CN1137725C - 长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒疫苗的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种预防鹦鹉幼雏病毒病弱毒疫苗的制备方法。其步骤是：将长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒液5～10%接种于鸡胚成纤维细胞；在37℃～39.5℃培养温度，收集48-72小时产生细胞病变的病毒液；采用0.9% N.S作为稀释液，按1∶10的比例稀释；进行杂菌检验，合格后分装冷藏。疫苗对鹦鹉的免疫保护性强，保护率99.62-100%、安全性好、保存期长、生产工艺简便，成本低；可有效的预防鹦鹉幼雏病毒病。
Description
技术领域：
本发明涉及一种预防鹦鹉幼雏病毒病弱毒疫苗的制备方法。
背景技术：
鹦鹉幼雏病(又称长尾小鹦鹉幼雏病毒病)是由长尾小鹦鹉幼雏病毒引起的一种高死亡率的争性传染病，鹦鹉类鸟多易感。自90年代以来，在世界多个地区广泛流行，严重地阻碍着鹦鹉养殖业及各种类笼养鸟的向前发展。湖北省云梦县是全国最大的笼养鸟基地之一，94-96年间发生了前所未有的大规模鹦鹉幼雏死亡，死亡率超过80％；迅速波及其他鹦鹉养殖区及外省区域，造成了严重的经济损失。
迄今，国内外尚无对鹦鹉幼雏病采用疫苗防治的相关研究报道。目前“查新”中未见有相关鹦鹉幼雏病疫苗的资料。近几年来德国、美国进行了鹦鹉幼雏病毒分子结构的研究，对疫苗的开发具有潜在的意义。德国墨尼黑大学Müller教授、美国的禽病学家在研究中发现BFDV-DNA对甲醛具有稳定性，对Ethylenimine(乙烯亚胺)敏感，而该试剂具有较强的致癌性；而且燃点为42℃，极不安全。
发明内容：
本发明的目的是提供一种长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒疫苗的制备方法，采用长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒株，用组织细胞培养方法生产长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒疫苗，疫苗接种后可有效地预防长尾小鹦鹉幼雏病毒病。对鹦鹉的免疫保护率达到99.76％左右。
本发明所涉及长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒株(Budgerigar FledglingDisease Virus-γα，BFDV-γα)，已于1999年12月8日交送保藏在武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：V99006。是由强毒型的长尾小鹦鹉幼雏病毒(Budgerigar Fledgling DiseaseVirus，BFDV)采用连续鹦鹉胚成纤维细胞适应性培养后，再转接到鸡胚成纤维细胞培养转接30代以上得到的弱毒株，该弱毒株特有的重要生物活性是已丧失对其原宿主动物(鹦鹉)的致病力，保留了良好的免疫原性。
鹦鹉幼雏病毒弱毒株病毒的主要生物学特性：鹦鹉幼雏病毒呈二十面体对称球形颗粒，直径约45-50纳米，无囊膜，核酸是DNA类型；此病毒对热、冻融和氯仿、乙醇、甲醛、乙醚等化学试剂具有稳定性；接种在鸡胚成纤维细胞培养可引起细胞病变，细胞体肿胀变圆、细胞核肿大并出现拉网现象。对其原宿主动物(鹦鹉)的无致病力，有良好的免疫原性。
制备长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒疫苗的技术方案是：将长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒按5％～10％接种于鸡胚成纤维细胞，在37℃～39.5℃培养，收集48-72小时产生细胞病变的病毒液，采用0.9％N.S作为稀释液，按1∶10的比例稀释，得到长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒疫苗，可有效的预防鹦鹉幼雏病毒病的发生。该弱毒疫苗对鹦鹉的免疫保护率99.62-100％，平均为99.76％，对鹦鹉的的免疫保护期不低于8个月；该疫苗在低温条件下有较长的保存期。
长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒株，保藏日：1999年12月8日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO.V99006。
具体实施方式：
实施例步骤如下：
1.制备鸡胚成纤维细胞：采用9-10日龄鸡胚，在无菌条件下取出胚体，匀浆；加入pH7.5的5％胰蛋白酶消化液，混匀，置37℃水浴消化40分钟，取出离心弃消化液；光镜下计数细胞数达1×107/ml；分装在100ml细胞培养瓶，加10％小牛血清M199组织培养液10ml，37℃培养16-18小时细胞形成单层。
2.取长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒按5％接种鸡胚成纤维细胞(单层)，置38℃培养(37～39℃均可)；24小时细胞出现病变，见细胞体肿胀变圆、细胞核肿大并出现拉网现象；收集48-72小时的病毒液(在此时间范围内选择细胞病变明显的收集)。
3.采用免疫琼脂扩散法检测病毒液效价，以出现明显免疫沉淀线为阳性。
4.按1∶10比例稀释病毒液，即1∶0.9％N.S。
5.疫苗杂菌检验，合格后分装冷藏。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
(1)免疫保护性强：采用鹦鹉幼雏病毒弱毒疫苗，0.2ml/只，接种鹦鹉，对照组用鹦鹉幼雏病毒野毒接种；将接种疫苗的鹦鹉在第14天攻毒(野毒)，观察20～100天，接种疫苗的鹦鹉表现有较强的保护性，免受鹦鹉幼锥病毒野的侵袭；而接种鹦鹉幼雏病毒野毒的鹦鹉则无保护；疫苗对鹦鹉的免疫保护率为99.76％。结果见表一。
表一：鹦鹉幼雏病毒弱毒疫苗免疫保护率检测结果
| 天数 只 发病 未发病 保护率％ 平均保率 | |
| 弱毒 | 20 40 0 100 |
| 50 62 2 60 99.68 | |
| 100 54 1 53 99.62 99.76 | |
| 野毒 | 20 30 29 1 3.4 |
结果表明：鹦鹉幼雏病毒弱毒疫苗对鹦鹉的保护率为99.76％。
(2)安全性好：采用健康鹦鹉15日龄以下幼雏，接种鹦鹉幼雏病毒弱毒疫苗0.2ml/只，饲养观察100天。结果见表二。
表二：鹦鹉幼雏病毒不同代弱毒株安全性试验结果鹦鹉幼雏病毒弱毒株 只 死亡 存活 安全率％
25代 125 8 117 93.6
30代 117 3 114 97.4
35代 156 1 155 99.0
40代 121 1 120 99.0*平均安全率为97.25％。
(3)免疫血清抗体测试：采用长尾鹦鹉幼雏病毒弱毒疫苗接种15龄以下雏鹦鹉，分别在免疫后10、15、25、40、60、100天取血检测，采用免疫琼脂扩散法，血清稀释按1∶100比例稀释。结果见表三表三：鹦鹉幼雏病毒弱毒免疫血清抗体检测结果天数 只 免疫沉淀线10 57 +-++15 38 ++25 35 ++40 30 +-++60 28 +100 46 +*鹦鹉幼雏病毒弱毒免疫血清抗体出现高峰在第10天-25天；其维持时间较长。
(4)疫苗保存期长：4批疫苗(批号：980906、981020、990115、990327)在-10～4℃可保存10个月左右。
(5)预防效果好：用鹦鹉幼雏病毒弱毒疫苗(批号：980906、981020、990115、990327)先后在湖北省云梦、孝感、应城三个地区，5个鹦鹉养殖场、10余家养殖户使用。免疫免疫雏、青年和成年鹦鹉5260余对，接种后临床观察2-6个月，安全，免疫效果良好。
(6)采用本法明制备鹦鹉幼雏病毒弱毒疫苗，生产工艺简便，成本低。
Claims (1)
1.一种长尾小鹦鹉幼雏病毒病弱毒疫苗的制备方法，其特征是：
A.采用9-10日龄鸡胚，在无菌条件下取出胚体，匀浆，加入PH7.5的5％的胰蛋白酶消化液，混匀，置37℃水浴消化，取出离心弃消化液，装在细胞培养瓶，加10％小牛血清，组织培养液，37℃培养16-18小时的细胞形成单层；
B.取长尾小鹦鹉幼雏病毒弱毒株(Budgerigar Fledgling DiseaseVirus-γα，BFDV-γα)，保藏编号：CCTCC NO：V 99006，5％接种上述鸡胚成纤维细胞，置38℃培养，24小时出现细胞病变；
C.收集培养48-72小时有细胞病变的病毒液；
D.免疫琼脂扩散法检测其效价为阳性，按1∶10比例稀释；
E.杂菌检验合格后分装冷藏。
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