CN113683693B - 一种屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段的制备方法及应用。方法包括：1)采集、稀释血清，过滤得血清样品；将样品上蛋白质A亲和层析柱，然后洗脱血清IgG抗体，获得血清总IgG抗体；2)将屋尘螨加至亲和层析柱耦合，加入步骤1)的血清总IgG抗体，再洗脱屋尘螨特异性IgG抗体；3)在屋尘螨特异性IgG抗体中加入琼脂糖连接的木瓜蛋白酶，混匀孵育，离心取上清，即得。本发明屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段能与IgE竞争结合屋尘螨并减少屋尘螨‑IgE复合物的形成，从而减少屋尘螨‑IgE复合物结合至表达有IgE低亲和力受体和高亲和力受体的效应细胞上，减少致敏细胞的活化，控制炎症反应的发生。

Description

一种屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段的制备方法及 应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段的制备方法及应用。

背景技术

哮喘是一种由肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和T淋巴细胞等参与的慢性气道炎症。流行病学调查显示，哮喘在全球的患病率高达5％～16％。超过50％的成人哮喘患者和80％的儿童哮喘患者对变应原敏感，而尘螨是我国过敏性哮喘患者最主要的变应原，有87.2％的过敏患者对一种以上的尘螨过敏，并且致敏程度与哮喘的严重程度呈正相关。

过敏性哮喘的预防和治疗密切相关：一方面尽可能确定变应原，避免与之接触；另一方面遵循全球哮喘倡议(GINA)指南给予糖皮质激素等药物治疗，大部分哮喘患者在现有的治疗指南下病情可以得到控制，但有5％到10％的患者患有严重或者不可控哮喘，这部分患者的病情恶化率和住院率高，医疗支出能占到整个哮喘治疗支出的60％以上。因此，哮喘不可控患者的治疗仍是目前亟需解决的问题。

对于变应原明确的过敏患者还可以进行变应原特异性免疫治疗(Allergenimmunotherapy，AIT)，AIT是指用逐渐增加剂量的变应原对过敏患者进行反复接触，提高患者对此类变应原的耐受性。患者AIT治疗后，体内出现一系列免疫状态的变化，其作用机制包括：在AIT的早期诱导T调节细胞(Treg)的产生，而Treg可以直接抑制Th2型细胞免疫，并调节白介素-10的产生；白介素-10既可以抑制总IgE及sIgE的产生，也可以刺激变应原特异性IgG(sIgG)的产生；sIgG能与变应原特异性结合，形成变应原-sIgG复合物，可以有效减少嗜碱性粒细胞等效应细胞周围的变应原却不引起细胞活化效应。因此，sIgG被认为是阻断抗体，不仅可以阻断变应原诱导的IgE依赖性组胺释放，还可以阻断变应原-IgE复合物与抗原呈递细胞的结合，从而抑制迟发的变应原特异性T细胞反应。sIgG4的升高是目前AIT最为显著的抗体变化，国外的研究显示，AIT后sIgG4有10-100倍的升高；申请人前期研究表明，哮喘患者经过屋尘螨AIT治疗后，屋尘螨sIgG4水平有37-73倍的升高，通过IgE介导的变应原结合试验证实了血清屋尘螨sIgG4阻断IgE与屋尘螨变应原结合的能力增强(MulinFeng,Journal of Immunology，2018，200:3897-3904)；通过嗜碱性粒细胞活化抑制试验首次证实了血清屋尘螨sIgG4是抑制表达有IgE高亲和力受体(FcεRⅠ)的嗜碱性粒细胞活化的主要抗体(Mulin Feng，Frontiers in Cell and Developmental Biology，2020，8)。另一方面，AIT也有局限：适用于病情控制良好患者；治疗时间长(3-5年)；有引起全身不良反应危险；停止治疗2年后，sIgG4即下降接近80％。而一些旨在规避AIT缺点的动物模型研究表明，变应原特异性IgG抗体被动免疫治疗和AIT联合治疗可以降低AIT的不良反应；并且变应原特异性IgG抗体被动免疫治疗可以降低致敏性、减少过敏反应和预防过敏反应的发生；同时，变应原特异性IgG抗体可以通过胎盘，诱导后代对变应原产生耐受。

因此，获得具备变应原特异性、阻断变应原与IgE结合能力强、容易穿过胎盘及分布于呼吸道、免疫原性低不容易产生中和抗体的变应原特异性阻断抗体，可能是治疗及预防过敏性疾病的有效方法。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段的制备方法及应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

第一方面，本发明提供了一种屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段的制备方法，包括以下步骤：

1)采集经过变应原特异性免疫治疗的屋尘螨过敏患者的血清，使用结合缓冲液I稀释血清，过滤，得血清样品；将血清样品上蛋白质A亲和层析柱，然后使用洗脱缓冲液洗脱蛋白质A亲和层析柱上的血清IgG抗体，收集洗脱液，获得血清总IgG抗体；

2)使用结合缓冲液II平衡亲和层析柱，将屋尘螨加至亲和层析柱耦合，用结合缓冲液II平衡，加入步骤1)的血清总IgG抗体，再用洗脱缓冲液洗脱结合在亲和层析柱上的屋尘螨特异性IgG抗体，收集洗脱液，获得屋尘螨特异性IgG抗体；

3)在步骤2)获得的屋尘螨特异性IgG抗体中加入琼脂糖连接的木瓜蛋白酶，混匀孵育，离心去除琼脂糖连接的木瓜蛋白酶，收集上清，并再次以蛋白质A亲和层析柱去除未酶解的屋尘螨特异性IgG抗体，获得屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段。

本发明采集经过变应原特异性免疫治疗(AIT)的屋尘螨过敏患者的血清作为候选血清，采用蛋白质A亲和层析方法对血清总IgG抗体进行纯化，然后通过以屋尘螨为配体的亲和层析柱进一步纯化出屋尘螨特异性IgG抗体，再以木瓜蛋白酶酶解屋尘螨特异性IgG抗体，从而获得屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段，该IgG Fab抗体片段由屋尘螨免疫人体产生，免疫原性低不容易产生中和抗体，并且该IgG Fab抗体片段能与IgE竞争结合屋尘螨并减少屋尘螨-IgE复合物的形成，从而减少屋尘螨-IgE复合物结合至表达有IgE低亲和力受体(FcεRⅡ)和高亲和力受体(FcεRⅠ)的B细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞等效应细胞上，进而减少致敏细胞的活化，从而控制炎症反应的发生。

作为本发明所述屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段的制备方法的优选实施方式，所述屋尘螨特异性IgG抗体与木瓜蛋白酶的质量比为9:(0.5～2)，更优选地，所述屋尘螨特异性IgG抗体与木瓜蛋白酶的质量比为9:1。

作为本发明所述屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段的制备方法的优选实施方式，所述结合缓冲液I包括以下质量浓度的组分：0.02M磷酸钠，0.02M柠檬酸钠，PH 7.5；所述结合缓冲液II包括以下质量浓度的组分：20mM三羟甲基氨基甲烷，0.5M氯化钠，pH 8.0；所述洗脱缓冲液包括以下质量浓度的组分：0.02M柠檬酸钠，0.1M氯化钠，pH 2.5。

在本发明的技术方案中，使用上述配方的结合缓冲液I和结合缓冲液II可以平衡蛋白质A亲和层析柱，有利于上样；使用本发明的洗脱缓冲液可以更好的洗脱结合在蛋白质A亲和层析柱上的血清IgG抗体和屋尘螨特异性IgG抗体，洗脱率高，进而使得血清总IgG抗体和屋尘螨特异性IgG抗体纯度更高。

作为本发明所述屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段的制备方法的优选实施方式，步骤1)和步骤2)中，使用质量浓度为1M的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐中和洗脱液。

作为本发明所述屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段的制备方法的优选实施方式，所述步骤2)中，屋尘螨的质量浓度为10mg/mL。

作为本发明所述屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段的制备方法的优选实施方式，所述血清总IgG抗体和屋尘螨特异性IgG抗体的浓度均为2mg/mL。当血清总IgG抗体和屋尘螨特异性IgG抗体的浓度为2mg/mL时，更有利于抗体功能检测

作为本发明所述屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段的制备方法的优选实施方式，将屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段进行功能试验鉴定，功能试验包括IgE易化的变应原结合试验或嗜碱性粒细胞活化抑制试验。

通过嗜碱性粒细胞活化抑制试验显示，屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段可以抑制变应原与IgE的结合，从而阻断尘螨-IgE复合物结合至表达有IgE高亲和力受体(FcεRⅠ)的嗜碱性粒细胞，减少嗜碱性粒细胞的活化。

作为本发明所述屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段的制备方法的优选实施方式，所述步骤3)中，还包括通过蛋白超滤对屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段进行浓缩的步骤。

第二方面，本发明提供了上述制备方法制备的屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段。

作为本发明所述屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段的优选实施方式，所述屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段包括轻链可变区、轻链恒定区、重链可变区和一个重链恒定区。

本发明从经过屋尘螨AIT的屋尘螨过敏患者的血清中制备出屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段，该IgG Fab抗体片段可与屋尘螨变应原特异结合，减少屋尘螨-IgE复合物与致敏细胞上的特异性IgE抗体偶联，进而减少致敏细胞的活化，从而控制炎症反应的发生。

第三方面，本发明提供了上述屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段在制备预防和/或治疗屋尘螨过敏性疾病药物中的应用。更优选地，所述屋尘螨过敏性疾病包括屋尘螨过敏性哮喘、鼻炎、慢性荨麻疹疾病。

本发明的屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段比完整IgG抗体分子量更小，容易穿过胎盘屏障，从而能阻断源于母体变应原致敏胎儿，达到预防过敏发生的作用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明采集经过变应原特异性免疫治疗(AIT)的屋尘螨过敏患者的血清作为候选血清，采用蛋白质A亲和层析方法对血清总IgG抗体进行纯化，然后通过以屋尘螨为配体的亲和层析柱进一步纯化出屋尘螨特异性IgG抗体，再以木瓜蛋白酶酶解屋尘螨特异性IgG抗体，从而获得屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段，该IgG Fab抗体片段由屋尘螨免疫人体产生，免疫原性低不容易产生中和抗体；

2)本发明屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段能与IgE竞争结合屋尘螨并减少屋尘螨-IgE复合物的形成，从而减少屋尘螨-IgE复合物结合至表达有IgE低亲和力受体(FcεRⅡ)的B细胞上，进而减少致敏细胞的活化，从而控制炎症反应的发生；

3)本发明屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段可用于预防和/或治疗屋尘螨过敏性疾病；屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段还可以与屋尘螨特异性免疫治疗联合治疗过敏性哮喘患者，可能减少屋尘螨特异性免疫治疗不良反应的发生。

附图说明

图1为实施例1制备的屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段的10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

图2为通过IgE易化的变应原结合试验检测实施例1的屋尘螨变应原特异性IgGFab抗体片段阻断屋尘螨变应原与IgE结合的结果图；

图3为通过嗜碱性粒细胞活化抑制试验检测实施例1的屋尘螨变应原特异性IgGFab抗体片段阻断屋尘螨变应原活化嗜碱性粒细胞的结果图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、一种屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段的制备方法

一、候选血清的制备

临床适应症为屋尘螨过敏的患者经屋尘螨特异性免疫治疗之后(结果见表1)，分别按常规方法无菌采集外周血，收集到无菌采血管中，室温(20℃至25℃)静置4小时，待血清析出后，以1500g离心20分钟，吸取上清血清，分装到1.5毫升血清收集管，获得候选血清。

表1屋尘螨变应原特异性免疫治疗患者情况

二、纯化经过变应原特异性免疫治疗的屋尘螨过敏患者的血清总IgG抗体

(1)实验材料:

蛋白质A亲和层析柱(Bio-Scale Mini UNOsphere SUPrA Protein-Acartridges,bio-rad,USA)；0.45μm无菌过滤器；结合缓冲液I(0.02M磷酸钠，0.02M柠檬酸钠，PH 7.5)；洗脱缓冲液(0.02M柠檬酸钠，0.1M氯化钠，pH 2.5)；1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，pH 9.0；超滤离心管(Millpore)；蛋白浓度检测试剂盒(Pierce BCA Protein AssayKit)；离心管(15ml,50ml)、注射器(5ml/10ml/20ml/30ml)、0.22μm滤器过滤缓冲液、0.45μm滤器过滤离心后的血清、2ml细胞冻存管收集；磷酸钠磷酸钠、柠檬酸钠、氯化钠、1N盐酸标准溶液(1mol/L)、1N氢氧化钠(1mol/L)。

(2)实验步骤：

1)以0.45μm滤器过滤结合缓冲液I、洗脱缓冲液。取2ml上述采集的经过变应原特异性免疫治疗的屋尘螨过敏患者的血清用结合缓冲液I稀释10倍，再以0.45μm无菌过滤器过滤，得到上柱血清样品。

2)垂直放置蛋白质A亲和层柱于试管架上，用注射器吸取10ml结合缓冲液I，加至蛋白质A亲和层析柱平衡。

3)上样:用20ml注射器吸取步骤(1)得到的中上柱血清样品加至蛋白质A亲和层析柱，上样速度为3秒/滴。

4)以20ml结合缓冲液I清洗未结合至蛋白质A亲和层柱上血清成份，速度为3秒/滴。

5)洗脱总IgG抗体：用注射器吸取5ml洗脱缓冲液加至蛋白质A亲和层析柱，上样速度为3秒/滴，最先洗脱的1ml洗脱液不收集，然后收集3ml洗脱液，收集后，加入1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，pH 9.0调pH值至中性。

6)以超滤离心管(Millpore)浓缩总IgG抗体，并通过蛋白浓度检测试剂盒(PierceBCA Protein Assay Kit)检测蛋白浓度，总IgG抗体浓度调整为2mg/mL。

三、以屋尘螨为配体的亲和层析柱纯化屋尘螨特异性IgG抗体

(1)实验材料:

结合缓冲液II(20mM三羟甲基氨基甲烷，0.5M氯化钠，pH 8.0)；亲和层析柱(HiTrap NHS-activated HP columns，GE Healthcare)；屋尘螨(Greer)；洗脱缓冲液(0.02M柠檬酸钠，0.1M氯化钠，pH 2.5)。

(2)实验步骤：

1)屋尘螨作为配体的亲和层析柱(屋尘螨-亲和层析柱)的制备：

A.以PBS溶液溶解屋尘螨，获得浓度为10mg/mL的屋尘螨溶液。

B.移去HiTrap NHS-activated HP层析柱顶盖，加入一滴1mM HCl以防止气泡的产生，移去HiTrap NHS-activated HP层析柱的底盖，用注射器吸取6ml盐酸(1mM)加至HiTrapNHS-activated HP层析柱，以3秒/滴的速度洗去异丙醇。

C.用注射器吸取1ml屋尘螨溶液加至HiTrap NHS-activated HP层析柱，盖上HiTrap NHS-activated HP层析柱盖子，置于4℃，耦合4小时，加入6ml低pH值缓冲液(0.1M醋酸盐，0.5M氯化钠，pH 4)冲洗HiTrap NHS-activated HP层析柱，然后加入高pH值缓冲液(0.5M乙醇胺，0.5M氯化钠，pH 8.3)冲洗HiTrap NHS-activated HP层析柱，重复加入高pH值缓冲液(0.5M乙醇胺，0.5M氯化钠，pH 8.3)冲洗HiTrap NHS-activated HP层析柱一次，即得到屋尘螨作为配体的亲和层析柱，置于4℃备用。

2)垂直放置屋尘螨-亲和层析柱于试管架上，用注射器吸取10ml结合缓冲液II，加至层析柱平衡。

3)上样：用注射器吸取2ml步骤一中获得的总IgG抗体加至屋尘螨-亲和层析柱中，上样速度为1ml/min。

4)以20ml结合缓冲液II清洗未结合至屋尘螨-亲和层析柱上的IgG抗体成份，速度为3秒/滴。

5)洗脱屋尘螨特异性IgG抗体：用注射器吸取5ml洗脱缓冲液加至屋尘螨-亲和层析柱，上样速度为3秒/滴，最先洗脱的1ml洗脱液不收集，然后收集3ml洗脱液，收集后，加入1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐,pH 9.0调pH值至中性。

6)以超滤离心管(Millpore)浓缩屋尘螨特异性IgG抗体，并通过蛋白浓度检测试剂盒(Pierce BCA Protein Assay Kit)检测蛋白浓度，屋尘螨特异性IgG抗体的浓度调整为2mg/mL。

四、屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段的制备

(1)装有0.9mL步骤三获得的屋尘螨特异性IgG抗体置于离心管中，加入0.1mL琼脂糖连接的木瓜蛋白酶(100units/mL，25mM巯基乙醇，来源于Sigma)，37℃旋转混匀器上孵育4小时，1000g离心2分钟去除琼脂糖连接的木瓜蛋白酶，收集屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段上清，并加入结合缓冲液II调整上清体积至1ml。

(2)以蛋白质A亲和层析柱去除未酶解的屋尘螨特异性IgG：

1)垂直放置蛋白质A亲和层柱于试管架上，用注射器吸取10ml结合缓冲液，加至蛋白质A亲和层析柱平衡。

2)上样:用注射器吸取屋尘螨特异性Fab抗体片段上清加至蛋白质A亲和层析柱，上样速度为3秒/滴。

3)以3ml结合缓冲液冲洗蛋白质A亲和层柱，速度为3秒/滴，收集洗脱液即为屋尘螨特异性Fab抗体片段。

4)以超滤离心管浓缩屋尘螨变应原特异性Fab抗体片段，并通过蛋白浓度检测试剂盒(Pierce BCA Protein Assay Kit)检测蛋白浓度，屋尘螨特异性Fab抗体片段浓度调整为2mg/mL。

屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段包括轻链可变区(VL)、轻链恒定区(CL)、重链可变区(VH)和一个重链恒定区(CH1)。

实施例2、一种屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段的制备方法

与实施例1相似，区别仅在于，步骤四中，屋尘螨特异性IgG抗体的加入量为0.9mL，琼脂糖连接的木瓜蛋白酶的加入量为0.05mL，其余参数与实施例1相同。

实施例3、一种屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段的制备方法

与实施例1相似，区别仅在于，步骤四中，屋尘螨特异性IgG抗体的加入量为0.9mL，琼脂糖连接的木瓜蛋白酶的加入量为0.2mL，其余参数与实施例1相同。

试验例、屋尘螨变应原特异性Fab抗体片段的纯度及功能检测

(1)使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测屋尘螨变应原特异性Fab抗体片段的片段位置，参考图1。

蛋白非变性SDS-PAGE凝胶电泳显示，A为：血清蛋白电泳；B为：血清经过蛋白质A纯化后的去除总IgG抗体的上清电泳图；C为：屋尘螨特异性IgG抗体电泳图；D为：屋尘螨变应原特异性Fab抗体片段电泳图，在45kDa处可以看到条带；E为：蛋白电泳Marker。

(2)IgE易化的变应原结合试验检测屋尘螨变应原特异性Fab抗体片段阻断屋尘螨与IgE的结合：

1)培养EB病毒转染的B淋巴细胞使其活化表达CD23。测定尘螨过敏患者血清特异性IgE，选取特异性IgE>100kU/ml的血清作为指示血清。

2)指示血清与变应原混合，加入屋尘螨变应原特异性Fab抗体片段作为检测管，而不加屋尘螨变应原特异性Fab抗体片段作为对照管。

3)混合孵育。对照管指示血清与变应原形成IgE-变应原复合物，而检测管中屋尘螨变应原特异性Fab抗体片段与IgE竞争结合变应原形成屋尘螨特异性Fab抗体片段-变应原复合物。

4)加入B淋巴细胞。IgE-变应原复合物与B淋巴细胞上的CD23结合，而屋尘螨特异性Fab抗体片段则阻止变应原与B细胞的结合。

5)PBS洗涤细胞后加入FITC荧光标记的抗IgE抗体(anti-IgE-FITC)。

6)流式细胞仪检测。IgE-变应原复合物与B细胞结合后可以用流式细胞术检测。

7)结果显示(参考图2)，检测到屋尘螨变应原特异性Fab抗体片段与抗IgE抗体结合的B细胞数减少，屋尘螨变应原特异性Fab抗体片段能阻止屋尘螨变应原与B细胞的结合。

(2)嗜碱性粒细胞活化抑制试验检测屋尘螨变应原特异性Fab抗体片段阻断屋尘螨活化嗜碱性粒细胞：

1)收集嗜碱性粒细胞：募集未经AIT的屋尘螨过敏患者，抽取外周血，淋细胞分离液分离PBMC，计数细胞，并调整细胞浓度，备用。

2)屋尘螨变应原特异性Fab抗体片段(20μl，2mg/mL)与60μl屋尘螨(屋尘螨最终浓度为0.15μg/ml)，在37℃孵育1小时，并以PBS作为对照。然后加入200μl(2×10⁶细胞/毫升)，混匀，在37℃孵育30分钟，离心，PBS洗涤一次，然后用含EDTA的PBS终止反应，离心去上清液，加入CD63-FITC、CD123-PE、CD203c-PC5、HLA-DR-ECD单克隆抗体各10μl置4℃孵育30分钟，PBS 2ml洗涤2次，加入0.5ml 1％多聚甲醛固定后流式细胞仪上机分析(活化的嗜碱性粒细胞标记为SSC^low/CD203c⁺/CD123⁺/HLA-DR^-)。

参考图3，屋尘螨变应原特异性Fab抗体片段可以抑制变应原与IgE的结合，从而阻断尘螨-IgE复合物结合至表达有IgE高亲和力受体(FcεRⅠ)的嗜碱性粒细胞，减少嗜碱性粒细胞的活化。实施例2-3制备的屋尘螨变应原特异性Fab抗体片段经过IgE易化的变应原结合试验和嗜碱性粒细胞活化抑制试验其结果与该试验例的结果类似，在此不再阐述。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）采集经过变应原特异性免疫治疗的屋尘螨过敏患者的血清，使用结合缓冲液I稀释血清，过滤，得血清样品；将血清样品上蛋白质A亲和层析柱，然后使用洗脱缓冲液洗脱蛋白质A亲和层析柱上的血清IgG抗体，收集洗脱液，获得血清总IgG抗体；

2）使用结合缓冲液II平衡亲和层析柱，将屋尘螨加至亲和层析柱耦合，用结合缓冲液II平衡，加入步骤1）的血清总IgG抗体，再用洗脱缓冲液洗脱结合在亲和层析柱上的屋尘螨特异性IgG抗体，收集洗脱液，获得屋尘螨特异性IgG抗体；

3）在步骤2）获得的屋尘螨特异性IgG抗体中加入琼脂糖连接的木瓜蛋白酶，混匀孵育，离心去除琼脂糖连接的木瓜蛋白酶，收集上清，并再次以蛋白质A亲和层析柱去除未酶解的屋尘螨特异性IgG抗体，获得屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段；所述屋尘螨特异性IgG抗体与木瓜蛋白酶的质量比为9:(0.5～2)；

所述结合缓冲液I包括以下浓度的组分：0.02M 磷酸钠，0.02M 柠檬酸钠，PH 7.5；所述结合缓冲液II包括以下浓度的组分：20 mM三羟甲基氨基甲烷，0.5 M氯化钠，pH 8.0；所述洗脱缓冲液包括以下浓度的组分：0.02M 柠檬酸钠，0.1M 氯化钠，pH 2.5。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述屋尘螨特异性IgG抗体与木瓜蛋白酶的质量比为9:1。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1）和步骤2）中，使用浓度为1M的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐中和洗脱液。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中，屋尘螨的质量浓度为10mg/mL。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述血清总IgG抗体和屋尘螨特异性IgG抗体的浓度均为2 mg/mL。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将屋尘螨变应原特异性IgG Fab抗体片段进行功能试验鉴定，功能试验包括IgE易化的变应原结合试验或嗜碱性粒细胞活化抑制试验。

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