CN113720927A - 一种采用反相高效液相色谱法检测奥拉帕利纯度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用反相高效液相色谱法检测奥拉帕利纯度的方法，包括流动相A(MPA)为0.05％(v/v)三氟乙酸水溶液，流动相B(MPB)为乙腈溶液，色谱柱和预柱均采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填料进行分离；选用水/乙腈＝1/1(v/v)作为样品溶剂，此溶剂也作为空白溶液；然后按照要求分别制备系统适用性溶液、对照品储备溶液、对照品溶液、灵敏度溶液、样品溶液，后续按照指定进样顺序注入高效液相色谱仪，测定275nm波长下溶液的色谱图，通过上述方式，本发明能够非常好的适用于化合物奥拉帕尼的纯度分析，对工艺杂质和降解杂质均有很好的分离，可以高效准确的评价奥拉帕利的纯度结果，填补了奥拉帕利纯度检测方法的空白，具有卓越的技术价值和市场推广空间。
Description
技术领域
本发明涉及液相色谱技术领域，特别是涉及一种采用反相高效液相色谱法检测奥拉帕利纯度的方法。
背景技术
奥拉帕利是一种聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶是一种DNA修复酶，在DNA修复通路中起关键作用，奥拉帕利的合成路线有很多种，诸如公开号为CN105820126B、CN112500379A等专利；同样对于奥拉帕利杂质的制备方法也有报告，诸如公开号为CN112279850B专利。
但是通过调研发现，对于奥拉帕利而言，目前没有现行药典方法或者相关专利报道用于检测奥拉帕利的纯度，不能有效监测奥拉帕利工艺杂质和降解杂质的情况，由此不利于奥拉帕利的纯度评估。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种采用反相高效液相色谱法检测奥拉帕利纯度的方法，能够高效准确的检测化合物奥拉帕利的纯度，工艺杂质和降解杂质的残留情况，保证有效的评估奥拉帕利的纯度。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种采用反相高效液相色谱法检测奥拉帕利纯度的方法，方法信息及相关测试步骤包括：流动相A(MPA)为0.05％(v/v)三氟乙酸水溶液，流动相B(MPB)为乙腈溶液，色谱柱和预柱均采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填料进行分离；
样品溶剂制备：选用水/乙腈＝1/1(v/v)作为样品溶剂，此溶剂也作为空白溶液；系统适用性溶液制备：称取30mg的奥拉帕利系统适用性对照品于20ml容量瓶内，用样品溶剂进行溶解并稀释至刻度混匀；对照品储备溶液制备：称取30mg奥拉帕利对照品于20ml容量瓶，用样品溶剂进行溶解并稀释至刻度混匀，接着移取2.5ml该溶液于50ml容量瓶，加样品溶剂稀释至刻度混匀；对照品溶液制备：移取2.5ml对照品储备溶液于25ml容量瓶，加样品溶剂稀释至刻度混匀；灵敏度溶液制备：移取2.5ml对照品溶液于25ml容量瓶，加样品溶剂稀释至刻度混匀；样品溶液制备：称取30mg奥拉帕利样品于20ml容量瓶，加样品溶剂溶解并稀释至刻度混匀；
后续按照如下进样序列注入高效液相色谱仪，测定275nm波长下溶液的色谱图，其中进样序列中每6针样品溶液中插打一针对照品溶液：
| 进样序号 | 溶液名称 | 进样次数 |
| 1 | 空白溶液 | 至少1 |
| 2 | 灵敏度溶液 | 1 |
| 3 | 系统适用性溶液 | 1 |
| 4 | 对照品溶液 | 6 |
| 5 | 样品溶液1 | 1 |
| 6 | 样品溶液2 | 1 |
| … | … | … |
| 10 | 样品溶液6 | 1 |
| 11 | 对照品溶液 | 1 |
| … | … | … |
| … | 样品溶液n | 1 |
| 结束 | 对照品溶液 | 1 |
其中，样品中各杂质的含量百分比按照下列公式计算：
公式中Ai：样品溶液进样图谱组分(i)的峰面积；Astd：前6针对照品溶液图谱中奥拉帕利的平均峰面积；Wstdcorr：用下列公式校正对照品储备溶液中奥拉帕利对照品的重量：Wstdcorr＝Wstdx纯度；Wstd：配制对照品储备溶液奥拉帕利对照品的称样量，mg；纯度：奥拉帕利对照品的纯度，％；Wsmp：配制样品溶液奥拉帕利的称样量，mg；RRF(i)：相对响应因子
0.005：稀释系数，样品溶液和对照品溶液配制过程中不同的稀释倍数；
按下列公式计算杂质总量(％)：
优选的，所述高效液相色谱仪的色谱柱具体选用HaloTMC18，粒径2.7μm，150mm(L)×4.6mm(ID)或等同柱、预柱具体选用HaloTMC18，粒径2.7μm，5mm(L)×4.6mm(ID)或等同柱。
优选的，所述高效液相色谱仪中的流速为0.5ml/min，进样体积为5ul。
优选的，所述高效液相色谱仪的检测器选用测定275nm检测波长的2489UV检测器或者等同仪器，柱温为30℃，样品运行时间为55min，洗针为水与乙腈按1:1体积比。
优选的，色谱条件选用梯度脱洗，洗脱程序如下表所示，
优选的，流动相A(MPA)为0.05％(v/v)三氟乙酸水溶液，具体配制方法为移取0.5ml TFA至含有1000ml水的合适容器中并混匀；流动相B(MPB)为乙腈溶液。
优选的，所述灵敏度溶液中奥拉帕利的信噪比s/n应不小于10。
优选的，所述系统适用性溶液制备前需进行系统适用性检查。
优选的，所述系统适用性检查方法为，如果系统适用性溶液的色谱图达到以下表的色谱性能要求，证明高效液相系统适用于分析
优选的，对照品溶液前6次进样的奥拉帕利峰面积相对标准偏差RSD应不大于5％。
本发明的有益效果是：本发明针对无现行药典方法检测奥拉帕利纯度，不能有效监控奥拉帕利工艺杂质和降解杂质的现有情况，开发了一种新的采用反相高效液相色谱法，非常好的适用于化合物奥拉帕尼的纯度分析，对工艺杂质和降解杂质均有很好的分离，能够高效准确的评价奥拉帕利的纯度结果，填补了奥拉帕利纯度检测方法的空白，具有卓越的技术价值和市场推广空间。
附图说明
图1是本发明中空白溶液的色谱图；
图2是本发明中系统适用性溶液色谱图；
图3是本发明中系统适用性溶液色谱图的放大图；
图4是本发明中对照品溶液色谱图；
图5是本发明中灵敏度溶液色谱图；
图6是本发明中样品溶液色谱图；
图7是本发明中样品溶液色谱图的放大图；
图8是本发明中奥拉帕利工艺杂质和降解杂质的定位图；
图9是本发明中奥拉帕利工艺杂质和降解杂质定位图的放大图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例：
一种采用反相高效液相色谱法检测奥拉帕利纯度的方法，其执行信息如下：
1、试剂选取：
(1)水(H2O)，选用超纯水或者等同；
(2)乙腈(ACN)，液相色谱级别，Scharlau或者等同；
(3)三氟乙酸(TFA)，液相色谱级别，Fisher或者等同；
(4)奥拉帕利系统适用性对照品；
(5)奥拉帕利对照品；
2、流动相配制：
(1)流动相A(MPA)为0.05％(v/v)三氟乙酸水溶液，具体配制方法为移取0.5mlTFA至含有1000ml水的合适容器中并混匀；
(2)流动相B(MPB)为乙腈溶液；
3、测试仪器：
选用Waters e2695高效液相色谱仪，检测器选用测定275nm检测波长的2489UV检测器或者等同仪器。
4、色谱条件：
色谱柱具体选用HaloTMC18，粒径2.7μm，150mm(L)×4.6mm(ID)或等同柱；
预柱具体选用HaloTMC18，粒径2.7μm，5mm(L)×4.6mm(ID)或等同柱；
流速为0.5ml/min；
进样体积为5ul；
柱温为30℃；
样品运行时间为55min；
洗针为水与乙腈按1:1体积比；
另外，色谱条件选用梯度脱洗，洗脱程序如下表所示：
5、溶液配制：
(1)样品溶剂制备：选用水/乙腈＝1/1(v/v)作为样品溶剂，此溶剂也作为空白溶液，其中：空白溶液在目标峰的出峰位置应没有明显的干扰，空白溶液对应的色谱图如图1所示。
(2)系统适用性溶液制备：称取30mg的奥拉帕利系统适用性对照品于20ml容量瓶内，用样品溶剂进行溶解并稀释至刻度混匀，其中：系统适用性溶液对应的色谱图如图2和图3所示。
另外，关于系统适用性溶液在制备前需进行系统适用性检查，系统适用性检查方法为：如果系统适用性溶液的色谱图达到以下表的色谱性能要求，证明高效液相系统适用于分析
(3)对照品储备溶液制备：称取30mg奥拉帕利对照品于20ml容量瓶，用样品溶剂进行溶解并稀释至刻度混匀，接着移取2.5ml该溶液于50ml容量瓶，加样品溶剂稀释至刻度混匀。
(4)对照品溶液制备：移取2.5ml对照品储备溶液于25ml容量瓶，加样品溶剂稀释至刻度混匀，相对于1.5mg/ml的样品溶液含有0.5％的奥拉帕利，对照品溶液对应的色谱图如图4所示。
(5)灵敏度溶液制备：移取2.5ml对照品溶液于25ml容量瓶，加样品溶剂稀释至刻度混匀，相对于1.5mg/ml的样品溶液含有0.05％的奥拉帕利，且灵敏度溶液中奥拉帕利的信噪比s/n应不小于10，对照品溶液对应的色谱图如图5所示。
(6)样品溶液制备：称取30mg奥拉帕利样品于20ml容量瓶，加样品溶剂溶解并稀释至刻度混匀。
6、进样序列：
后续按照如下进样序列注入高效液相色谱仪，测定275nm波长下溶液的色谱图，其中进样序列中每6针样品溶液中插打一针对照品溶液：
| 进样序号 | 溶液名称 | 进样次数 |
| 1 | 空白溶液 | 至少1 |
| 2 | 灵敏度溶液 | 1 |
| 3 | 系统适用性溶液 | 1 |
| 4 | 对照品溶液 | 6 |
| 5 | 样品溶液1 | 1 |
| 6 | 样品溶液2 | 1 |
| … | … | … |
| 10 | 样品溶液6 | 1 |
| 11 | 对照品溶液 | 1 |
| … | … | … |
| … | 样品溶液n | 1 |
| 结束 | 对照品溶液 | 1 |
对照品溶液前6次进样的奥拉帕利峰面积相对标准偏差RSD应不大于5％，计算前6针和插入的每一针对照品溶液的RSD，以确保整个分析过程中的系统适用性，峰面积的RSD应不大于5％。
其中，样品中各杂质的含量百分比按照下列公式计算：
公式中Ai：样品溶液进样图谱组分(i)的峰面积；Astd：前6针对照品溶液图谱中奥拉帕利的平均峰面积；Wstdcorr：用下列公式校正对照品储备溶液中奥拉帕利对照品的重量：Wstdcorr＝Wstdx纯度；Wstd：配制对照品储备溶液奥拉帕利对照品的称样量，mg；纯度：奥拉帕利对照品的纯度，％；Wsmp：配制样品溶液奥拉帕利的称样量，mg；RRF(i)：相对响应因子
0.005：稀释系数，样品溶液和对照品溶液配制过程中不同的稀释倍数；
按下列公式计算杂质总量(％)：
上述测试得到的样品溶液色谱图如图6和图7所示，对应的奥拉帕利的纯度结果如下表1所示，通过色谱图和下表可以看出奥拉帕利和奥拉帕利中间体等完全被分离开。
表1.样品溶液对应的奥拉帕利纯度测试结果
| 名称 | 保留时间 | 相对保留时间 | 峰面积 | ％峰面积 | 峰高 | |
| 1 | 14.971 | 0.55 | 192.48 | 0.0014 | 56 | |
| 2 | 16.621 | 0.61 | 265.38 | 0.0019 | 60 | |
| 3 | 16.775 | 0.62 | 311.40 | 0.0023 | 61 | |
| 4 | 19.842 | 0.73 | 2234.90 | 0.0162 | 368 | |
| 5 | 24.030 | 0.89 | 6858.54 | 0.0497 | 755 | |
| 6 | 奥拉帕利 | 27.083 | 1.00 | 13751706.19 | 99.6994 | 1170799 |
| 7 | 27.976 | 1.03 | 5706.18 | 0.0414 | 404 | |
| 8 | 30.757 | 1.14 | 2034.50 | 0.0148 | 159 | |
| 9 | 33.523 | 1.24 | 3593.07 | 0.0260 | 797 | |
| 10 | 33.804 | 1.25 | 2606.24 | 0.0189 | 464 | |
| 11 | 34.190 | 1.26 | 983.89 | 0.0071 | 148 | |
| 12 | 34.619 | 1.28 | 7343.19 | 0.0532 | 1801 | |
| 13 | 34.947 | 1.29 | 4550.30 | 0.0330 | 1108 | |
| 14 | 奥拉帕利中间体1 | 36.584 | 1.35 | 3721.31 | 0.0270 | 812 |
| 15 | 39.954 | 1.48 | 1061.54 | 0.0077 | 251 |
为了验证本检测方法的有效性，本发明检测方法针对奥拉帕利工艺杂质和降解杂质做了验证分析，对应的定位图如图8和图9所示，可看出：本发明方法，非常好的适用于化合物奥拉帕利的纯度分析，对工艺杂质和降解杂质具有很好的分离，能够高效准确的评价奥拉帕利的纯度结果。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种采用反相高效液相色谱法检测奥拉帕利纯度的方法，其特征在于，方法信息及相关测试步骤包括：流动相A(MPA)为0.05％(v/v)三氟乙酸水溶液，流动相B(MPB)为乙腈溶液，色谱柱和预柱均采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填料进行分离；
样品溶剂制备：选用水/乙腈＝1/1(v/v)作为样品溶剂，此溶剂也作为空白溶液；系统适用性溶液制备：称取30mg的奥拉帕利系统适用性对照品于20ml容量瓶内，用样品溶剂进行溶解并稀释至刻度混匀；对照品储备溶液制备：称取30mg奥拉帕利对照品于20ml容量瓶，用样品溶剂进行溶解并稀释至刻度混匀，接着移取2.5ml该溶液于50ml容量瓶，加样品溶剂稀释至刻度混匀；对照品溶液制备：移取2.5ml对照品储备溶液于25ml容量瓶，加样品溶剂稀释至刻度混匀；灵敏度溶液制备：移取2.5ml对照品溶液于25ml容量瓶，加样品溶剂稀释至刻度混匀；样品溶液制备：称取30mg奥拉帕利样品于20ml容量瓶，加样品溶剂溶解并稀释至刻度混匀；
后续按照如下进样序列注入高效液相色谱仪，测定275nm波长下溶液的色谱图，其中进样序列中每6针样品溶液中插打一针对照品溶液：
其中，样品中各杂质的含量百分比按照下列公式计算：
公式中Ai：样品溶液进样图谱组分(i)的峰面积；Astd：前6针对照品溶液图谱中奥拉帕利的平均峰面积；Wstdcorr：用下列公式校正对照品储备溶液中奥拉帕利对照品的重量：Wstdcorr＝Wstdx纯度；Wstd：配制对照品储备溶液奥拉帕利对照品的称样量，mg；纯度：奥拉帕利对照品的纯度，％；Wsmp：配制样品溶液奥拉帕利的称样量，mg；RRF(i)：相对响应因子
0.005：稀释系数，样品溶液和对照品溶液配制过程中不同的稀释倍数；
按下列公式计算杂质总量(％)：
2.根据权利要求1所述的一种采用反相高效液相色谱法检测奥拉帕利纯度的方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪的色谱柱具体选用HaloTMC18，粒径2.7μm，150mm(L)×4.6mm(ID)或等同柱、预柱具体选用HaloTMC18，粒径2.7μm，5mm(L)×4.6mm(ID)或等同柱。
3.根据权利要求1所述的一种采用反相高效液相色谱法检测奥拉帕利纯度的方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪中的流速为0.5ml/min，进样体积为5ul。
4.根据权利要求1所述的一种采用反相高效液相色谱法检测奥拉帕利纯度的方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪的检测器选用测定275nm检测波长的2489UV检测器或者等同仪器，柱温为30℃，样品运行时间为55min，洗针为水与乙腈按1:1体积比。
5.根据权利要求1所述的一种采用反相高效液相色谱法检测奥拉帕利纯度的方法，其特征在于：色谱条件选用梯度脱洗，洗脱程序如下表所示，
6.根据权利要求1所述的一种采用反相高效液相色谱法检测奥拉帕利纯度的方法，其特征在于：流动相A(MPA)为0.05％(v/v)三氟乙酸水溶液，具体配制方法为移取0.5ml TFA至含有1000ml水的合适容器中并混匀；流动相B(MPB)为乙腈溶液。
7.根据权利要求1所述的一种采用反相高效液相色谱法检测奥拉帕利纯度的方法，其特征在于：所述灵敏度溶液中奥拉帕利的信噪比s/n应不小于10。
8.根据权利要求1所述的一种采用反相高效液相色谱法检测奥拉帕利纯度的方法，其特征在于：所述系统适用性溶液制备前需进行系统适用性检查。
9.根据权利要求8所述的一种采用反相高效液相色谱法检测奥拉帕利纯度的方法，其特征在于：所述系统适用性检查方法为，如果系统适用性溶液的色谱图达到以下表的色谱性能要求，证明高效液相系统适用于分析
10.根据权利要求1所述的一种采用反相高效液相色谱法检测奥拉帕利纯度的方法，其特征在于：对照品溶液前6次进样的奥拉帕利峰面积相对标准偏差RSD应不大于5％。
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- 2021-06-28 CN CN202110719731.1A patent/CN113720927A/zh active Pending
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