JPS63197462A - 抗−ヒトＩｇＭ免疫吸着剤およびその製造方法 - Google Patents

抗−ヒトＩｇＭ免疫吸着剤およびその製造方法

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JPS63197462A
JPS63197462A JP62292201A JP29220187A JPS63197462A JP S63197462 A JPS63197462 A JP S63197462A JP 62292201 A JP62292201 A JP 62292201A JP 29220187 A JP29220187 A JP 29220187A JP S63197462 A JPS63197462 A JP S63197462A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、総括的には生物の体液から得られるタンパク
質ならびに他の物質を免疫的に除去するための材料に関
し、特には血液からのＩｇＭならびにＩｇＭ関連複合体
を除去するための免疫吸着剤に関する。
血液をイネ外で処理して、免疫グロブリンおよび循環免
疫複合体を除去することは、様々な情況において有用で
あると言える。例えば、循環ＩｇＭならびにＩｇＭ関連
複合体の除去は、原発性胆汁性肝炎（Ｐ　Ｂ　Ｃ）の処
置において、治療上の意義を有することがある。ＰＢＣ
とは、血液中の免疫グロブリン（主に、ＩｇＭ）レベル
の上昇、循環免疫複合体レベルの上昇、自己抗体の存在
、並びにＴ細胞およびＢ細胞機能の変化を伴う免疫機構
障害に関する症候群である。
患者の血液からＩｇＭならびにＩｇＭ関連複合体を除去
することができる材料を開発できれば、これに越したこ
とはない。特に、その材料は、使用が簡便で容易に滅菌
でき、しかも処理血液へ毒性物質を放出しないことが望
ましい。
〔従来の技術〕
抗Ａおよび抗Ｂ抗体を除去するための唾液処理システム
は、Ｂｅｎｓｉｎｇｅｒら、　（１９８１）　Ｎ、　Ｅ
ｎｇｌ。
Ｊ、　Ｍｅｄ、　３０４：１６０〜１６２　、およびＢ
ｅｎ５　ｉｎｇｅｒら。
（１９８２）　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ
　　１　：　２〜５に記載されている。この免疫吸着シ
ステムは、シリカ・マトリクスに共有結合した合成ヒト
血液抗原を利用したものである。対外吸着のための、タ
ンパクＡ−シリカ・カラムの使用法は、Ｂｅｎｓｉｎｇ
ｅｒら。
（１９８１）　Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３
０６：９３５で簡単に報告されている。ファルマシア・
ファイン・ケミカルズ社から出版されている「アフィニ
ティクロマトグラフィーー原理と応用」によると、セフ
ァロースＯにカップリングするカルボジイミドは、ｐＨ
約４．５で最も良く機能することが分かる。
本発明は、免疫吸着剤の製造方法、および血液ならびに
血漿等の体液からＩｇＭならびにＩｇＭ関連複合体の対
外での除去に使用する装置を提供する。このような処理
は、原発性胆汁肝炎（ＰＢＣ）を含む様々な疾患の処置
に有用であると言える。本発明の免疫吸着剤は、特定条
件下で抗ＩｇＭ抗体を固相シリカ・マトリクスへ共有結
合的にカップリングさせて調製する。固相シリカ・マト
リクスは、非晶質または結晶質シリカであり、共有結合
性の力、プリングは、水酸基ならびにアミノ基等の遊離
表面基をシリカ・マトリクス上に導入し、これらの基を
臭化シアンで活性化して行う。
活性化された表面基は、抗ＩｇＭ抗体の結合可能な基と
反応し、共有結合を生じる。こうして得られた免疫吸着
剤は、ＩｇＭの吸着能が極めて高く、非常に安定であり
、処理体液への抗ＩｇＭ抗体ならびに他の物質の脱離を
起こさない。さらに、この免疫吸着剤は、毒性がなく、
その後の処理で微粒子が生成しにくい。調製済み吸着剤
は、空気で乾燥し、生体適合性のあるカートリッジに充
填して、ガス滅菌することができる。その後、カートリ
ッジは、無菌条件下で搬送し、適当な場所で再水和して
、１回の使い捨て用として臨床上の処置に使用すること
ができる。
〔問題点を解決するための手段〕
中に免疫吸着剤を充填した免疫吸着カラムは、り砂トで
血液ならびに血漿等の体液を処理して、そこからＩｇＭ
ならびにＩｇＭ関連複合体を除去するために提供される
。この処理は、患者の血液を採取し、そこから血球を分
離し、分離血漿を免疫吸着カラム中で処理してＩｇＭな
らびにＩｇＭ関連複合体を除去し、そして、処理済み血
漿と血球を混合して患者に直接戻す操作を連続的に行う
ことによって可能である。また、ＩｇＭならびにＩｇＭ
関連複合体を一部分だけ除去する場合、血液の一定量を
採取して血球を分離した後、患者に直接その血球を再注
入することができる。分離血漿は、一つにまとめ、本発
明の免疫吸着カラムで処理し、続いて患者に出来る限り
早く戻すことができる。
ＩｇＭに対する抗体は、市販品を入手するか、以下のよ
うにして調製することができる。正常なヒトＩｇＭは、
従来の方法に従ってプール血清から得られ、これに対す
る抗体は、様々なを椎動物に精製ＩｇＭを注射して得ら
れる。通常、注射は前辺て作成した計画通りに繰り返し
て行う。そして、を椎動物からの血液採取は、力価およ
び特異性が向上した後、周期的な連続放血によって行う
。
ＩｇＭ抗原は、筋肉内、腹腔内、皮下注射等によって投
与することができる。通常、完全または不完全フロイン
ドアジュバントのような助剤を使用する。必要に応じて
、現在では古典的な手法となっているＫｏｈｌｅｒ−Ｍ
ｉｌｓｔｅｉｎ法（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉ＋ｕ＋ｕｎｏｌ
。
６　：５１１〜５１１　（１９７６））に従って調製し
得る。
固相シリカ・マトリクスには、実質上いかなる粒子状の
シリカも含まれる。例えば、コロイド様シリカ等の非晶
質シリカ、シリカゲル、ヒユームドシリカ、ケイ藻上等
の微結晶シリカ、水晶等の結晶質シリカ等が挙げられる
。シリカは、粒子サイズが約４５ないし１２０メツシュ
の範囲、一般には４５ないし６０メツシュの範囲のもを
使用するべきである。
例えば、免疫吸着剤の固相シリカ・マトリクスは、ケイ
藻土凝集体から生成するものが好ましい。
通常、ケイ藻土材は熔融温度以下で加熱して、あらゆる
残存有機物質を除去し、使用中の免疫吸着剤の破損およ
び分解が起きにくいように凝集体の表面を固化させる。
ケイ藻土材は、主として少量の他の鉱物例えば、酸化ア
ルミニウム、酸化カルシウム、酸化マグネシウム、酸化
第二鉄等を含有したシリカ（二酸化ケイ素）からなる。
通常、ケイ素土材には、シリカが少なくも８０重量％含
まれ、その他の鉱物を１種類で５重量％未満含有するも
のとする。ケイ藻土中に他の不純物が存在してもよいが
、それらが被検体液に対して非毒性および非分解性であ
ることに注意しなければならない。固相シリカ（ケイ藻
土）マトリクスとして特に適しているのは、Ｊｏｈｎｓ
−Ｍａｎｎｖｉｌｌｅ社から入社し得るクロモソルブ０
という商標のものである。
抗ＩｇＭ抗体を共有結合によって固相シリカ・マトリク
スにカフブリングさせるが、これは、マトリクスに水酸
基を導入して誘導体をつくり、この誘導体マトリクスを
臭化シアン（ＣＮＢｒ）と反応させて行う。なお、本発
明者によって、その他の方法で抗ＩｇＭ抗体をシリカ・
マトリクスに結合させても、シリカ・マトリクスに対し
て抗ＩｇＭ抗体の機能的活性型としての結合かはとんど
あるいは全く生じないので、効果のないことが明らかに
された。結合に関する様々なプロトコルの詳細、および
そのようなプロトコルによって得られる結果は、以降の
実施例の項目で詳しく説明する。
本発明のカンプリングに関するプロトコルの概略は、以
下の通りである。アミノ基および水酸基（更に、マトリ
クスの天然構造中に存在する水酸基）等の遊離表面基は
、適切なものであればいかなる方法によっても、これを
マトリクスの表面に導入することが可能である。例えば
、水酸基を導入するためには、シリカ・マトリクスを酸
で洗い、水で徹底的に濯いで、乾燥させることができる
。
酸で洗浄したシリカは、続いて５〜１０％のシラン、例
えば、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン、または
γ−グリシドキシプロピルトリエトキシシラン中で反応
させる。短時間のインキュベーションの後、通常は７５
℃にて約１〜５時間水で再び徹底的に洗浄し、一般に１
００℃の高温にて乾燥させる。
続いて、臭化シアンによるカンプリングを以下のように
行う。臭化シアンを水に溶かし、シリカ・マトリクスを
ｐＨ約１１−１１．５に調節した水に加える。
臭化シアン溶液をこのシリカ・マトリクス液に加え、混
合物をシリカ粒子が懸濁し続けるように一定速度で攪拌
する。ｐｎが安定化するまで、Ｎ　ａ　ＯＩｔを添加し
てこの値を１１．０〜１１．５に保つ。活性化したシリ
カ・マトリクスは、水で徹底的に洗って抗ＴｇＭ抗体溶
液と混合する。この際、ｐＨは８．５〜９．０の範囲に
調節し、混合物は数時間、一般には２〜１８時間２５℃
で維持する。カップリングが生じた後、このマトリクス
を水で徹底的に洗って乾燥させ、そして、ｐＨ３，５の
酸で１回洗浄して、共有結合しなかった抗体および酸に
不安定な結合抗体を除去する。続いて、シリカ・マトリ
クスは、最後の洗浄を水で行い、パイロジエンの存無を
調べる。
さて、第１図に示したごとく、免疫吸着剤の充填に適し
たカートリッジ１０の構造をこの通りに記載する。この
カートリッジは、シリンダー１２、一対の保持スクリー
ン１４、および一対の末端キャップ１６から構成されて
いる。各末端キャップ１６は、表面の一方をフランジ部
分１８が囲み、もう一方へコネクターニップル２０が突
き出ている。このコネクターニップルは、末端キャップ
１６を通って入口／出口２４となる軸方向の通過管２２
を形成している。シリンダー１２には、各端に環状の溝
２６が彫られている。各末端キャップ１６のフランジ部
分１８には、シリンダーの内面に合わせリング２８が嵌
まっており、キャップをシリンダー１２の端に重ねると
、環状の溝２６に結合するようになっている。各スクリ
ーン１４は、その周囲にガスケット３０が付いており、
カートリッジ１０を組み立てたとき、これが末端キャッ
プ１６とシリンダー１２との間のシール膜の役割を果た
す。カートリッジ１０を組み立るには、最初シリンダー
１２の末端にスクリーン１４を載せ、末端キャップ１６
をスクリーン１４に重ねて固定する。続いて、シリンダ
ー１２に上記の免疫吸着剤を充填し、残りのスクリーン
１４および末端キャップ１６を重ねて、カートリッジの
組み立て完成する。カートリッジ１０の寸法は重要では
なく、免疫吸着剤の所望量に応じて異なる。シリンダー
は、容積が約５０〜５００ｃｃの範囲であって、直径約
４〜８Ｃｆｆｌで長さ約５〜１０ｃｍのものが一般的と
言えよう。上記のように調製した適当量の免疫吸着剤を
含むカートリッジ１０で構成されるカラム１１（第２図
）は、一般にエチレノキシド等のガス滅菌剤で滅菌でき
、直ちに使用するか、または後の使用のために密封して
保存することができる。使用に先立って、カラム１１は
通常の生理食塩水で洗い、更に、ヘパリンを含む生理食
塩水、またはクエン酸塩・ブドウ糖含有抗凝固剤（ＡＣ
Ｄ）等の適切な抗凝固剤を含む生理食塩水で１回洗浄す
る。続いて、カラム１１を細胞分離装置４０　（第２図
）に接続し、そこから分離血漿を流入させることができ
る。細胞分離装置４０としては、１８Ｍ社にューヨーク
、アーモンク）から入手できる１８Ｍモデル１９９７等
の連続流入細胞分離装置を使用することができる。また
、この装置は、血漿および血液は通過させるが、血中の
細胞成分は通過させない半透膜が組み込まれているもの
でもよい。半透１漠を用いた場合、血液を膜に通過させ
るための血液輸送ポンプ４２が必要であろう。血液輸送
ポンプとしては、チューブおよび螺動式ポンプから成り
、ポンプの部分から血液を夾雑させないように分離でき
る装置が望ましい。血液は、流速約１０〜２０　ｔａｌ
　／ｍｉｎの範囲で細胞分離装置４０通過させる。通常
、約２１の血液が全量通過するまで処理を行う。続いて
、処理カラム１１を通過した血漿を血球と混ぜ、患者に
このＬ［［Ｌ液を戻す。ある。一般に、マイクロフィル
ター４４の処理カラムの出口に付け、障害となる大きさ
の粒子がカラム１１から流出しないようにする。
〔実施例〕
１、ヒトＩ　Ｍに　−る 正常ヒトＩｇＭを、Ｂａ１ｉｎＬら、　　（１９８６）
　Ｉｍｍｕｎｏｌ。
Ｃｏｎ＋ｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　ｌｏ：５３３に記載
の方法に従って血清から単離した。５ｍＺの血清をＧ−
２００カラムクロマトグラフィ−［リン酸緩衝生理食塩
水（ＰＢＳ）　　、ｐＨ７，５を通した３、　５　Ｘ　
９５　Ｃｍのカラム］にかけ、排除体積分画を固定化タ
ンパクＡと共にインキュベーションした。タンパクＡ・
カラムを緩衝生理食塩水で徹底的に洗い、結合したＩｇ
Ｍは酸ＰＢＳ（ｐＨ２，５）で溶離した。溶離ＩｇＭを
中和し、その純度を二重免疫拡散法およびポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）法を用いて確認した。
精製ヒトＩｇＭに対する抗血清は、Ｂａ１ｉｎｔ。
（１９８２）　Ｅｘｐ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　４７：７
０に記載の方法に従って、３匹のウサギの免疫処理によ
って作成した。
ヒト免疫グロブリン軽鎖反応性を除外するため、ウサギ
抗血清を、セファロース９４Ｂに結合した精製ヒ）Ｉｇ
Ｇに吸着させた。続いて、ヒ）ＩｇＭのμ鎖に対するウ
サギ抗体を、セファロース０４Ｂに結合した精製ヒトＩ
ｇＭとの吸着によりアフィニティーを精製した。アフィ
ニティ精製された結合したウサギ免疫グロブリンは、酸
ＰＢＳ（ｐＨ２，５）で溶出し、中和して濃縮した。ア
フィニティー精製したウサギ抗体は、正常ヒト血清と反
応して単一沈降線を示し、精製ヒトＩｇＭと同定できる
線を形成した。ヒトＩｇＧとの反応は生じなかった。ア
フィニティー精製で得られたウサギ抗血清の解析は、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動解析によって行い、カサ
ギＩｇＧのγ鎖および軽鎖と判明した。
アフィニティー精製したヤギＩｇ抗体は、カッペルラボ
ラトリーズ社より購入した。カッペル抗体の解析によれ
ば、これは正常ヒト血清と反応して単一沈降線を示し、
精製ヒトＩｇＭと同定できる沈降線を形成したが、ヒト
■ｇＧとは反応しなかった。ヒトＩｇＭのμ鎖も、シグ
マケミカル社より購入した。ヒトμ鎖に対するシグマ抗
体は、セファロース９４Ｂに結合した精製ヒトＩｇＭに
よる吸着を利用して、更にアフィニティー精製した。二
重免疫拡散法での試験によれば、シグマＩｇＧは正常ヒ
ト血清と反応して単一沈降線を示し、精製ヒトＩｇＭと
同定できる沈降線を形成した。しかし、精製ヒトＩｇＧ
とは反応しなかった。
２、頂上」２仁［だ 以下の実施例で使用したシリカ・マトリクスは、酸で洗
浄したＪｏｈｎｓ−Ｍａｎｖｉｌｌｅ社のりｔｌ１７ソ
ルブＯＰ、　ＮａＣ５８８９であった。
３、ｆ　士人カップリング・プロトコルａ．グルタルア
ルデヒド・カップリングシリカ・マトリクスを１０％の
Ｔ−アミノプロピルトリエトキシシランに加え、ｐＨを
３．０に調節した。この混合物をｐＨ７で８０℃にて１
時間加熱し、水で洗い、１１５℃にて一晩乾燥させた。
シリカ・マトリクスは、ｐｔｔ７．ｏの２．５％のグル
タルアルデヒド溶液中において２５℃で１時間インキュ
ベーションしながら、活性化した．インキュベーション
の後、シリカ・マトリクスを水で徹底的に洗浄し、ｐＨ
１．０の抗体と共にｐＨ７．０にて１時間インキュベー
ションした。結合した抗体の量を測定し、シリカ・マト
リクスは水で徹底的に洗った。
ｂ．カルボジイミドによるカップリングシリカ・マトリ
クスを上記のように調製し、そのＩｇに５％曙の抗体お
よび５０■の１−ソクロヘキシル１−３　（２−モルフ
ォリノエチル）−カルボジイミドメト−ｐ−トルエンス
ルフォネートを加えた。ｐＨを３．５に調節し、混合物
を２５℃にて１８〜２２時間攪拌した。インキュベーシ
ョンの後、結合抗体を定量し、シリカ・マトリクスは水
で徹底的に洗浄した。
Ｃ．臭化シアンによるカップリング シリカ・マトリクスは上記の通りに調節し、シリカ１ｇ
に対して臭化シアン５〜１０ｇによって活性化した。そ
して、ｐＨを１１〜１１．５で定常状態に達するまでこ
の値を保った。水でシリカ・マトリクスを徹底的に洗っ
てから、シリカ１■に対して抗体５■を添加した。そし
て、ｐＨを８．６に調節して、この混合物を２５℃にて
２〜１８時間攪拌した。インキュベーションの後、結合
抗体を定量し、シリカ・マトリクスは水で徹底的に洗浄
した。
４、共有結合試験の結果 まず、前記２つのカップリング法を、抗μ鎖ウサギ抗体
産生時の副産物として得れる精製ウサギ抗軽鎖抗体のカ
ップリング・アフィニティーに関して比較した。両手法
において、抗体（１，７２５■）をシリカにカップリン
グさせ、精製ヒトＩｇＧの結合性を測定して評価した。
小カラムに抗軽鎖抗体のカップリングしたシリカ（１ｇ
）を充填し、ヒト■ｇＧとインキュベーションした。抗
体がカップリングしていないシリカ（１ｇ）のカラムも
、ヒトＩｇＧとインキュベーションした。各カラムを洗
浄し、結合したＩｇＧをグリシン塩酸、　ｐＨ２，５で
溶離した。溶離１ｇＧの量は、ローリ−ら（Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ、　Ｃｈｅａｐ、　（１９５１）　１９３：２６５）
の方法で測定した。その結果を第１表に示す。
星上表 ｆ（：＋：Ａ　　カ・・ブ電ング監企上ｌ旦グルタルア
ルデヒド法　　　　　　１．６８■カルボジイミド法　
　　　　　　　０．６６■対照シリカ　　　　　　　　
　　　１．８０■第１表の結果から明らかなように、カ
ラムへのヒトＩｇＧの特異的結合は全く認められなかっ
た。
しかし、抗軽鎖抗体の機能性は、二重免疫拡散法により
正常ヒト血清および精製ヒトＩｇＧとの沈降線の形成か
ら確かめられた。従って、これらの結果によれば、カル
ボジイミド・カップリング法またはグルタルアルデヒド
・カップリング法は、シリカ・マトリクスに対する機能
的活性抗体の結合に適切であるとの推測が可能である。
上記の結果を確認するために、ＩＭＲＥ社（ワシントン
州、シアトル）から入手した精製連鎖球菌タンパクＡ（
ＳｐＡ）を用いて、追加の試験を行った。グルタルアル
デヒド法およびカルボジイミド法の両方によって、Ｓｐ
Ａをシリカに結合させた。ＳｐＡは、哺乳類ＩｇＧのＦ
ｃ領域に結合するため、シリカにカップリングした産物
の機能性を評価する上で有効な試薬と言える。ＳｐＡの
カップリングしたシリカを小カラム（１ｇ）に充填し、
ヒトＩｇＧとインキュベーションした。続いて、カラム
をＰＢＳで徹底的に洗い、結合したＩｇＧをグリシン塩
酸（ｐｔｌ　２．５　）で溶離した。溶ｉ＠ｔ１ｇＧの
量は、ローリ−ら（上記）の方法に従って測定した。そ
の代表的結果を第２表に示す。
玉１表 丑　Ｕ　　カ・・ブ■ング　　　　肱合上■旦グルタル
アルデヒド法 （１，７９■　５ｐＡ）　　　　　　　　５．４０■カ
ルボジイミド法 （１，９６■　５ｐＡ）　　　　　　　　２．２８■対
照シリカ　　　　　　　　　　　１．８０ａｇ第２表か
ら、グルタルアルデヒド・カップリング法が、免疫吸着
剤の機能的活性を保つ方法であることが分かる。この結
果に基づいて、グルタルアルデヒド・カップリング法が
、本発明の抗ＩｇＭ抗体免疫吸着剤の調製に適した方法
かどうか更に検討した。
一連の試験において、グルタルアルデヒド法でＩｇＧを
シリカにカップリングさせたところ、そのカップリング
効率は、１０％〜９２．５％の範囲にばらついているこ
とが分かった。この変動性は、カップリング反応でのタ
ンパク対シリカの比と見かけ上関係していない（１０：
　１　、８　：　ｌ　、６．４：１　。
４．８：１，４：１．および３．５：　１の各比）。更
に、この結果は、９５％を上回るカップリング効率が常
に得られる、シリカへのＳｐＡのカンプリングとは対照
的である。
続いて、グルタルアルデヒド法を用いた２つの別個の試
験で、アフィニティー精製したウサギの抗−ヒトμ鎖１
ｇＧをシリカにカップリングさせた。それぞれのカップ
リング効率は、４６．６％および５７．９％であった。
抗体がそれぞれ１．９５■Ｓおよび２．７５１ＮＳ含ま
れるように、ウサギの抗−ヒトμ鎖１ｇＧ／シリカを充
填した小カラム（１ｇ）を組み立てた。各カラムおよび
１ｇの活性シリカのみを含む対照カラム中で、１ｍｌの
正常ヒト血漿をインキュベーションした。カラムをＰＢ
Ｓで徹底的に洗浄し、酸ＰＢＳ　（ｐＨ２，５）で溶出
した。その溶出液を中性に調節して濃縮したのち、タン
パり濃度を上記の方法によって測定した。溶離液のＰＡ
ＧＥ分析によれば、総ての試料において同一のポリペプ
チドパターンが得られた。主要ポリペプチドの位置は、
血清アルブミン、およびＩｇＣ。
のＴ鎖ならびに軽鎖に対応していた。ヒト・アルブミン
およびＩｇＧに相当する２つの主要タンパクの存在は、
二重免疫拡散法によってＴ１！認された。
ＩｇＭは、二重免疫拡散法では検出されなかった。
比較対照試験において、ウサギの抗−ヒトμ鎖ＩｇＧを
臭化シアンで活性化したセファロース０６ＭＢにカップ
リングさせた。■−の正常ヒト血漿を、小カラムおよび
非カップリング・アガロースを含む対照カラム中でイン
キュベーションした。
カラムは、ＰＢＳで徹底的に洗浄し、酸ＰＢＳ。
ｐＨ２，５で溶離した。そして、溶離液を中性にして濃
縮した。抗体カラムから得られる溶離液中でのＩｇＭは
、その存在が二重免疫拡散法によって確認できたが、対
照カラムからのものは確認されなかった。従って、グル
タルアルデヒド法では、１８Ｍ除去のために抗ＩｇＭ抗
体をシリカに結合させて、機能的活性を維持することは
出来ないように思われる。
抗ＩｇＭ抗体のシリカへのカップリングに臭化シアンを
使う方法の妥当性を評価するために、ヒトμ鎖に対する
ヤギのＩｇＧ抗体をアフィニティー精製してシリカにカ
ップリングさせ、５つの別個の試験を行った。カップリ
ング効率は６０％〜９７％の範囲に分布し、シリカ１ｇ
当たりの抗体の結合量は、２．７９〜５．３３ＩＩＩｒ
であった。シリカにカップリングしたヤギＩｇＧ抗体を
充填した小カラム（２ｇ）を作製し、ＰＢＳを徹底的に
洗浄した後、正常ヒト血清（０，７ｃｃ）とインキュベ
ーションした。インキュベーション（２５℃にて５分）
を終えたのち、集めた血清を最初の出発容量まで濃縮し
、前記のＢａ１ｉｎｔ　（１９８２）が記載した陰圧透
析法によってタンパク濃度を調節した。この方法によっ
て、７つの血清試料を免疫吸着剤マトリクスとインキュ
ベーションし、免疫吸着剤に対する最大結合能を測定し
た。カラムをＰＢＳで徹底的に洗浄し、そして、結合タ
ンパクを酸ＰＢＳ、ｐＨ２，５で溶離し、中性にしてｔ
ａｍした。免疫吸着の前後における血清中のＩｇＭ量は
、Ｍａｎｃｉｎｉ　ら（Ｉｎｕ＋＋ｕｎｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ　２：２３５　、１９６５）の方法によって測定
した。その結果を第３表に示す。
第１麦 Ａ　　　　　１１２　　　　４８　　　　５７Ｂ　　　
　　２０５　　　１５０　　　　２７Ｃ１５０７８４８ Ｄ　　　　　２８０　　　１１２　　　　６０Ｅ　　　
　　２８０　　　　　０　　　１００Ｆ　　　　　３５
０　　　１１２　　　　６８Ｇ　　　　　　６７　　　
　３１　　　　５４第３表から明らかなように、ＩｇＭ
レベルの有意な低下が生じていた。更に、追加試験を行
って、カラム溶離液中におけるヒトＩｇＭの存在を免疫
化学的に評価した。ＰＡＧＥ分析によれば、免疫吸着剤
カラムから得られる溶離液中のヒｌ−ＩｇＭのμ鎖およ
び軽鎖に対応するポリペプチド鎖の存在が認められた。
また、二重免疫拡散法によると、免疫吸着剤カラムから
得られる溶離タンパク中にＩｇＭの存在が確認できたが
、対照カラムからのものではそれを確認できなかった。
これらの結果から、抗ＩｇＭ抗体免疫吸着剤マトリクス
は、免疫吸着アフィニティー精製カラムクロマトグラフ
ィー用への開発が可能であり、十分使用し得るものであ
ることが示された。
原発性胆汁性肝硬変（Ｐ　Ｂ　Ｃ）患者からの血清中に
存在するＩｇＭレベルを調べるために試験を実施した。
健常者の設計およびＰＢＣ患者の血清中のＩｇＭレベル
を、上記Ｍａｎｃｉｎｉ　らの方法によって測定した。
極めて高いＩｇＭレベルがＰＢＣ患者の血清試料中に検
出され、ＰＢＣの免疫病理的特徴が示された。
更に、抗−ヒトμ鎖ＩｇＧ／シリカ・カラムを使えば、
ＰＢＣ患者からの病的血清中におけるＩｇＭレベルが低
下するかを調べるための試験を実施した。抗−ヒトμｔ
ｌＩｇＧ／シリカを充填した小カラムを作製し、ＰＢＣ
で洗浄してから、健ｉ１またはＰＢＣ患者の血清とイン
キュベーションした。インキュベーション終了後、血清
を集めて出発容量まで濃縮し、前記の陰圧透析法によっ
てタンパク濃度を調節した。免疫吸着の前後における血
清中のＩｇＭｌは、上記のＭａｎｃｉｎｉ　らの方法に
よって測定した。これらの結果を第４表に示す。
以下余白 １−表。
Ａ　　　　　　４５００　　　　　５８０　　　　　　
８７Ｂ　　　　　　　６００　　　　　　　　０　　　
　　１００Ｃ１８５０２１５８８ Ｄ　　　　　　　４５０　　　　　１１２　　　　　　
７５Ｂ　　　　　　　３８５　　　　　１２８　　　　
　　６７Ｆ　　　　　　１０５０　　　　　２８０　　
　　　　７３Ｇ　　　　　　　８５０　　　　　３６０
　　　　　　５８上記の表から、ＰＢＣ患者の血清中に
おけるＩｇＭレベルは、有意に低下したことが分かる。
免疫吸着剤マトリクスの特異性を評価するために、追加
試験を実施した。ＰＢＣ患者の血清試料を、抗−ヒトμ
鎖抗体またはＳｐＡでカップリングしたシリカ・マトリ
クスと共にインキュベーションした。インキュベーショ
ン終了後、血清を集めて出発容量まで濃縮した。免疫吸
着実施の前後における血清中のＩｇＭ量を、上記のＭａ
ｎｃｉｎｉ　らの方法によって測定した。その結果、抗
ＩｇＭ抗体免疫吸着剤でインキュベーション後では、Ｉ
ｇＭレベルの顕著な低下が認められたが、ＳｐＡ／シリ
カ・マトリクスで処理したものでは、それは認められな
かった。
上記の抗ＩｇＭ抗体免疫吸着剤を使用して、更に別の試
験を実施し、免疫吸着実施の前後における血清中の免疫
複合体（ＩＣ）レベルを測定した。
なお、この測定は、Ｂａ１ｉｎｔら（Ｃａｒｒｃｅｒ　
Ｒｅｓ、　４４　ニア２４、１９８４）の記載する固相
Ｃ１ｑ結合性１ｇＧアッセイ法によって行った。この結
果を第５表に示す。
以下余白 １Ｌト表２ 試料　　　　　　　ヨｌ五−士エツメ−低下Ｘ正常ヒト
血清プール　　２２．２±５．０−吸着前ＰＢＣ試料Ａ
　　　３７．０±２．６−吸着後ＰＢＣ試料Ａ　　　２
２．２：ｉ：２．５（ｐ＜０．０１）　　４０％吸着前
ＰＢＣ試料Ｂ　　　２１．２±１．８−吸着後ＰＢＣ試
料Ｂ　　　１６．９　＋　１．２（ｐ＜０．０１）　　
２０％第５表から、ＰＢＣ患者の血清中におけるＩＣレ
ベルの有意な低下が認められるが、これは、免疫吸着剤
カラムによって免疫複合体が除去されることを示してい
る。
５、マトリクスの安定法 シリカ・マトリクスにカップリングした抗μ鎖抗体の安
定性を調べるために、前記のＭｃＣｏｎａｂｅｙ・Ｄｉ
ｘｏｎ　　法　（Ｉｎｔ、　　八ｒｃｈ、　　八ｌｌｅ
ｒｇｙ　　Ａｐｐｌ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ。
２９　：　１８５．１９６６）の変法を用いた試験を実
施した。
精製したウサギＩｇＧを、ＩｇＧ１ｎｇ当たりの平均比
活性が９２８ｃｐｎ＋となるように１２５１で放射線標
識した。１０躍のＩＺｓＩを６．５■の未標識ウサギＩ
ｇＧと混合し、臭化シアン法を用いてシリカ２ｇにカッ
プリングさせた。放射線標識タンパクおよび全タンパク
の結合量は、それぞれ９６．１％および９９．５％であ
った。カップリング終了後、ｒｇＧ／シリカを徹底的に
洗って乾燥させた。１ｇのＩｇＧ／シリカ（放射線盟約
４．６４　Ｘ　１０’ｃｐｍ）を充填した小カラムを作
製し、再水和してから４０−のＰＢＳで洗浄した。ｌ−
の正常ヒト血漿をこのカラムに添加し、２５℃にて５分
間シリカ・マトリクスとインキュベーションした。そし
て、カウント数が定常状態のベースラインレベルに達す
るまでの分画（１２分画）を集めた。１ＩｔＪ　１　ｇ
にの非活性に基づいて全カウント数を合計すると、４〜
５ｎｇのＩｇＧが血漿中に放出されたものと推定できた
。これは、シリカにカップリングした標識ＩｇＧの約０
．０９％に値する。これらの結果から、高い安定性を有
する免疫吸着剤マ）　ＩＪクスが、本発明のカップリン
グ法によって調製されることが示された。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の免疫吸着カラムの分解組み立て図で
ある。第２図は、本発明に基づいて組み立てた体外血液
処理システムを示す模式図である。 １０・・・カートリジ、　　　工２・・・シリンダー、
１４・・・保持スクリーン、 Ｉ６・・・末端キャップ、 ２０・・・コネクターニップル、 １１・・・カラム、 ４２・・・血液輸送ポンプ、 ４０・・・細胞分離装置。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、遊離水酸基をシリカ・マトリクス上に導入すること
    、該水酸基をｐＨ１１．０ないし１１．５の範囲におい
    て臭化シアンの存在下にシリカ・マトリクス上で活性化
    すること、および活性化シリカ・マトリクスを抗ＩｇＭ
    抗体と反応させて抗体を活性化シリカ・マトリクスに共
    有結合されることを含んで成る、体液よりＩｇＭならび
    にＩｇＭ関連複合体を除去するために有効な免疫吸着剤
    の製造法。 ２、前記シリカ・マトリクスが非晶質シリカである特許
    請求の範囲第１項記載の方法。 ３、前記非晶質シリカがケイ藻土である特許請求の範囲
    第１項記載の方法。 ４、前記水酸基がシランとの反応で導入される特許請求
    の範囲第１項記載の方法。 ５、前記シランがγ−アミノプロピルトリエトキシシラ
    ンである特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６、前記ケイ藻土が４５ないし６０メッシュの大きさで
    ある特許請求の範囲第３項記載の方法。 ７、遊離水酸基をｐＨ１１．０ないし１１．５の範囲に
    おいて臭化シアンの存在下にシリカ・マトリクス上で活
    性化すること、および活性化シリカ・マトリクスを抗Ｉ
    ｇＭ抗体と反応させて抗体を活性化シリカ・マトリクス
    に共有結合されることを含んで成る製造方法によって製
    造される、体液よりＩｇＭならびにＩｇＭ関連複合体を
    除去するために有効な免疫吸着剤。 ８、臭化シアンで活性化した水酸基を介してシリカ・マ
    トリクスに共有結合されたＩｇＭ抗体を含んで成る、Ｉ
    ｇＭならびにＩｇＭ関連複合体を体液から除去するため
    に有用な免疫吸着剤。 ９、前記水酸基をγ−アミノプロピルトリエトキシシラ
    ンとの反応によってシリカ・マトリクスに導入する特許
    請求の範囲第８項記載の免疫吸着剤。 １０、前記シリカ・マトリクスが非晶質シリカである特
    許請求の範囲第８項記載の免疫吸着剤。 １１、前記非晶質シリカがケイ藻土である特許請求の範
    囲第１０項記載の免疫吸着剤。 １２、前記ケイ藻土が４５ないし６０メッシュである特
    許請求の範囲第１１項記載の免疫吸着剤。 １３、入口および出口を有し、その間にチャンバーが構
    成されている封入器、および該チャンバー内に充填され
    、臭化シアンで活性化した水酸基を介してシリカ・マト
    リクスに共有結合されたＩｇＭ抗体を含んで成るＩｇＭ
    ならびにＩｇＭ関連複合体を体液から除去するために有
    用な免疫吸着剤を有する、体液からＩｇＭならびにＩｇ
    Ｍ関連複合体を除去するための装置。
JP62292201A 1986-11-21 1987-11-20 抗−ヒトＩｇＭ免疫吸着剤およびその製造方法 Pending JPS63197462A (ja)

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