CN113755511A

CN113755511A - 玉米Zm00001d029151基因在调控保卫细胞形态建成方面的应用

Info

Publication number: CN113755511A
Application number: CN202111186283.XA
Authority: CN
Inventors: 宋纯鹏; 周玉森; 郭思义; 李保珠; 乔鑫
Original assignee: Sanya Research Institute Of Henan University; Henan University
Current assignee: Sanya Research Institute Of Henan University; Henan University
Priority date: 2021-10-12
Filing date: 2021-10-12
Publication date: 2021-12-07
Anticipated expiration: 2041-10-12
Also published as: CN113755511B

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体公开了玉米Zm00001d029151基因在调控保卫细胞形态建成方面的应用，所述Zm00001d029151基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，在保卫细胞特异表达，参与调控保卫细胞细胞壁的加厚过程。本发明中的Zm00001d029151基因用于调控哑铃形保卫细胞的形态建成，对于探索玉米气孔保卫细胞形态建成的分子机制、改良玉米的抗逆性，具有重要的理论意义和实际应用价值。

Description

玉米Zm00001d029151基因在调控保卫细胞形态建成方面的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及玉米Zm00001d029151基因在调控保卫细胞形态建成方面的应用。

背景技术

细胞壁是植物细胞区别于动物细胞的重要结构特征之一，细胞壁的组成和结构决定了细胞的形态和功能，在植物生长发育和环境响应中发挥重要作用。气孔是植物表面高度特化的器官之一，是植物与外界进行气体交换的重要“门户”，不同于其他表皮细胞，气孔保卫细胞具有不均匀加厚并可反复伸缩的细胞壁，在气孔开闭过程中使其更适应体积的变化。禾本科植物的哑铃形气孔可能是反应最灵敏的气孔类型之一，与其他气孔类型相比，可以更迅速的打开和关闭，提高了光合作用和水分利用效率。细长、哑铃形的保卫细胞具有明显的结构优势，首先，哑铃形降低了体积与表面积的比率，减少了引发膨压变化所需的渗透分子和水的数量。其次，长宽比较大，较小的侧向位移就可以引起较大的孔隙面积变化。这也是禾本科植物比其他植物在干旱条件下表现更好的原因之一。到目前为止，对禾本科植物气孔复合体的研究已经取得了长足进展，但其哑铃形保卫细胞形态建成的调控机制仍不清楚。因此，研究禾本科植物的气孔，了解其气孔复合体的结构、形态建成、调控网络以及气孔的机械动力学特性，可为将来培育或设计出更高效的气孔、提高水分利用效率、创造更多抗旱、抗热等抗性的农作物品种提供新的途径和思路。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了玉米Zm00001d029151基因在调控保卫细胞形态建成方面的应用，所述Zm00001d029151基因用于调控哑铃形保卫细胞的形态建成，对于探索玉米气孔保卫细胞形态建成的分子机制、改良玉米的抗逆性，具有重要的理论意义和实际应用价值。

本发明提供了玉米Zm00001d029151基因在调控保卫细胞形态建成方面的应用，所述Zm00001d029151基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述Zm00001d029151基因编码UDP-葡萄糖4-差向异构酶。

进一步地，所述UDP-葡萄糖4-差向异构酶用于调控气孔保卫细胞发育后期的细胞壁加厚。

进一步地，所述Zm00001d029151基因用于调控气孔保卫细胞发育后期的细胞壁加厚。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明将正向遗传学与反向遗传学相结合，首先通过图位克隆克隆了突变体基因为Zm00001d029151，然后通过CRISPR-Cas9敲除和遗传互补进一步验证了图位克隆的结果，充分确保了Zm00001d029151基因的正确性；

2、本发明综合运用遗传学、分子生物学、细胞生物学等多种技术手段，证实了Zm00001d029151基因用于调控气孔保卫细胞发育后期的细胞壁加厚；

3、本发明加深了对玉米哑铃型保卫细胞形态建成与干旱胁迫的关系认知，为将来培育或设计出更高效的气孔、提高水分利用效率、创造更多抗旱的玉米新品种提供重要的理论基础和基因资源。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中玉米WT和bzu3的植株表型及气孔形态；

其中，图A表示野生型WT和突变体bzu3-1萌发7天的幼苗表型，比例尺＝3cm；

图B表示野生型WT和突变体bzu3-1萌发21天的幼苗表型，比例尺＝3cm；

图C表示郑58(Z58)和突变体bzu3-2萌发7天的幼苗表型，比例尺＝3cm；

图D表示郑58(Z58)和突变体bzu3-2萌发21天的幼苗表型，比例尺＝3cm；

图E表示野生型WT的叶片表皮的DIC图片，比例尺＝50μm；

图F表示突变体bzu3-1的叶片表皮的DIC图片，比例尺＝50μm；

图G表示WT中的哑铃形气孔形态，比例尺＝10μm；

图H表示bzu3-1中的线形气孔形态，比例尺＝10μm；

图I表示bzu3-1中的棒状气孔形态，比例尺＝10μm；

图J表示郑58的叶片表皮的DIC图片，比例尺＝50μm；

图K表示突变体bzu3-2的叶片表皮的DIC图片，例尺＝50μm；

图L表示郑58中的哑铃形气孔形态，比例尺＝10μm；

图M表示bzu3-2中的线形气孔形态，比例尺＝10μm；

图N表示bzu3-2中的棒状气孔形态，比例尺＝10μm；

图O表示WT、bzu3-1、郑58和bzu3-2的气孔密度统计；

图P表示WT、bzu3-1、郑58和bzu3-2的气孔类型统计；

图2为本发明实施例1中玉米WT和bzu3-1气孔发育过程图；

其中，图A表示野生型玉米WT生长至三叶期(上图)和解剖后叶片表型图(下图)，基部2-3cm红框所示部位为气孔发育部位(下)，比例尺＝2cm；

图B表示野生型玉米WT和bzu3-1的叶基部经PI染色后，自下而上观察气孔发育过程(左→右)，比例尺＝20μm；

图3为本发明实施例1中透射电镜观察WT和bzu3-1气孔显微结构图；

其中，上图表示WT的保卫细胞具有不均匀加厚的细胞壁(用符号‘{’表示)，比例尺＝2μm；

下图表示bzu3-1的保卫细胞只具有最初的薄壁(用符号‘[’表示)，比例尺＝2μm；

图4为本发明实施例1中BZU3图位克隆及CRISPR-Cas9敲除和遗传互补验证；

其中，图A表示bzu3-1与B73杂交的F₂代分离群体进行BZU3的精细定位和克隆示意图；

图A中将BZU3定位在Bin 1.04，60.67～60.77Mb大约100kb的区间内。该区间仅包含一个基因：Zm00001d029151；

图B表示BZU3基因组结构示意图，具有5'UTR、9个外显子、8个内含子和3'UTR的结构。并标出了转座子插入、缺失突变和CRISPR-Cas9突变的位置；

图C从左到右表示野生型HiC、CRISPR-Cas9敲除突变体(bzu3-3、bzu3-4和bzu3-5)、野生型郑58、缺失突变体bzu3-2和遗传互补材料的气孔表型，比例尺＝10μm；

图5表示BZU3的表达模式；

其中，图A表示BZU3pro::GUS转基因玉米叶表皮的GUS染色，比例尺＝20μm；

图B表示BZU3pro::BZU3-VENUS转基因材料叶片表皮的荧光图像；

BZU3主要定位于叶表皮成熟气孔的保卫细胞，比例尺＝20μm。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

生物材料：

Zm00001d029151基因突变(转座子插入、碱基缺失或基因敲除)失活后，即玉米Zm00001d029151基因无法表达后，突变体(即玉米Zm00001d029151基因突变体，本申请中命名为bzu3：bizui3)植株的保卫细胞不是正常的哑铃形，而是呈线形或棒状。

突变体bzu3-1及其对应野生型，为可公开获得材料，来自Maize GeneticsCooperation Stock Center。

突变体bzu3-2来自于由EMS(Ethyl methylsulfone)诱变玉米自交系郑58创建的突变体库。

玉米转基因所用的空载体pBUE411、pCM3300M-GFP和pCAMBIA3301由中国农业大学陈其军课题组提供。后由本实验室分别改造构建为pBUE411：Cas9-BZU3；pCM3300M-GFP：BZU3pro::BZU3-VENUS；pCAMBIA3301：BZU3pro::GUS。

需要解释的是，本申请之前对于bzu3突变体基因并未确认，即bzu3突变体中具体为哪个基因发生突变是未知的。

所述玉米Zm00001d029151基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.1：

ATGGTGTCCGCCGTGCTCCGGACCATCCTCGTGACGGGCGGCGCCGGGTACATCGGCAGCCACACGGTGCTGCAGCTGCTGCAGCAGGGCTTCCGCGTCGTCGTCGTCGACAACCTCGACAACGCCTCCGAGGCCGCCCTCGCCCGCGTCGCCGAGCTCGCCGGGCACGACGGCGCCAACCTCGTCTTCCACAAGGTTGACCTTCGCGACAGGCACGCGTTGGTGGACATCTTCTCGTCGCACAGGTTCGAGGCTGTCATTCACTTTGCTGGGCTCAAGGCTGTTGGGGAGAGCGTGCACAAGCCCCTGCTTTACTACGACAACAACCTGGTCGGCACCATCACCCTCCTCGAGGTGATGGCTGCGAACGGCTGCAAGAAGCTGGTGTTCTCGTCATCTGCAACTGTCTATGGGTGGCCCAAGGAAGTACCATGCACCGAAGAATTCCCGCTCTGCGCCACCAATCCCTATGGGCGGACAAAGCTTGTGATTGAAGACATCTGCCGCGACGTCCACCGCTCCGACCCGGACTGGAAGATCATACTGCTCAGGTACTTCAACCCCGTTGGCGCTCATCCAAGCGGGTACATCGGCGAAGACCCCTGCGGTGTCCCGAACAACCTGATGCCCTACGTGCAGCAAGTCGCTGTTGGGAGGTTACCTCACCTCACGGTCTACGGGACGGACTACAGCACCAAGGATGGGACTGGGGTGCGTGATTACATCCACGTTGTCGACCTGGCTGACGGCCACATAGCAGCCCTGAGGAAGCTCCACGAAGACTCCGACAAAATAGGCTGTGAAGTGTACAACTTGGGGACTGGAAAGGGGACGTCGGTGTTGGAAATGGTGGCTGCATTCGAGAAGGCTTCTGGGAAGAAAATCCCTCTGGTGTTCGCTGGGCGAAGACCCGGAGACGCAGAGATCGTCTACGCCGCAACTGCCAAGGCAGAGAAAGAGCTCAAATGGAAGGCCAAGTACGGGATCGAGGAGATGTGCAGAGATCTGTGGAACTGGGCGAGCAAGAACCCGTACGGCTACGCTGGGTCACGCGACAACAGCAAATGA

SEQ ID NO.2：

MVSAVLRTILVTGGAGYIGSHTVLQLLQQGFRVVVVDNLDNASEAALARVAELAGHDGANLVFHKVDLRDRHALVDIFSSHRFEAVIHFAGLKAVGESVHKPLLYYDNNLVGTITLLEVMAANGCKKLVFSSSATVYGWPKEVPCTEEFPLCATNPYGRTKLVIEDICRDVHRSDPDWKIILLRYFNPVGAHPSGYIGEDPCGVPNNLMPYVQQVAVGRLPHLTVYGTDYSTKDGTGVRDYIHVVDLADGHIAALRKLHEDSDKIGCEVYNLGTGKGTSVLEMVAAFEKASGKKIPLVFAGRRPGDAEIVYAATAKAEKELKWKAKYGIEEMCRDLWNWASKNPYGYAGSRDNSK*

一、玉米突变体bzu3气孔形态异常

所有用于实验的玉米幼苗材料均种植于小营养钵中，生长在16h光照和8h黑暗的温室中，白天温度30℃，夜间温度20℃。形态学分析发现，与野生型WT相比较，突变体bzu3表现为幼苗叶片水化，呈半透明状，生长至三叶期左右死亡(图1A-D)。

对二叶期玉米叶片表皮的气孔形态进行观察发现：在野生型WT中气孔的保卫细胞形态均为哑铃形，而突变体bzu3-1中不能形成哑铃形保卫细胞，约91.53％的气孔保卫细胞形态为线形，约8.47％的气孔保卫细胞形态为棒状(图1E-I，P)。在野生型郑58中气孔的保卫细胞形态均为哑铃形，而突变体bzu3-2中也不能形成哑铃形保卫细胞，约93.7％的气孔保卫细胞形态为线形，约6.3％的气孔保卫细胞形态为棒状(图1J-N，P)。同时对气孔密度进行了统计，在野生型WT中气孔密度为75.7个/1.142mm²，在突变体bzu3-1中气孔密度为76.5个/1.142mm²，与WT相比没有明显差异；在野生型郑58中气孔密度为68.3个/1.142mm²，在突变体bzu3-2中气孔密度为69.6个/1.142mm²，与郑58相比没有明显差异(图1O)。证明了基因BZU3参与调控玉米保卫细胞的形态。

微分干涉(DIC)成像方法为：取播种6-8天的叶片(二叶期)，用镊子撕取叶片下表皮条放置于清水中，用毛刷将叶肉细胞轻轻刷掉，用刀片将表皮条切成小块，制成装片在蔡司LSM710激光共聚焦显微镜上成像。

气孔密度和类型统计方法为：取播种6-8天的叶片(二叶期，一般为第二片叶的中间部位1-2cm)，放置于脱色液(无水乙醇:冰乙酸＝7:1)中，过夜孵育以去除叶绿素。用清水冲洗后，用刀片沿着叶片中脉切成两半，取其中一半制作装片，用奥林巴斯CX43光学显微镜观察叶片背轴侧(下表皮)，将显微镜连上电脑，在1.142mm²视野下对气孔计数进行密度统计，10株苗，每个叶片取5-7个视野。在0.38mm²视野下对气孔类型进行统计，10株苗，每株统计100个气孔左右。

二、玉米气孔发育过程的详细观察

上述研究结果基础上，发明人进一步通过PI染色法详细观察气孔的发育过程。玉米的气孔发育发生在叶片基部位置，自下而上的发育。为了便于操作和观察，我们取三叶期玉米幼苗的第三片叶(还未形成叶鞘)的基部2-3cm进行PI染色并用激光共聚焦显微镜观察。如图2所示，在野生型WT中，气孔的发育分为6个阶段，第一阶段：气孔列的建立，叶片基部垂直排列的表皮原细胞列在后期的发育过程中只有一部分可以产生气孔，气孔列的分裂迅速并且明显，细胞的形态较小；第二阶段：保卫母细胞的形成，气孔列细胞发生一次不对称的横向分裂，产生较小的远端细胞—将来发育成保卫母细胞和较大的近端细胞—将来发育成间隔细胞；第三阶段：当保卫母细胞形成后会诱导两侧的邻近细胞获得副卫母细胞的命运；第四阶段：副卫细胞的形成，副卫母细胞向保卫母细胞方向极化，发生一次高度不对称分裂，在靠近保卫母细胞的方向形成一个小的副卫细胞；第五阶段：保卫细胞的形成，保卫母细胞发生一次纵向的对称分裂，形成两个年轻的保卫细胞；第六阶段：发育后期，年轻的四细胞气孔复合体形变为一个成熟的、有功能的四细胞气孔复合体。在突变体bzu3-1中，气孔发育的过程同样可以观察到六个阶段。前五个阶段中不同时期的气孔形态、分布与野生型WT没有明显差异，但在第六阶段成熟的气孔形态出现异常，即：保卫细胞不能像野生型WT中一样形变为哑铃形，而是呈现出线形或棒状的形态。但是副卫细胞的形态与野生型WT相比并没有明显差异。

为了进一步明确突变体中保卫细胞形态发生缺陷的节点，发明人又详细观察了气孔发育后期的过程。如图2所示，在野生型WT中，从年轻的四细胞气孔复合体形变为成熟四细胞气孔复合体。形态上的变化主要包括三个方面：一、椭圆状的副卫细胞形变为倒三角状的副卫细胞；二、保卫细胞从钝角正方形先形变为类肾形，再进一步形变为哑铃形；三、两个保卫细胞之间形成气孔孔隙。在发育过程上，保卫细胞的形态变化经历了两个截然不同的阶段，第一个阶段是短暂的肾形形态，与孔隙的形成保持同步；第二阶段是在孔隙形成后气孔复合体的伸长过程，最终形成哑铃形的保卫细胞。与野生型WT相比，突变体bzu3-1中，发育后期的第一个阶段保卫细胞也会形变为类肾形，并且伴随着气孔孔隙的形成，但是在气孔复合体的伸长过程中，保卫细胞并不能继续形变为哑铃形，而是被副卫细胞挤压成线形或棒状的形态。这些结果表明，基因BZU3参与调控玉米哑铃形保卫细胞的形态建成。

荧光成像的方法为：取叶片组织(成熟气孔)用刀片切成0.3cm宽，0.5cm长的条形组织块，在PI(0.01mg/mL)中染色10min左右，用清水冲洗后制作装片，在蔡司LSM710共聚焦显微镜上成像。取叶基部组织2-3cm(气孔发育过程)用刀片切成0.3cm宽，0.5cm长的条形组织块，在PI(0.01mg/mL)中染色5min左右，用清水冲洗后制作装片，在蔡司LSM710共聚焦显微镜上成像。

三、突变体bzu3的保卫细胞壁不能加厚

对玉米叶片进行超薄切片(横切)，通过透射电镜观察发现，如图3所示，在野生型WT中，保卫细胞有着非常明显的不均匀加厚的细胞壁，这种不均匀加厚不仅体现在哑铃形保卫细胞的中间管状部分细胞壁厚而两端的球状部分细胞壁薄，而且还体现在中间管状部分的细胞壁厚度也不均匀。在中间管状部分的外周壁和内周壁有着非常明显的加厚，在靠近孔隙的腹侧壁也有加厚，但没有外周壁和内周壁厚，而在靠近副卫细胞的背侧壁则几乎没有加厚。与野生型WT相比，突变体bzu3-1的保卫细胞壁没有加厚，只有最初的薄壁存在。这些结果表明，在突变体bzu3-1中，保卫细胞壁的加厚存在缺陷，无法形成不均匀加厚的细胞壁，导致保卫细胞无法形成哑铃形形态。证明了BZU3参与调控保卫细胞细胞壁的加厚过程，并且不均匀加厚的细胞壁是维持保卫细胞哑铃形形态所必须的。

超薄切片及透射电镜观察的具体操作步骤为：(1)取样：取3叶期玉米幼苗，剥离叶片，从第二片叶的中间部分裁取1mm²正方形的玉米叶片样品，冰上操作。(2)前固定：将样品迅速放入5％戊二醛、4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中，抽真空30min左右，直至样品块沉入溶液。4℃固定不少于4h。(3)漂洗：用预冷的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)清洗3次，每次2h。(4)后固定：用1％锇酸磷酸盐缓冲液(pH 7.2)于4℃固定3-4h。(5)漂洗：用预冷的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)4℃清洗3次，每次1h。(6)脱水：30％、50％、70％、90％、100％乙醇梯度脱水，每个梯度15min。(7)丙酮置换：90％丙酮、无水丙酮、无水丙酮，每个梯度15min。(8)包埋剂配置：按照Epon812 24g，DDSA 9g，NMA 15g，BDMA 1.4g的比例配制包埋剂，振荡器振荡5-10min混匀，稍离心排除气泡。(9)渗透：25％、50％、75％、90％、100％包埋剂丙酮溶液梯度渗透，每个梯度6-12h。(10)包埋：将材料定准方向，采用倒扣法包埋叶片，尽量避免产生气泡。(11)聚合：烘箱中放置37℃、12h，45℃、12h，60℃、48h催化包埋剂聚合。(12)超薄切片：先用双面刀片对样品进行修块，再用玻璃刀修平切面，之后进行半薄切片定位，精细修块，钻石刀切片，捞取样品，红外烘烤灯干燥铜网。(13)染色：醋酸双氧铀染色30min，大量去离子水清洗铜网，柠檬酸铅染液染色15min，大量去离子水清洗铜网，红外烘烤灯干燥铜网。(14)观察成像：透射电子显微镜检测。

四、玉米BZU3基因编码一个UDP-葡萄糖4-差向异构酶(UGE)

利用玉米图位克隆技术(结果如图4A所示)，对突变体bzu3-1植株中突变基因进行定位。定位结果表明：BZU3定位在1号染色体的Bin 1.04上，60.67～60.77Mb大约100kb的区间内。该区间仅包含一个基因：Zm00001d029151，编码一个尿苷二磷酸-葡萄糖4-差向异构酶(UDP-Glucose 4-Epimerase,UGE)。

根据Zm00001d029151的基因组序列设计特异性扩增引物，由于该基因的基因组序列较大，我们设计了分段扩增的引物。分别以野生型WT和突变体bzu3-1的基因组为模板进行PCR扩增，通过测序比对，发现在突变体bzu3-1中该基因的第二个内含子上有一个大小为5-6kb的含有正向长末端重复序列(LTR)的病毒型反转录转座子插入(图4B)。扩增引物为bzu3-1-F(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)和bzu3-1-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)；

SEQ ID NO.3：CTCTCTCTCACACACACACATC；

SEQ ID NO.4：AAGTGAATGACAGCCTCGAA。

通过扩增野生型郑58和突变体bzu3-2中基因Zm00001d029151的基因组序列进行测序，发现在突变体bzu3-2中该基因的第七个外显子上有一个碱基的缺失(编码框的834位碱基G)(图4B)。扩增引物为bzu3-2-F(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)和bzu3-2-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)；

SEQ ID NO.5：TCTACGAAGACTCCGACAAAAT；

SEQ ID NO.6：CCCATCGCAGTACCCCTAATC。

通过氨基酸序列比对，发现在野生型郑58中该基因编码355个氨基酸，而在突变体bzu3-2中由于一个碱基缺失造成从279个氨基酸开始移码突变并延迟终止，共编码380个氨基酸。

为了进一步验证基因Zm00001d029151就是BZU3，发明人利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，对基因Zm00001d029151进行敲除并分析表型。在基因Zm00001d029151的第四个外显子上筛选出两个靶序列(Target 1和Target 2)并进行构建载体Cas9-BZU3(图4B)，然后对玉米自交系材料HiC进行转化。载体构建引物为Cas9-BZU3-T1-F(核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示)、Cas9-BZU3-T1-F0(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)、Cas9-BZU3-T2-R0(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)、Cas9-BZU3-T2-F(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)；

SEQ ID NO.7：AATAATGGTCTCAGGCGGCGCAGAGCGGGAATTCTT；

SEQ ID NO.8：

GGCGCAGAGCGGGAATTCTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；

SEQ ID NO.9：TATGGGCGGACAAAGGTTCCGCTTCTTGGTGCC；

SEQ ID NO.10：ATTATTGGTCTCTAAACTATGGGCGGACAAAGGTTC。

在T₁代中得到了三种不同形式的纯合突变体(bzu3-3、bzu3-4和bzu3-5)，且与突变体bzu3-1和bzu3-2的表型相似，气孔保卫细胞呈线形形态(图4C)。进一步验证了基因Zm00001d029151就是BZU3。

同时也通过遗传互补实验进行了验证，从野生型郑58材料的基因组中克隆BZU3基因的启动子序列(ATG上游3kb长)，从野生型郑58材料的cDNA中克隆BZU3基因的编码框序列，构建BZU3基因自身启动子启动BZU3基因融合YFP的载体(BZU3pro::BZU3-VENUS)。然后对玉米自交系材料HiC进行转化。载体构建引物为BZU3pro::BZU3-VENUS-1F(核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)、BZU3pro::BZU3-VENUS-1R(核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示)、BZU3pro::BZU3-VENUS-2F(核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示)和BZU3pro::BZU3-VENUS-2R(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)；

SEQ ID NO.11：

GCAGGTCGACTCTAGAAGCTTTATGCGAACGGTCTGACTGG；

SEQ ID NO.12：CGGACACCATCGTCGGTAGGCCCTCGGA；

SEQ ID NO.13：CCTACCGACGATGGTGTCCGCCGTGCTC；

SEQ ID NO.14：

TATTTAAATGGATCCGGCGCGCTTTGCTGTTGTCGCGTGACC。

得到转基因材料后，与突变体bzu3-2的杂合体(bzu3-2/+)进行杂交获得F₁代种子，对F₁代进行PCR扩增及测序鉴定，筛选出bzu3-2为杂合体(bzu3-2/+)，同时又是转基因的阳性株系进行自交收获F₂代种子。对F₂代进行鉴定，筛选出bzu3-2的纯合突变体，同时又是转基因的阳性株系进行表型分析。结果发现，突变体bzu3-2的表型得到了完全恢复，气孔复合体的形态恢复正常、保卫细胞恢复了哑铃形的形态(图4C)。这些结果再次验证了基因Zm00001d029151就是BZU3。

五、Zm00001d029151基因的表达模式

构建BZU3基因自身启动子启动GUS基因的载体(BZU3pro::GUS)。载体构建引物为BZU3pro::GUS-F(核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示)和BZU3pro::GUS-R(核苷酸序列如SEQID NO.16所示)；

SEQ ID NO.15：

GAGCTCGGTACCCGGGGATCCTATGCGAACGGTCTGACTGGG；

SEQ ID NO.16：

TTACCCTCAGATCTACCATGGCGTCGGTAGGCCCTCGGA。

将载体转入玉米自交系材料HiC中，得到转基因阳性植株后先繁殖一代。取BZU3pro::GUS转基因材料的叶片在GUS染色液中染色，脱色后用显微镜观察。结果显示，GUS报告基因主要在气孔复合体的保卫细胞中表达(图5A)。

利用激光共聚焦显微镜对BZU3pro::BZU3-VENUS转基因材料的YFP荧光信号进行检测，对叶片的表皮条进行观察显示，BZU3-VENUS在成熟气孔的保卫细胞中特异性表达，而在副卫细胞和其他表皮细胞中没有表达(图5B)。

GUS染色的方法为：取玉米GUS转基因幼苗叶片组织，置于90％的丙酮中，冰上静置1-2h，脱色和固定。然后用GUS漂洗液清洗两次，去除丙酮。将叶片转移至GUS染液中，真空处理5-10min，暗处理，37℃，2-5h至蓝色肉眼可见。用15％、30％、50％、75％、90％、100％的酒精梯度脱色，每个梯度不少于15min。在无水乙醇中脱色干净后用显微镜观察拍照。也可转移至70％的酒精中长期保存。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 河南大学，河南大学三亚研究院

<120> 玉米zm00001d029151基因在调控保卫细胞形态建成方面的应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1068

<212> DNA

<213> 玉米

<400> 1

atggtgtccg ccgtgctccg gaccatcctc gtgacgggcg gcgccgggta catcggcagc 60

cacacggtgc tgcagctgct gcagcagggc ttccgcgtcg tcgtcgtcga caacctcgac 120

aacgcctccg aggccgccct cgcccgcgtc gccgagctcg ccgggcacga cggcgccaac 180

ctcgtcttcc acaaggttga ccttcgcgac aggcacgcgt tggtggacat cttctcgtcg 240

cacaggttcg aggctgtcat tcactttgct gggctcaagg ctgttgggga gagcgtgcac 300

aagcccctgc tttactacga caacaacctg gtcggcacca tcaccctcct cgaggtgatg 360

gctgcgaacg gctgcaagaa gctggtgttc tcgtcatctg caactgtcta tgggtggccc 420

aaggaagtac catgcaccga agaattcccg ctctgcgcca ccaatcccta tgggcggaca 480

aagcttgtga ttgaagacat ctgccgcgac gtccaccgct ccgacccgga ctggaagatc 540

atactgctca ggtacttcaa ccccgttggc gctcatccaa gcgggtacat cggcgaagac 600

ccctgcggtg tcccgaacaa cctgatgccc tacgtgcagc aagtcgctgt tgggaggtta 660

cctcacctca cggtctacgg gacggactac agcaccaagg atgggactgg ggtgcgtgat 720

tacatccacg ttgtcgacct ggctgacggc cacatagcag ccctgaggaa gctccacgaa 780

gactccgaca aaataggctg tgaagtgtac aacttgggga ctggaaaggg gacgtcggtg 840

ttggaaatgg tggctgcatt cgagaaggct tctgggaaga aaatccctct ggtgttcgct 900

gggcgaagac ccggagacgc agagatcgtc tacgccgcaa ctgccaaggc agagaaagag 960

ctcaaatgga aggccaagta cgggatcgag gagatgtgca gagatctgtg gaactgggcg 1020

agcaagaacc cgtacggcta cgctgggtca cgcgacaaca gcaaatga 1068

<210> 2

<211> 355

<212> PRT

<213> 玉米

<400> 2

Met Val Ser Ala Val Leu Arg Thr Ile Leu Val Thr Gly Gly Ala Gly

1 5 10 15

Tyr Ile Gly Ser His Thr Val Leu Gln Leu Leu Gln Gln Gly Phe Arg

20 25 30

Val Val Val Val Asp Asn Leu Asp Asn Ala Ser Glu Ala Ala Leu Ala

35 40 45

Arg Val Ala Glu Leu Ala Gly His Asp Gly Ala Asn Leu Val Phe His

50 55 60

Lys Val Asp Leu Arg Asp Arg His Ala Leu Val Asp Ile Phe Ser Ser

65 70 75 80

His Arg Phe Glu Ala Val Ile His Phe Ala Gly Leu Lys Ala Val Gly

85 90 95

Glu Ser Val His Lys Pro Leu Leu Tyr Tyr Asp Asn Asn Leu Val Gly

100 105 110

Thr Ile Thr Leu Leu Glu Val Met Ala Ala Asn Gly Cys Lys Lys Leu

115 120 125

Val Phe Ser Ser Ser Ala Thr Val Tyr Gly Trp Pro Lys Glu Val Pro

130 135 140

Cys Thr Glu Glu Phe Pro Leu Cys Ala Thr Asn Pro Tyr Gly Arg Thr

145 150 155 160

Lys Leu Val Ile Glu Asp Ile Cys Arg Asp Val His Arg Ser Asp Pro

165 170 175

Asp Trp Lys Ile Ile Leu Leu Arg Tyr Phe Asn Pro Val Gly Ala His

180 185 190

Pro Ser Gly Tyr Ile Gly Glu Asp Pro Cys Gly Val Pro Asn Asn Leu

195 200 205

Met Pro Tyr Val Gln Gln Val Ala Val Gly Arg Leu Pro His Leu Thr

210 215 220

Val Tyr Gly Thr Asp Tyr Ser Thr Lys Asp Gly Thr Gly Val Arg Asp

225 230 235 240

Tyr Ile His Val Val Asp Leu Ala Asp Gly His Ile Ala Ala Leu Arg

245 250 255

Lys Leu His Glu Asp Ser Asp Lys Ile Gly Cys Glu Val Tyr Asn Leu

260 265 270

Gly Thr Gly Lys Gly Thr Ser Val Leu Glu Met Val Ala Ala Phe Glu

275 280 285

Lys Ala Ser Gly Lys Lys Ile Pro Leu Val Phe Ala Gly Arg Arg Pro

290 295 300

Gly Asp Ala Glu Ile Val Tyr Ala Ala Thr Ala Lys Ala Glu Lys Glu

305 310 315 320

Leu Lys Trp Lys Ala Lys Tyr Gly Ile Glu Glu Met Cys Arg Asp Leu

325 330 335

Trp Asn Trp Ala Ser Lys Asn Pro Tyr Gly Tyr Ala Gly Ser Arg Asp

340 345 350

Asn Ser Lys

355

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctctctctca cacacacaca tc 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aagtgaatga cagcctcgaa 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tctacgaaga ctccgacaaa at 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cccatcgcag tacccctaat c 21

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aataatggtc tcaggcggcg cagagcggga attctt 36

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggcgcagagc gggaattctt gttttagagc tagaaatagc 40

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tatgggcgga caaaggttcc gcttcttggt gcc 33

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

attattggtc tctaaactat gggcggacaa aggttc 36

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gcaggtcgac tctagaagct ttatgcgaac ggtctgactg g 41

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cggacaccat cgtcggtagg ccctcgga 28

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cctaccgacg atggtgtccg ccgtgctc 28

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tatttaaatg gatccggcgc gctttgctgt tgtcgcgtga cc 42

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gagctcggta cccggggatc ctatgcgaac ggtctgactg gg 42

<210> 16

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ttaccctcag atctaccatg gcgtcggtag gccctcgga 39

Claims

1.玉米Zm00001d029151基因在调控保卫细胞形态建成方面的应用，其特征在于，所述Zm00001d029151基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的玉米Zm00001d029151基因在调控保卫细胞形态建成方面的应用，其特征在于，所述Zm00001d029151基因编码UDP-葡萄糖4-差向异构酶。

3.如权利要求2所述的玉米Zm00001d029151基因在调控保卫细胞形态建成方面的应用，其特征在于，所述UDP-葡萄糖4-差向异构酶用于调控气孔保卫细胞发育后期的细胞壁加厚。

4.如权利要求3所述的玉米Zm00001d029151基因在调控保卫细胞形态建成方面的应用，其特征在于，所述Zm00001d029151基因用于调控气孔保卫细胞发育后期的细胞壁加厚。