CN113786421A - 一种具有抗炎活性的虎耳草提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有抗炎活性的虎耳草提取物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有抗炎活性的虎耳草提取物及其制备方法和应用，所述制备方法包括：S1：分别采用不同的提取方法提取虎耳草鲜草、虎耳草干草，以得到提取物；S2：比较不同提取方法得到的所述虎耳草鲜草提取物、虎耳草干草提取物中的总黄酮、总酚酸的含量差异；S3：将所述虎耳草鲜草提取物、虎耳草干草提取物中活性成分进行定性分析；S4：建立炎症模型分别加入互作的所述虎耳草鲜草提取物、虎耳草干草提取物，以验证所述虎耳草鲜草提取物、虎耳草干草提取物的效果。该方法解决了现有技术中虎耳草的鲜草和干草使用受限的技术问题。

Description

一种具有抗炎活性的虎耳草提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及虎耳草提取领域，具体地，涉及一种具有抗炎活性的虎耳草提取物及其制备方法和应用。
背景技术
侵害性细菌病原体入侵细胞后，释放大量的毒力因子，促使细胞炎性因子升高，最终侵害细胞，过去，细菌感染的治疗主要是使用抗生素，由于抗生素滥用导致菌体产生耐药性，加上，近期抗生素的禁用，将抑菌抗炎的新的思路引向中药。
中草药作为天然产物，其功效多重性、低毒性、无耐药性、无药物残留、绿色环保优势日益显著，另外约23％的中草药是以鲜药为主使用。通过近几十年来的研究表明，在体外筛选出来的对细菌有良好的杀灭效果的中药在体内无法发挥其抑菌活性，然而一些在体外无杀菌活性的中药，在体内却表现出良好的杀菌效果，很有可能是中药通过降级病原微生物分泌的毒素所导致促炎因子表达受到抑制从而达到杀菌效果。
虎耳草的活性成分主要为黄酮类、萜类、酚酸类以及香豆素类化合物，鲜草和干草之间的活性成分不同导致药效也不同，同时由于虎耳草鲜草活性成分不稳定，无法阐明其物质基础，并且由于耳草鲜草储存保鲜、加工运输成本较高，限制了虎耳草资源的开发利用。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抗炎活性的虎耳草提取物及其制备方法和应用，以解决现有技术中虎耳草的鲜草和干草使用受限的技术问题。
为了实现上述目的，本发明提供了一种具有抗炎活性的虎耳草提取物的制备方法，所述制备方法包括
S1：分别采用不同的提取方法提取虎耳草鲜草、虎耳草干草，以得到提取物；
S2：比较不同提取方法得到的所述虎耳草鲜草提取物、虎耳草干草提取物中的总黄酮、总酚酸的含量差异；
S3：将所述虎耳草鲜草提取物、虎耳草干草提取物中活性成分进行定性分析；
S4：建立炎症模型分别加入互作的所述虎耳草鲜草提取物、虎耳草干草提取物，以验证所述虎耳草鲜草提取物、虎耳草干草提取物的效果。
本发明还提供了一种具有抗炎活性的虎耳草提取物，所述具有抗炎活性的虎耳草提取物通过上述的制备方法制备而得。
本发明进一步提供了一种如上述的具有抗炎活性的虎耳草提取物在减轻炎症损伤和降低炎症因子方法的应用。
在上述技术方案中，本发明首先通过不同的提取方法提取虎耳草鲜草、虎耳草干草，以得到提取物；接着分析各提取物中总黄酮、总酚酸的含量差异，并且定性分析各提取物的活性成分；最后，通过炎症模型验证各提取物的抗炎效果。
由此，通过提取、分析和验证的步骤综合地了解虎耳草鲜草、虎耳草干草，为虎耳草的开发奠定了理论基础，为临床开发虎耳草类中草药的应用提供了依据，为未来研发治疗细菌感染以及降低炎性因子的药物提供了新的方案。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明提供的制备方法的流程图；
图2a为虎耳草干草、虎耳草鲜草的实物图；
图2b为本发明提供的制备方法的操作示意图；
图2c为本发明提供的提取物在干燥前的外观图；
图3a为本发明提供的提取物在显微镜下的表征图；
图3b为本发明提供的提取物在扫描电镜下的表征图；
图3c为本发明提供的提取物在透射电镜下的表征图；
图4a为本发明提供的虎耳草干草、虎耳草鲜草的总黄酮和总酚酸的含量检测结果图；
图4b为本发明提供的虎耳草各提取物的含量检测结果图；
图5a为水煎干草提取物和水煎鲜草提取物的细胞毒性的检测结果图；
图5b为水煎干草提取物+LPS、水煎鲜草提取物+LPS的细胞毒性的检测结果图；
图5c为水煎干草提取物、水煎鲜草提取物的降低IL-1β的释放的检测结果图；
图5d为水煎干草提取物、水煎鲜草提取物的降低IL-6的释放的检测结果图；
图5e为水煎干草提取物、水煎鲜草提取物的降低TNF-α的释放的检测结果图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种具有抗炎活性的虎耳草提取物的制备方法，如图1所示，所述制备方法包括
S1：分别采用不同的提取方法提取虎耳草鲜草、虎耳草干草，以得到提取物；
S2：比较不同提取方法得到的所述虎耳草鲜草提取物、虎耳草干草提取物中的总黄酮、总酚酸的含量差异；
S3：将所述虎耳草鲜草提取物、虎耳草干草提取物中活性成分进行定性分析；
S4：建立炎症模型分别加入互作的所述虎耳草鲜草提取物、虎耳草干草提取物，以验证所述虎耳草鲜草提取物、虎耳草干草提取物的效果。
在上述制备方法中，对所述提取方法的具体方式不作限定，但是为了进一步地了解各提取方式对提取物的成分和性能的影响，优选地，在S1中，所述提取方法依次包括提取处理、烘干至恒重；其中，所述提取处理选自水煎、水提或醇提。
在上述制备方法中，对所述水煎的步骤和条件不作限定，但是为了进一步提高提取率和保证提取物中有效成分的稳定，优选地，所述水煎包括：将水没过待煎样品，浸泡25-40min，武火煮沸，文火煎煮25-40min，过滤取滤液；其中，当待煎样品为虎耳草鲜草时，虎耳草鲜草与水的重量比为1：5-6；当待煎样品为虎耳草干草时，虎耳草干草与水的重量比为1：10-15；所述武火的温度为170-190℃，所述文火的温度为90-110℃。
在上述制备方法中，对所述水提的步骤和条件不作限定，但是为了进一步提高提取率和保证提取物中有效成分的稳定，优选地，所述水提包括：将待水提样品、水混合，然后进行超声处理；其中，所述待水提样品、水的重量比为1：10-15；所述超声处理至少满足以下条件：温度为25-40℃，时间为1-2h，超声波频率为30-50KHz。
在上述制备方法中，对所述醇提的步骤和条件不作限定，但是为了进一步提高提取率和保证提取物中有效成分的稳定，优选地，所述醇提包括：将待水提样品、醇混合，然后进行超声处理；其中，所述待水提样品、醇的重量比为1：10-15；所述超声处理至少满足以下条件：温度为25-40℃，时间为1-2h，超声波频率为30-50KHz。
在上述醇提中，所述醇的具体种类可以在宽泛的范围内选择，但是为了进一步提高提取率和保证提取物中有效成分的稳定，所述醇选自乙醇、甲醇中的至少一种。
在上述制备方法中，为了规避自身含水对所述虎耳草鲜草、虎耳草干草的提取的影响，优选地，在步骤S1之前，所述制备方法还包括：检测所述虎耳草鲜草、虎耳草干草中的含水量。其中，虎耳草鲜草含水量＝(虎耳草鲜草鲜重-虎耳草鲜草干重)/虎耳草鲜草鲜重*100％；虎耳草干草含水量＝(去水前虎耳草干草重量-去水后虎耳草干草重量)/去水前虎耳草干草重量*100％。
在本发明中，所述总黄酮、总酚酸的含量的检测方法也可以采用多种方式进行，但是为了进一步提高检测的准确性，优选地，在步骤S2中，所述总黄酮、总酚酸的含量的检测采用紫外分光光度法；其中，使用的标准品包括芦丁标准品、没食子酸标准品，所采用的吸光度为505-515nm。
在本发明中，所述活性成分的定性分析方法也可以采用多种方式进行，但是为了进一步提高检测的准确性，优选地，在步骤S3中，所述活性成分的定性分析采用红外光谱分析法FTIR、液相色谱-飞行时间质谱法LC-Q-TOF、液相色谱-质谱联用法LC-MS进行；
其中，所述FTIR的检测条件为：核磁频率为400M，核磁管直径为5mm，测试温度为296.0K；测试条件为：H谱定性、TD：65K、RG：32、D1：1s、SW：20ppm、O1p：6.175ppm、NS：16、DS：2。
所述LC-Q-TOF的检测条件如表1所示，进样量：1微升，扫描模式：正，扫描范围：MS50-2000，离子源：Dual AJS ESI。干燥气温度320℃，干燥气流速10L/min，鞘气温度为350℃，鞘气流速为11L/min，参比离子：121.05087、922.0098。扫描模式为负时，参比离子：112.9856、1033.9881，其他条件与扫描模式为正时相同。
表1
Figure BDA0003319339430000061
Figure BDA0003319339430000071
所述LC-MS的检测条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18；2.1*100mm，1.7μm，流动相：A：0.1％甲酸水溶液，B：乙腈；进样量5μL，流速0.4ml/min，柱温：35℃，离子源：ESI，流动相梯度如下表2所示。
表2
A/％ B％
0.00 98 2
1.00 98 2
2.00 10 90
8.00 10 90
8.50 98 2
10.00 98 2
此外，在本发明中，建立炎症模型的方法也可以在宽泛的范围内选择，但是为了进一步提高检测的准确性，优选地，确定LPS的细胞毒性，建立炎症模型包括：加入互作的上述提取物，之后确定加入不同提取物后的细胞毒性，细胞毒素药物互作模型中的加药浓度。
在上述实施方式中，各提取物的加药浓度也可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高各提取物的抗炎作用，优选地，水煎虎耳草鲜草提取物、水煎虎耳草干草提取物的加药浓度不小于20μg/mL。
本发明还提供了一种具有抗炎活性的虎耳草提取物，所述具有抗炎活性的虎耳草提取物通过上述的制备方法制备而得。
本发明进一步提供了一种如上述的具有抗炎活性的虎耳草提取物在减轻炎症损伤和降低炎症因子方法的应用。
以下将通过实例对本发明进行详细描述。在以下实例中，计算虎耳草鲜草、干草的含水量的方法如下：
取新鲜的虎耳草全草3份(如图2a所示)，分别称重记为w1；洗净除去杂质，沥干，切成1cm小段，干燥至恒重，分别得虎耳草干草重量w2。
取干燥的虎耳草全草3份(如图2a所示)，分别称重记为w3，切成小段后干燥至恒重，记为w4。
按以下公式计算含水量：虎耳草鲜草含水量＝(w1-w2)/w1*100％。新鲜虎耳草干燥前的重量分别为20.3g、20.25g、20.4g，干燥后分别得虎耳草干品1.86g、1.82g、1.88g。
虎耳草鲜草含水量＝(w3-w4)/w3*100％虎耳草干品干燥前的重量分别为9.87g、10.57g、10.8g，干燥后称重分别为8.58g、9.13g、9.26g。
经计算虎耳草鲜品的含水量为90.87％，虎耳草干品的含水量为13.65％；由此可知，计算虎耳草含水量之后，虎耳草干草40g相当于鲜草378g。
下述实例中文火和武火的温度指的是煎煮体系中的温度，而不是火焰的温度。
实施例1
水煎虎耳草鲜草提取物/水煎虎耳草干草提取物的制备：
取虎耳草干品50g或虎耳草鲜品378g(相当于虎耳草干品40g)，加蒸馏水至没过虎耳草，浸泡30min，武火煮沸转至文火煎煮30min，三重纱布过滤取滤液。其中，武火的温度为180℃，文火的温度为80℃；对虎耳草干品，水的用量为700mL；对虎耳草鲜品，水的用量为2000mL。
将上述步骤重复三次，合并滤液，蒸发浓缩至生药浓度为1g/mL，干燥至恒重，获得虎耳草干草、鲜草提取物，烘干，然后轻轻刮下。
虎耳草水煎鲜草与水煎干草在烘干至恒重后，对其进行刮取发现水煎鲜草组分为明显两层，上层较脆，易刮取，而下层则难刮取；水煎干草并未出现分层现象。
实施例2
水提虎耳草鲜草提取物的制备：取虎耳草干品粉末50g，加蒸馏水600mL，30℃超声波处理1h(超声波频率为40KHz)，过滤。将上述步骤重复三次，合并滤液，蒸发浓缩至生药浓度为1g/mL，干燥至恒重，获得虎耳草干草、鲜草提取物，烘干，然后轻轻刮下。
水提虎耳草干草提取物的制备：虎耳草鲜品洗净沥干，精密称取473g，粉碎，加水5676mL，30℃超声波处理1h(超声波频率为40KHz)，过滤。将上述步骤重复三次，合并滤液，蒸发浓缩至生药浓度为1g/mL，干燥至恒重，获得虎耳草干草、鲜草提取物，烘干，然后轻轻刮下。
实施例3
醇提虎耳草鲜草提取物的制备：取虎耳草干品粉末50g，加80重量％乙醇600mL，30℃超声波处理1h(超声波频率为40KHz)，过滤。将上述步骤重复三次，合并滤液，蒸发浓缩至生药浓度为1g/mL，干燥至恒重，获得虎耳草干草、鲜草提取物，烘干，然后轻轻刮下。
醇提虎耳草干草提取物的制备：虎耳草鲜品洗净沥干，精密称取473g，粉碎，加80重量％乙醇5676mL，30℃超声波处理1h(超声波频率为40KHz)，过滤。将上述步骤重复三次，合并滤液，蒸发浓缩至生药浓度为1g/mL，干燥至恒重，获得虎耳草干草、鲜草提取物，烘干，然后轻轻刮下。
检测例1
观察水煎虎耳草鲜草提取物、水煎虎耳草干草提取物、水提虎耳草鲜草提取物、水提虎耳草干草提取物、醇提虎耳草鲜草提取物、醇提虎耳草干草提取物的外观以及显微镜下的形貌。
通过肉眼观察得知：如图2c所示，在烘干之前，水煎虎耳草鲜草提取物、水煎虎耳草干草提取物均为红褐色，而醇提虎耳草鲜草提取物则为草绿色，醇提虎耳草干草提取物，水提虎耳草鲜草提取物、水提虎耳草干草提取物则接近透明。
通过显微镜观察得知：如图3a所示，水煎干草分为两层，上层为较大结晶样规则物质，下层有较多鸡蛋花样物质；水煎鲜草则为较多透明小结晶。醇提鲜草则有较大结晶样不规则物质聚集，醇提干草组则有较少透明鸡蛋花样。水提鲜草组为较多透明小结晶，水提干草组则为较多鸡蛋花样物质，无结晶样规则物质。
通过扫描电镜下放大500倍观察得知：如图3b所示，虎耳草水煎鲜草和水煎干草提取物表面存在许多孔洞，水煎干草孔洞光滑，水煎鲜草的孔洞中则有大量碎片状突起。醇提鲜草组表面平坦无孔洞，有较多不规则突起，醇提干草组表面由不规则突起组成，多呈菜花样。水提鲜草组表面较其他组光滑，表面连接较松散，偶有突起。水提干草组表面光滑无突起，并且表面碎裂，有规则缝隙。
通过透射电镜观察得知：如图3c所示，水煎鲜草组有较多规律条状物质存在，水煎干草组也有规律条状物质存在，与水煎鲜草组相比，水煎干草组的条状物质更粗，颜色更深。在醇提鲜草组中物质较多，分布均匀，还有较多分布均匀透明圆点状物质存在。在醇提干草中则存在较多均匀分布的黑色圆点状物质。和水煎组、醇提组相比，水提组颜色较浅，水提鲜草组内物质分布不均，有团块状物质出现；水提干草组则分布均匀，且彼此之间相互松散连接。
综上所述，通过显微镜、扫描电镜及透射电镜观察发现：虎耳草鲜草、干草不同提取方法的提取物之间的表观结构存在显著差异，水煎组提取物表面有孔洞存在，醇提组则为突起，水提组表面平整，其中水煎鲜草的空洞里有碎片样物质存在。醇提组粒子直径小于水煎组与水提组，且分布均匀，其中醇提鲜草组粒子直径最小。
检测例2
通过紫外分光分光光度法比较虎耳草干草、虎耳草鲜草、不同虎耳草干草提取物、虎耳草鲜草提取物中总黄酮、总酚酸的含量；用的吸光度为510nm，采用的标准品为芦丁标准品、没食子酸对照品，标准品溶液的浓度为2mg/mL。
通过红外光谱分析法(FTIR)、液相色谱-飞行时间质谱法(LC-Q-TOF)、液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)方法进行各提取物的活性成分定性分析。
FTIR的检测条件为：核磁频率为400M，核磁管直径为5mm，测试温度为296.0K；测试条件为：H谱定性、TD：65K、RG：32、D1：1s、SW：20ppm、O1p：6.175ppm、NS：16、DS：2。
LC-Q-TOF的检测条件如上述表1所示，进样量：1微升，扫描模式：正，扫描范围：MS50-2000，离子源：Dual AJS ESI。干燥气温度320℃，干燥气流速10L/min，鞘气温度为350℃，鞘气流速为11L/min，参比离子：121.05087、922.0098。扫描模式为负时，参比离子：112.9856、1033.9881，其他条件与扫描模式为正时相同。
LC-MS的检测条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18；2.1*100mm，1.7μm，流动相：A：0.1％甲酸水溶液，B：乙腈；进样量5μL，流速0.4ml/min，柱温：35℃，离子源：ESI，流动相梯度如上述表2所示。
精密称取取芦丁对照品10mg溶于甲醇，配制得芦丁标准品溶液0.2mg/mL。精密量取芦丁对照品溶液(0.2mg/mL)0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL、7.0mL分别置50mL量瓶中，加入甲醇至7mL，加5％亚硝酸钠溶液lmL，摇匀。放置6min，加入10重量％的硝酸铝溶液lmL，摇匀。放置6min，加入氢氧化钠溶液10mL，再加甲醇至刻度摇匀，放15min。
精密称取鲜品、干品的各提取物各1克，置50mL容量瓶中，加入相应溶剂将其溶解，加入甲醇至7mL，加5重量％亚硝酸钠溶液lmL，摇匀。放置6min，加入10重量％的硝酸铝溶液lmL，摇匀。放置6min，加入氢氧化钠溶液10mL，再加甲醇至刻度摇匀，放15min。在510nm波长处测定吸收度，每组重复三次。
精密称取没食子酸对照品10mg，加无水乙醇至刻度，摇匀即得，作为对照品溶液(0.2mg/mL)。精密量取对照品贮备液0mL，0.2mL，0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mL于25mL容量瓶中，加无水乙醇4mL，加2mL0.3重量％SDS，加2mL 1重量％FeCl3-0.5重量％铁氰化钾(1∶1)混合液，避光静置5min，加0.1mol/mL HCl至刻度，混匀，避光反应。20min后以66重量％乙醇加显色剂为参比液进行基线校正，于280nm测定吸光度。
精密称取鲜品、干品虎耳草提取物各1克，置25mL容量瓶中，加入相应溶剂将其溶解，加无水乙醇4mL，加2mL0.3％SDS，加2mL1重量％FeCl3-0.5重量％铁氰化钾(1∶1)混合液，避光静置5min，加0.1mol/mL HCl至刻度，混匀，避光反应放20min。在510nm波长处测定吸收度，每组重复三次。
通过对水煎虎耳草干草、水煎虎耳草鲜草提取物微谱分析，确定虎耳草干草、鲜草活性成分的差异以及各提取为的活性成分定性分析。
虎耳草干草、鲜草活性以及各提取物的总黄酮、总酚酸的含量的检测结果见图4a和图4b。
由图4a和图4b所示，虎耳草鲜草中黄酮类成分含量显著高于干草；醇提鲜草与水煎鲜草中总黄酮的含量远高于醇提干草与水煎干草；而水提组无显著差异，其原因是黄酮类成分不易溶于水。
由图4a和图4b所示，在虎耳草鲜品与干品中总酚酸的含量无显著差异，而水煎组总酚酸的含量低于醇提组与水提组，其主要原因是酚酸类成分加热后易变性。
各提取物中活性成分见表3所示。
表3
Figure BDA0003319339430000131
Figure BDA0003319339430000141
通过上表可知：
虎耳草鲜草中的黄酮类成分主要是：杨梅素、木犀草素、夏佛塔苷、异落新妇苷、山奈酚葡萄糖醛酸苷、无色天竺葵素、飞燕草素、矢车菊素-3-槐糖甙、柚皮素。
虎耳草鲜草中的酚酸类成分主要为：苹果酸、原儿茶酸、丁香酸、绿原酸、对香豆酰基奎宁酸、苯甲酸、咖啡酸乙酯、绿原酸甲酯、脯氨酰矢车菊素B23'-食子酸酯、6-姜烯酚。
虎耳草水煎鲜草活性成分含有：苹果酸、原儿茶酸、绿原酸、无色天竺葵素、飞燕草素-3,5-葡萄糖苷、异落新妇苷、脯氨酰矢车菊素B23'-没食子酸酯、对香豆酰基奎宁酸、夏佛塔苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、杨梅素-3'-O-B-D-葡萄糖苷、山奈酚葡萄糖醛酸苷、丁香酸、羟基木犀草素8-beta-D-吡喃葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、槐角苷、木犀草素、咖啡酸乙酯、飞燕草素-鼠李葡糖苷、泛酸、矢车菊素3-槐糖甙、二氢咖啡酸3-O-beta-D-葡糖苷酸、羟基香豆素、绿原酸甲酯、杨梅素、蜀葵甙元、飞燕草素-3-O-半乳糖苷、柚皮素、苯甲酸、飞燕草素、6-姜烯酚。
通过上述检测首次发现了虎耳草鲜草与虎耳草干草的活性成分的差异，对虎耳草鲜草的活性成分定性分析，用于验证虎耳草鲜草成分区别于虎耳草干草成分，可以为虎耳草鲜草和虎耳草干草在临床上效果不同提供理论依据。例如，通过虎耳草干草、鲜草提取物活性成分上的差异，解释虎耳草干草和鲜草在临床上效果不同的原因，该活性成分的差异更加有针对性的研究临床效果的机制。
检测例2
基于微血管内皮内皮细胞作为多种致病因子的效应细胞，是中药活性成分的效应靶细胞，这些都为建立细菌细胞药物互作模型的制备与应用奠定了夯实的基础。
细胞损伤模型：基于细菌侵入后释放大量的毒力因子，存在体内后会导致微循环功能障碍，进而诱导炎性因子的释放，进而造成炎症损伤，微血管内皮细胞是多种致病因子的效应细胞，是中药活性成分的靶细胞，LPS(脂多糖)诱导细胞的炎症损伤模型模拟感染的微生物环境，来构建毒素细胞互作模型。
培养箱的条件为：37℃、5体积％CO2。
炎症损伤修复模型构建：将传至稳定状态的细胞消化计数，调整密度，接种至96孔板，待细胞生长至70％-80％汇合状态时，弃去20％完全培养基，换成2％维持培养基过夜，弃去维持培养基，使用含药浓度为0μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL的LPS作用于细胞，其中药物作用时间分别为4h、6h、8h、10h、12h、24h。作用完成后，加入配置好的10μLWST-1溶液，避光培养2h，在450nm测其吸光度值，确定细胞毒性，模型建立完成。然后将确定过细胞毒性的药物，按照相应的浓度接种到细胞中，建立毒素药物细胞互作模型。其中，上述细胞为RPMVCES(大鼠肺微血管内皮细胞)，细胞的来源为大鼠肺微血管内皮原代培养；以下试验中使用的细胞也是该细胞。
采用药物毒素细胞共孵育的方法，为了进一步确定药物的细胞毒性。其方法为：将传至稳定状态的细胞消化计数，密度调整为1×105个/mL接种至96孔板，将细胞分为溶液空白对照组、水煎虎耳草鲜草组和水煎虎耳草干草组。待细胞生长至70％-80％汇合状态时，将培养基换成2重量％维持培养基过夜，使用含药浓度为1mg/mL、200μg/mL、20μg/mL、2μg/mL、0.2μg/mL的药物作用于细胞，药物作用时间为24h。作用完成后，加入配置好的10μLWST-1溶液，避光培养2h，在450nm测其吸光度值，确定细胞毒性。
通过用于检测毒素、药物的细胞毒性的WST法进一步为确定细胞毒素互作模型中毒素、药物的使用剂量，为后面互作后的作用展开研究。例如不同的浓度对细胞存在毒性，剂量的高低影响了细胞的存活率；进而不同浓度的变化对与建立细胞毒素互作模型是为了使模型更加安全稳定更具有一定的可行性。本发明可以通过确定细胞毒性，为建立更稳定的模型的细胞毒素互作模型奠定基础。
结果表明，水煎虎耳草鲜草提取物具有抗炎特性。如图5a所示，水煎干草在1000μg/mL时对细胞产生毒性，水煎鲜草在200μg/mL时对细胞产生毒性，选用0.2、2、20μg/mL作为加药浓度。
如图5b所示，LPS作用6h后，0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL和对照组相比细胞均有损伤，选用1μg/mLLPS作用6h来进行LPS诱导炎症模型的作用条件。水煎虎耳草鲜草提取物、水煎虎耳草干草提取物能改善LPS诱导的细胞损伤，抗炎特性呈浓度依赖性。
如图5c所示，LPS+0.2μg/ml，水煎虎耳草干草提取物能降低IL-1β的释放，LPS+2μg/ml、LPS+20μg/ml时，水煎虎耳草鲜草提取物、水煎虎耳草干草提取物能够显著降低IL-1β的释放。
如图5d所示，LPS+0.2μg/ml、LPS+2μg/ml时，IL-6的含量的表现升高，当用药浓度到20μg/mL时，水煎虎耳草鲜草提取物能显著降低IL-6的释放。
如图5e所示，LPS+0.2μg/ml、LPS+2μg/ml,水煎虎耳草鲜草提取物、水煎虎耳草干草提取物均能显著降低TNF-α的释放量，当浓度在20μg/mL时，水煎虎耳草鲜草提取物显著降低TNF-α的释放量；进一步说明了水煎虎耳草鲜草提取物的抗炎特性。
综上所述，水煎虎耳草鲜草提取物降低LPS对PRMVECs的损伤具有显著作用，同时筛选出浓度为1μg/mL的LPS，作用时间为6h时，对细胞有显著的细胞毒性，能显著促进TNF-α、IL-6、和IL-1β的分泌，成功构建LPS诱导细胞炎症损伤模型。当药物浓度在20μg/mL时，水煎虎耳草鲜草提取物能显著减轻LPS诱导的细胞损伤，能显著降低并能显著降低TNF-α、IL-6、和IL-1β的表达，从而减轻LPS诱导的细胞损伤，对细胞起到良好的保护作用。
最后，通过上述实施例和检测例得知：中药降低病原微生物所分泌的毒素导致细胞中促炎因子的表达，改善LPS诱导的细胞损伤，从而对细胞起到一定的保护作用。水煎虎耳草鲜草提取物，可以显著减低炎性因子的释放，降低LPS对细胞的损伤。该方法为筛选药物抗炎提供了新的思路，同时验证了中药在抑菌方面可能是通过降低细菌释放的毒素来减轻炎症因子的释放的方式抑菌，基于LPS诱导的细胞的细胞毒素药物互作模型，更加有利于抗炎药物的筛选，还可以通过不同浓度作用的效果来筛选药物。
水煎虎耳草鲜草提取物在抑菌抗炎方面优于水煎虎耳草干草提取物，为中草药鲜草的开发提供了新的思路和技术方案，还可以对其他细菌、毒素的作用进行研究，也可以扩展其他抑菌抗炎药物的研究，该发明也可以作为其他天然鲜草开发的技术路线。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种具有抗炎活性的虎耳草提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括
S1：分别采用不同的提取方法提取虎耳草鲜草、虎耳草干草，以得到提取物；
S2：比较不同提取方法得到的所述虎耳草鲜草提取物、虎耳草干草提取物中的总黄酮、总酚酸的含量差异；
S3：将所述虎耳草鲜草提取物、虎耳草干草提取物中活性成分进行定性分析；
S4：建立炎症模型分别加入互作的所述虎耳草鲜草提取物、虎耳草干草提取物，以验证所述虎耳草鲜草提取物、虎耳草干草提取物的效果。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在S1中，所述提取方法依次包括提取处理、烘干至恒重；
其中，所述提取处理选自水煎、水提或醇提。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述水煎包括：将水没过待煎样品，浸泡25-40min，武火煮沸，文火煎煮25-40min，过滤取滤液；
其中，当待煎样品为虎耳草鲜草时，虎耳草鲜草与水的重量比为1：5-6；当待煎样品为虎耳草干草时，虎耳草干草与水的重量比为1：10-15；所述武火的温度为170-190℃，所述文火的温度为80-110℃。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述水提包括：将待水提样品、水混合，然后进行超声处理；
其中，所述待水提样品、水的重量比为1：10-15；所述超声处理至少满足以下条件：温度为25-40℃，时间为1-2h，超声波频率为30-50KHz。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述醇提包括：将待水提样品、醇混合，然后进行超声处理；
其中，所述待水提样品、醇的重量比为1：10-15；所述超声处理至少满足以下条件：温度为25-40℃，时间为1-2h，超声波频率为30-50KHz；所述醇选自乙醇、甲醇中的至少一种。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1之前，所述制备方法还包括：检测所述虎耳草鲜草、虎耳草干草中的含水量。
7.根据权利要求1-5中任意一项所述的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述总黄酮、总酚酸的含量的检测采用紫外分光光度法；其中，使用的标准品包括芦丁标准品、没食子酸标准品，所采用的吸光度为505-515nm。
8.根据权利要求1-5中任意一项所述的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，所述活性成分的定性分析采用红外光谱分析法FTIR、液相色谱-飞行时间质谱法LC-Q-TOF、液相色谱-质谱联用法LC-MS进行；
其中，所述FTIR的检测条件为：核磁频率为400M，核磁管直径为5mm，测试温度为296.0K；测试条件为：H谱定性、TD：65K、RG：32、D1：1s、SW：20ppm、O1p：6.175ppm、NS：16、DS：2。
9.一种具有抗炎活性的虎耳草提取物，其特征在于，所述具有抗炎活性的虎耳草提取物通过权利要求1-8中任意一项所述的制备方法制备而得。
10.一种如权利要求9所述的具有抗炎活性的虎耳草提取物在减轻炎症损伤和降低炎症因子方法的应用。
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