种包括如下141种：
3.樱花SSR分子标记引物，其特征在于，所述分子标记引物包括如下3对，SG8+SG6+SG4，其正向引物和反向引物的核苷酸序列具体如下：
(1)SG4：正向引物序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物序列如SEQ ID NO.6所示；
(2)SG6：正向引物序列如SEQ ID NO.9所示，反向引物序列如SEQ ID NO.10所示；
(3)SG8：正向引物序列如SEQ ID NO.13所示，反向引物序列如SEQ ID NO.14所示。
4.如权利要求3所述的樱花SSR分子标记引物在樱花品种鉴定中的应用，所述品种包括如下127种：
5.一种鉴定樱花品种的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或3所述的樱花SSR分子标记引物。
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