JPH0332740A - 生理活性物質固定化吸着剤の製造方法および製造用キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は生理活性物質固定化吸着剤の製造方法および生
理活性物質固定化吸着剤製造用キットに関する。

本発明によって得られる生理活性物質固定化吸着剤は、
固定化された生理活性物質が有する活性を利用して、体
液を浄化することにより疾病を治療するための医療用吸
着剤、目的物質を分離取得するためのアフィニティーク
ロマトグラフィー用吸着剤などとして有用である。

〔従来の技術〕

特開昭６４−６８３９８号公報には、重症筋無力症の病
因物質であると考えられているニコチン性アセチルコリ
ンレセプターに対する自己抗体を吸着することが可能な
吸着剤の製造方法として、臭化ンアンで活性化されたア
ガロース粒子に、ニコチン性アセチルコリンレセプター
に特異性を有するモノクローン抗体に特異的なモノクロ
ーン抗イデイオタイプ抗体を塩化ナトリウムおよび炭酸
水素ナトリウムをそれぞれ０．５モル／ｌおよび０．１
モル／ｌの濃度で含有する水溶液（ｐＨ：８．３）中に
おいて固定化し、得られた該モノクローン抗イデイオタ
イプ抗体が固定化されたアガロース粒子をグリ７ンを含
有するリン酸塩緩衝液で処理したのちリン酸塩緩衝蔽で
洗浄することからなる方法。

ならびにスクンンイ□ドオキシカルボニル基で活性化さ
れたセルロース粒子に、上記のものと同様のモノクロー
ン抗イデイオタイプ抗体を１０ミリモル／ｌのリン酸塩
緩衝液ＣＦ４−１７７．４＞中で固定化し、得られた該
モノクローン抗イデイオタイプ抗体が固定化されたセル
ロース粒子をリン酸塩緩＠液で洗浄することからなる方
法が記載されている。

活性・エステル基を有するアガロース粒子にタンパク質
などのアミン基を有するリガンドを固定化してなるアフ
ィニティークロマトグラフィー用吸着剤の製造方法とし
て、該粒子にリガンドを炭酸水素ナトリウムおよび塩化
すｌ−ＩＪウムをそれぞれ０．１モル／ｌおよび０．５
モル／ｌの濃度で水に溶解させてなる炭酸塩緩衝液（Ｆ
ｌ（：８）中で固定化し、得られたりガントが固定化さ
れたアガロス粒子をエタノールアミン水溶液またはトリ
ス塩酸緩衝液を用いてブロッキングしたのち、トリスお
よび塩化ナトリウムをそれぞれ０．１モル／ｌおよび０
．５モル／ｌの濃度で水に溶解させてなるトリス緩衝液
（Ｆ４（：８）と酢酸もしくはギ酸および塩化す）　Ｉ
Ｊウムをそれぞれ０．１モル／ｌおよび０、５モル／ｌ
の濃度で水に溶解させてなる酢酸緩衝液またはギ酸緩衝
液（田＝４）とで４〜５回交互に洗浄することからなる
方法が知られている。

また、エポキシ基で活性化されたアガロース粒子にコリ
ン、糖などの水酸基、アミノ基またはメルカプト基を有
するリガンドを固定化してなるアフィニティークロマト
グラフィー用吸着剤の製造方法として、該粒子にリガン
ドを溶媒中で固定化し、得られたリガンドが固定化され
たアガロース粒子を１モル／ｌのエタノールアミン水溶
液を用いてブロッキングしたのち固定化において使用し
たものと同じ溶媒で洗浄し、さらに酢酸および塩化ナト
リウムをそれぞれ０．１モル／ｌおよび０．５モル／ｌ
の濃度で水に溶解させてなる酢酸緩衝液（Ｆ＋Ｉ：４．
０）とホウ酸および塩化ナトリウムをそれぞれ０．１モ
ル／１および０．５モル／ｌの濃度で水に溶解させてな
るホウ酸緩Ｆｌｕ（：８．０）とで交互に洗浄すること
からなる方法が知られている。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記の特開昭６４−６８３９８号公報に記載された製造
方法に従って得られる吸着剤では、使用中に固定化され
たはずのモノクローン抗イデイオタイプ抗体がわずかな
がら吸着剤から遊離する場合があることが判明した。か
かる吸着剤を治療用吸着剤として使用する場合には、モ
ノクローン抗イデイオタイプ抗体の遊離をできるだけ抑
制することが安全上望ましいことから、かかる吸着剤を
さらに充分な洗浄処理に付することか必要である。

一方、上記の活性エステル基またはエポキシ基を有する
アガロース粒子にリガンドを固定化してなるアフィニテ
ィークロマトグラフィー用吸着剤の製造方法によって得
られる吸着剤においても、使用中に固定化されたはずの
リガンドがわずかながら吸着剤から遊離する場合がある
ことが判明した。かかる吸着剤をアフィニティークロマ
トグラフィー用吸着剤として使用する場合には、目的物
質へのリガンドの混入を防止するためにリガンドの遊離
をできるだけ抑制することが望筐しく、また、かかる吸
着剤を治療用吸着剤に応用する場合でも、リガンドの遊
離をできるだけ抑制することが安全上望ましい。

しかして、本発明の１つの目的は、生理活性物質の遊離
量が極めて少ない生理活性物質固定化吸着剤を簡便な操
作で製造する方法を提供することにある。本発明の他の
１つの目的は該生理活性物質固定化吸着剤を容易に製造
するためのキットを提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明によれば上記の目的は、生理活性物質を活性基を
有する担体に共有結合法によって固定化させ、得られた
生理活性物質固定化担体を必要によυブロッキング剤と
接触させたのち、ｐＨが３，５以下の緩衝液とｐＨが５
．５以上の緩衝液とで交互に洗浄することを特徴とする
生理活性物質固定化吸着剤の製造方法を提供することに
よって達成され、また活性基を有する担体、ｐＨが３．
５以下の緩衝液およびｐＨが５．５以上の緩衝液からな
る生理活性物質固定化吸着剤製造用キットを提供するこ
とによって達成される。

生理活性物質は、酵素活性、抗原抗体反応活性などの生
理活性を有する核酸、タンパク質、ホルモン、脂質、糖
類およびそれらの複合物；アミノ酸；ペプチドなどを意
味し、該生理活性物質としては、酵素、補酵素、抗体、
抗原、抗原抗体複合物、補体、ハプテン、組織、細胞な
どが使用される。生理活性物質の具体例としては、ウシ
胸腺ＤＮＡ、抗β２−ミクログロブリン抗体、インシュ
リン、血液型抗原、トリプトファン、フ・エニルアラニ
ン、スーパーオキシドジスムターゼ、補酵素Ｑ、ＤＮＡ
−抗ＤＮＡ抗体、Ｃ１ｑ、ペニシリンなどが挙げられる
。生理活性物質は活性中心、基質結合部位などの活性の
発現に直接関係している部分を有しているが、それ以外
の部分にアミノ基、水酸基、メルカプト基などの官能基
を有している。

担体が有する活性基とはこれらの生理活性物質が有して
いる官能基と反応して共有結合を形成しうる基であり、
該活性基としてはスクンンイミドオキンカルボニル基、
ｐ−ニトロフェニルオキ７カルボニル基、ジニトロフェ
ニルオキ７カルボニル基、ペンタフルオロフェニルオキ
シカルボニル基。

トリクロロフェニルオキンカルポニル基、ペンタクロロ
フェニルオキンカルボニル基ｆｒ、ト（Ｄ活性ｆ−ステ
ル基；エボキン基；ホルミル基などが例示される。これ
らの活性基の中でも生理活性物質が有するアミノ基と反
応して強固なアミド結合を形成しうる活性エステル基が
好１しく、活性エステル基の中でもスクンンイミドオキ
７カルボニル基が、これと生理活性物質との反応によっ
て脱離するＮ−ヒドロキンコハク酸イ□ドが担体から除
去され易い点から特に好ましい。担体が有する活性基の
濃度は、生理活性物質の固定化率を高めるために、湿潤
状態の担体１２あた。り３Ｘ１０　　モル以上であるこ
とが好壕しく、１×１０〜５Ｘ１０　モルの範囲内であ
ることがよう好筐しい。活性基を有する担体は親水性の
表面を有する多孔性の水不溶性物質であることが生理活
性物質の固定化率が高く、！た得られた吸着剤の吸着性
能が優れることから望ましい。担体の形状としては、特
に限られるものでなく、粒子状、フィルム状、中実繊維
状、中空繊維状などが例示されるが、カラムに充填して
使用される吸着剤を製造する目的においては、カラムに
流通させる液体の抵抗が小さいことから球形の粒子状が
好ましい。担体としては、例えば、ＣＭ−セルロファイ
ンＣＨ（生化学工業株式会社販売）ナトのセルロース系
担体；　ＣＭ−）コパール６５０Ｃ（東ソー株式会社製
）などのポリビニルアルコール系担体；ＣＭ−）リスア
クリルＭ（ＣＭ　−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　Ｍ　）　（ス
ウェーデン国ファルマン７−ＬＫＢ　（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ−ＬＫＢ　）社製〕などのポリアクリルアミド系担
体；セルロース系担体　４　Ｂ　（５ｅｐｈａｒｏｓｅ
　ＣＬ　−４Ｂ　）　、アクチベーテツドＣＨ−セフ７
ｏ−ス４Ｂ（ＡｃｔｉｖａｔｅｄＣＨ−５ｅｐｈａｒｏ
ｓｅ　４　Ｂ　）　、ｘポキンーアクチベーテツド＊　
７７　ａ　−ス６　Ｂ　（Ｅｐｏｘｙ　−ａｃｔｉｖａ
ｔｅｄ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ）〔いずれもスウェー
デン国ファルマンアーＬＫＢ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−
ＬＫＢ　）社製〕などのアガロース系担体などの有機質
担体；およびＣＰＧ−１０−１０００（平均細孔径：１
１００ｎ；米国エレクトロ一二ュークレオニクス（Ｅｌ
ｅｃｔｒｏ　−ｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ）社製〕などの多
孔性ガラスなどの無機質担体が挙げられる。これらの担
体の中でもセルロース系担体が、機械的強度が高く、耐
酸性および耐アルカリ性に優れ、微生物による分解を受
けに＜＜、かつ低毒性であることが好ましい。

生理活性物質の活性基を有する担体への固定化は通常の
方法に従って行うことができ、リン酸塩緩衝液、炭酸塩
緩衝液などの緩衝液中で行うのが好筐しい。緩衝液とし
ては、ｐＨが５．５〜８．５の範囲内であり、かつ塩の
濃度が１００ミリモル／を以下であるものを使用するこ
とが、固定化操作中における活性基の失活および生理活
性物質の失活が抑制される点から好ｌしい。緩衝液中に
含壕れる塩としては、リン酸２水素ナトリウム、リン酸
水素２ナトリウム、リン酸２水素カリウムなどのリン酸
塩；炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム。

炭酸カリウムなどの炭酸塩；塩化ナトリウムなどが、活
性基を失活させないことから望ましい。

このようにして得られた生理活性物質固定化担体には、
通常未反応の活性基が残存しているため、該担体は必要
により、未反応の活性基と反応して該活性基を失活させ
ることが可能なブロッキング剤と接触させる。ブロッキ
ング剤は、活性基の種類に応じて任意に選択され使用さ
れる。例えば、活性基が７ミノ基と反応しうるものであ
る場合には、ブロッキング剤としてグリ７ン、エタノー
ルアミン、トリスなどのアミ７基を有する化合物が使用
される。生理活性物質固定化担体とブロッキング剤との
接触は通常の方法に従って行うことができ、一般に緩＠
液中で行われる。かかる緩＠液としては、特に限定され
るものでないが、グリンン塩酸緩衝液、トリス塩酸緩衝
液などが例示される。緩衝液中のブロッキング剤の濃度
は、５０ミリモル／を以上であることがブロッキング剤
と活・性基との反応が速やかに進行することから望！し
い。ブロッキング剤の濃度が高すぎる場合には未反応の
ブロッキング剤が多量に残存することになるので、該濃
度は７０〜１０００ミリモル／ｌの範囲内であることが
より好ましい。緩衝液としては、ブロッキング剤を含有
する状態において、ｐＨが５．５〜８．５の範囲内であ
シ、かつ塩の濃度が２００□リモル／を以上であるもの
を使用することが、固定化された生理活性物質の失活が
抑制され、さらにブロッキング剤と活性基との反応が速
やかに進行することから望ましい。ここで、上記のブロ
ッキング剤を含有する状態での緩衝液中の塩の濃度は、
グリ７ンのように系中で塩を形成するブロッキング剤を
使用する場合にはそのブロッキング剤から誘導される塩
の濃度を含んだものである。生理活性物質固定化担体と
ブロッキング剤とは充分な時間にわたって接触させるの
が、未反応の活性基のブロッキングが完全となることか
ら望筐しい。この観点から、生理活性物質固定化担体を
ブロッキング剤と緩ＷＩ液中で約１５分間〜約２０時間
にわたって接触させるのが好ましい。

なお、生理活性物質固定化担体中の未反応の活性基のブ
ロッキングは、次に説明する洗浄工程においてブロッキ
ング剤を含有する洗浄液を使用することによって洗浄操
作と同時に行うことが可能であるが、ブロッキングを完
全に行うためには、洗浄に先立って生理活性物質固定化
担体をブロッキング剤と充分な時間にわたって接触させ
ることが好ましい。

このようにして得られた生理活性物質固定化担体の洗浄
には、ｐＨが３．５以下の緩衝液とｐＨが５．５以上の
緩衝液が洗浄液として使用される。

ｐＨが３．５以下の緩衝液の代シにｐＨが３．５よう高
い緩衝液を使用する場合およびｐＨが５．５以上の緩＠
液のオン結合によって担体に結合している生理活性物質
などの共有結合によって担体に結合している生理活性物
質以外の生理活性物質が担体から遊離しに〈＜、洗浄操
作を数多く繰り返して行うことが必要となるため好１し
くない。洗浄能力が高く、筺た担体に共有結合を介して
固定化された生理活性物質の失活を抑制しうる点から、
洗浄液としてはｐＨが１．５〜３．０の範囲内の緩衝液
とｐＨが６．０〜８．５の範囲内の緩衝液を使用するの
が好オしい。

Ｐｌ″Ｉが３．５以下の緩衝液としては、特に限定され
るものでないが、グリンン塩酸緩衝液、ギ酸緩＠液など
が例示される。またＦ４′Ｋが５．５以上の緩衝液とし
ては、特に限定されるものでないが、リン酸塩緩衝液、
炭酸塩緩衝液などが例示される。ｐＨが３．５以下の緩
衝液およびｐＨが５．５以上の緩衝液における塩の濃度
は４００ミリモル／を以下であることが望ましい。

ｐＨが３．５以下の緩衝液とｐＨが５．５以上の緩衝液
とを交互に使用して生理活性物質固定化担体の洗浄操作
が行われる。１回めの洗浄操作で使用する緩衝液はｐＨ
が３．５以下の緩＠液およびｐＨが５．５以上の緩衝液
のうちどちらの緩衝族でもよいが、最後の洗浄操作で使
用する緩衝族は担体に固定化された生理活性物質の失活
を抑制しうる点からｐＨが５．５〜８５の範囲内の緩衝
液であることが望ましい。１回の洗浄操作は通常の手順
に従って、緩衝液を生理活性物質固定化担体と接触させ
たのち系外に流出させることによって行われる。例えば
粒子状の生理活性物質固定化担体を使用する場合には、
該担体を緩衝液中に分散させたのち該緩＠液を濾過筐た
は傾潟によりて担体から分離することによう行われる。

ｐＨが３．５以下の緩衝液およびｐＨが５，５以上の緩
衝液としてはそれぞれ１種または２種以上の緩衝液が使
用される。州が３．５以下の緩衝液を用いる洗浄操作お
よびｐＨが５．５以上の緩衝液を用いる洗浄操作および
ｐＨが５．５以上の緩衝液を用いる洗浄操作はそれぞれ
１回以上、好筐しくはそれぞれ２〜４回行われる。これ
らの緩衝液を用いる洗浄操作の繰シ返しの間または繰シ
返しの前もしくは後で、これらの緩衝液とは異なる洗浄
液を用いる洗浄操作を付加して行ってもよい。

本発明の生理活性物質固定化吸着剤製造用キットは、前
記の活性基を有する担体、ｐＨが３，５以下の緩衝液お
よびｐＨが５．５以上の緩＠液からなるため、生理活性
物質を活性基を有する担体に共有結合法によって固定化
させ、得られた生理活性物質固定化担体を必要によりブ
ロッキング剤と接触させたのち、ｐＨが３．５以下の緩
衝液と州が５．５以上の緩衝液とで交互に洗浄すること
からなる本発明の生理活性物質固定化吸着剤の製造方法
が容易に適用される。該キットには、前記のような生理
活性物質の活性基を有する担体への固定化および生理活
性物質固定化担体とブロッキング剤との接触を行う上で
好都合となるように、前述の生理活性物質の固定化操作
において使用される緩衝液のような固定化用緩衝液およ
び前述のブロッキング操作において使用されるブロッキ
ング剤を含有する緩衝液のようなブロッキング用緩衝液
がそれぞれ付加されていてもよい。！た該キットには、
製造された吸着剤を治療用の吸着剤渣たは治療のための
試験用の吸着剤として使用する上で好都合となるように
吸着剤を充填しうるカラムが付加されていてもよい。カ
ラムの一例として、第１図に示すとおシ、血液、血漿、
血清などの液体を流すチューブと接続し易い形状の肢体
入口部ｌおよび液体出口部２と生理活性物質固定化吸着
剤を充填することが可能な本体部３とを有し、本体部の
一端に液体入口部が位置し、また本体部の他の一端に液
体出口部が位置しておシ、液体は通過することが可能で
あるが生理活性物質固定化吸着剤は通過しえない支持部
４および５を本体部と液体入口部の間および本体部と液
体出口部の間にそれぞれ有しているものを挙げることが
できる。本体部、液体入口部および液体出口部の材質と
しては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネ
ート、ポリエステル、ポリメチルメタクリレートなどが
例示される。これらのうちポリプロピレンおよびポリカ
ーボネートがカラムをオートクレーブ滅菌、γ−線滅菌
などの滅菌に付することかできる点において特に好適で
ある。また支持部としてはポリエステル繊維からなるフ
ィルターなどが使用される。

以下余白 〔実施例〕 以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、不発
明はこれらの実施例により限定されるものではない。

実施例１ 金５属ナトリウムの存在下で蒸留することによって得ら
れたジオキサン５Ｑｍ／中にセルロース粒子（生化学工
業株式会社販売、ＣＭ−セルロファインＣＨ）ｘｏｆを
懸濁し、得られた懸濁液にＮ−ヒドロキシコハク酸イミ
ド０．５２およびジシクロへキシルカルボジイミド１．
０ｙを加え、混合物を室温下で１晩振盪攪拌した。得ら
れた混合物をメタノールとジオキサンを用いて繰り返し
洗浄することによってジオキサンを含むゲルが得られた
。

このゲルのうちの１２を１５０ミリモル／ｅの塩ｒヒナ
トリウムを含む２０ミリモル／ｌのリン酸塩緩衝抜（田
：７，４）１ｍ／中に３日間分散させ、得られた混合物
を吸引濾過した。Ｆ液についての波長２３０ｒ１ｒｒ＋
にふ・ける吸光度の測定値に基づいてＦ族生のＮ−ヒド
ロキンコ・・り酸イミドの濃度を求めた結果、上記のジ
オキサンを含むゲル１２あたり約３０マイクロモルのス
クシンイミドオキシカルボニル基が存在していることが
判明した０抗体の固定化 上記のジオキサンを含むゲルの１０２を２０ミノモル／
ｌのリン酸塩緩衝液（Ｆ４（：　７．４　）−で洗浄し
たのち、マウスＩｇＧ＋型モノクローン抗体Ｈへ−７（
微工研条寄第２４７１号；特開昭６２−４４１９９号公
報参照）の２０ηを含有させた２０ミリモル／ｌのリン
酸塩緩衝液（ｉ１′ｌ：　７．４　）　２０ｎｔｌと混
合した。混合物を４℃で一晩攪拌したのち、吸引濾過す
ることによってゲルを得た。混合直後と一晩攪拌したの
ちにお・いて、混合物の上清中の抗体のａ度をプロティ
ンアッセイキット（Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＡｓｓａｙＫｉｔ
　；米国バイオーラノド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社製〕を用
いて色素結合法によりそれぞれ定量した。この定量値に
基づく抗体の担体への固定化率は９０％であった。

上記の固定化操作によって得られた抗体が固定化された
担体のゲル１０９を２０ミリモル／ｌのリン酸塩緩衝液
（ＦＮ：７．４）で洗浄したのち、グＪ／ンおよび塩化
ナトリウムをそれぞれ１００ミノモル／ｌｋよび１５０
ミリモル／ｌの濃度で含′０２０ミリモル／ｌのリン酸
塩緩衝液（Ｆｌｌ：７．４）の５０ｍ／と混合した。混
合物を室温で４時間潰拌したのち吸引濾過することによ
ってゲルを得た。

洗浄 上記のブロッキング操作によって得られたゲルのＬＯＰ
をｌＯＯミリモル／ｌのグリシン塩酸緩衝液（１：ｔ（
：　２．５　）の１００＋＋＋／中に顕濁させ、次いで
懸濁物を吸引濾過することによって洗浄した（１回めの
洗浄）。１回めの洗浄によって得られたゲルを塩化ナト
リウムを１５０ミリモル／ｌのａ度で含む２０□リモル
／ｌのリン酸塩緩衝液（川：７．４）のｉ　ｏ　ｏ　ｍ
ｅ中に顕濁させ、次いで懸濁物を吸引Ｆ遇することによ
って洗浄した（２回めの洗浄）。２回めの洗浄によって
得られたゲルを、１回めの洗浄にかけると同様なグリシ
ン塩酸緩衝液を用いた洗浄操作と２回めの洗浄に分ける
と同様なリン酸塩緩衝液を用いた洗浄操作にこの順でさ
らに２回ずつ交互に付することによって６回め１での洗
浄を実施した。

実施例２ セルロース粒子ｉｏｒの代りにポリビニルアルコール粒
子（東ソー株式会社製ＣＭ−トヨパール６５０Ｃ）１（
ｌを担体として用いる以外は実施例１にかけると同様に
して活性基を有する担体の調製、抗体の固定化、プロノ
キングｐよび洗浄を行った。なふ・、活性基を有する担
体の調製の操作によって得られたゲル１２あたりに存在
するスクシンイミドオキシカルボニル基の量は約２０マ
イクロモルであった０筺だ抗体の固定化の操作における
抗体の担体への固定化率は８５％であった。

実施例３ 抗体の固定化 スクシンイミドオキシカルボニル基で活性化されたアガ
ａ−ス粒子〔スウェーデン国ファルマシ７−ＬＫＢ　（
Ｐｉｑａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ　）社製アクチペーテラ
ドＣＨ−セフ　７　Ｃ１−ス４　Ｂ　（Ａｃｔｉｖａｔ
ｅｄ　ＣＨ−８ｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ）〕の３．３２を
１ミリモル／ｌの氷冷塩酸１００Ｒ／中で１５分間膨潤
させたのち、同種の水冷塩酸で洗浄することによってゲ
ルを得た。このゲルの１０９を、炭酸水素ナトリウムと
塩化ナトリウムをそれぞれ０．１モル／　ｌ　＆−よび
０．５モル／ｌの濃度で水に溶解してなる炭酸塩緩衝液
（Ｆｌ（：８０）で洗浄したのち、同種の炭酸塩緩衝液
とマウスＩｇＧｒ型モノクローン抗体ＨＡ−７２０可と
の混合液中に懸濁させた。懸濁物を４℃で４時間攪拌し
たのち、吸引濾過することによってゲルを得た。懸濁直
後と４時間攪拌したのちにかいて、懸濁物の上清中の抗
体の濃度を実施例１に訃けると同様にしてそれぞれ定量
した結果、抗体の担体への固定化率は８０％であること
が判明した。

フロンキング 上記の固定化操作によって得られた抗体が固定化された
担体のゲル１０Ｆを炭酸水素ナトＩＪウムと塩化ナトリ
ウムをそれぞれ０．１モル／Ａｈよび０．５モル／ｌの
濃度で水に溶解してなる炭酸塩緩衝０．　Ｃｍ　：　８
．　Ｏ）　ｔｌ’洗浄Ｌ７’Ｃｔ７）ち、　Ｑ、　ｌ　
モル／　１のトリス塩酸緩衝液（田：８）の５Ｑｍ／と
混合した。混合物を室温で１時間攪拌したのち吸引濾過
することによってゲルを得た。

洗浄 上記のブロッキング操作によって得られたゲルの１０９
を実施ｆｆ１Ｊ　Ｉ　Ｋ　訃けると同様な洗浄方法で６
回め筐での洗浄操作に付した。

参考例１ 実施例３にふ・けると同様にして抗体の固定化釦よびブ
ロッキングの各操作を行うことによって得られたゲルの
１０２を、塩化ナトリウムを０．５モル／ｌの濃度で含
有する０、１モル／ｌの酢酸緩衝液（１’ｌｌ：４）と
塩化ナトリウムを０．５モル／ｌの濃度で含有する０、
　１モル／Ｅのトリス緩衝液（Ｆ４″ｌ：８）とを用い
てこの順で３回ずつ洗浄した。

参考例２ 実施例１．２釦よび３ならびに参考ｍｌｉで得られたゲ
ル状の生理活性物質固定化吸着剤の１２をそれぞれ塩化
ナトリウムを１５０ミリモル／ｌの濃度で含−＆２０ミ
Ｉ７モル／ｌのリン酸塩緩衝液（…：７．４）（以下、
かかる塩化ナトリウムを含Ｑ　ｌン酸塩緩衝蔽をＰＢＳ
と称する）のｌ　ｍｌと混合し。

混合物を３７℃で３時間振盪した。得られた混合物を遠
心分離に付した。得られた上清中のマウスＩｇＧ１型モ
ノクローン抗体ＨＡ−７のＩａ度を酵素免疫測定法によ
り求めた。

すなわち、マウスＩｇＡ、　ＩｇＧふ・よびＩｇＭ　（
重鎖釦よび軽鎖）に対するヤギ抗血清のＩｇＧ分画〔米
国オルガノン・テクニカ・コーポレーンヨン（Ｏｒｇａ
ｌｌｏｎＴｅｋｎｉｋ−１Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　）
社Ｈ＊　コＦ　・７　ンｆ　−マ’７ス・イムノグロブ
リンズ（ＩｇＡ　＋ＩｇＧ　＋　ＩｇＭ　）　（ヘビー
・アンド・ライト・チェインズ・スペンフイツク）、　
　ＩｇＧフラクション（Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉ　−Ｍｏｕ
ｓｅＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ　（ＩｇＡ　十Ｉ
ｇＧ　十ＩｇＭ　）　（Ｈｅａｖｙ　ａｎｄＬ＋ｇｈｔ
　Ｃｈａｉｎｓ　５ｐｅｃｉｆｉｃ）、　ＩｇＧ　Ｆｒ
ａｃｔｉｏｎ））を２５μり／　ａｔの濃度で含有させ
たＰＢＳをポリ塩化ビニル製のマイクロウェルプレート
〔米」ペクトンーデイツキンソン・アンド・カンパニー
（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃ如ｎ５ｏｎａｎｄ　Ｃｎｍｐａ
ｎｙ　）社製、７フルコン（Ｆａｌｃｏｎ）３９１２゜
９６穴プレート〕のウェル中に５０μＩ、／ウェルずつ
分注し、４℃の温度で１晩％Ｉｌすることによって抗体
をプレートに吸着させた。各ウェルから溶液を除去しＰ
ＢＳでウェルを洗浄したのち、牛脂児血清全５容量多含
有するＰＢＳの溶液を３００μｌ／ウエルずつ分注し、
３７℃の温度で２時間静置することによって抗体が吸着
していない固相表面のフロンキングを行った。牛脂児血
清を５容量多含有するＰＢＳの溶液で各ウェルを洗浄し
たのち、前記の上清（試料）を５０μ７！７／ウエルず
つ各ウェルに分注し、３７℃の温度で１時間静置し、次
いで牛脂児血清を５容量多含有するＰＢＳの溶液で各ウ
ェルを洗浄した。西洋ワサビペルオキ／ダーゼで標識し
たマウス免疫グロブリンに対する抗体〔イギリス国アマ
ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　）社製、アンチマウスエｇ
、ペルオキシダーゼリンクド、スピーシーズスペシフィ
ック・ホール・アンチボディ（Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ　
Ｉｇ、　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−１ｉｎｋｅｄ、　５ｐ
ａｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＷｈｏｌｅ　Ａｎｔｉｂ
ｏｄｙ）　）を牛脂児血清を５容量多含有するＰＢＳの
溶液に約２μｙ／ＩＩＩｔの濃度で溶解し、この溶液を
５０μｌ／ウエルずつ各ウェルに分注し、３７℃の温度
で１時間静置した。各ウェルをＰＢＳで洗浄したのち、
２．２’−アジノービス（３−エチルベンシナアゾリン
−６−スルホンｅ）を１ミリモル／ｌ含有し、かつ過酸
化水素を０．００４５重量多含有するトリス緩衝液Ｈ１
ｌ：７．４）を１００μｌ／ウエルずつ各ウェルに分圧
し、室温下で３０分間振盪することによって発色操作を
行った。各ウェル中の溶液について波長４０９　ｎｍ　
、！＝　５０１　ｎｍにかける吸光度を測定し、両波長
に訃ける吸光度の差を求めた。

一方、上記の操作において、生理活性物質固定化吸着剤
をＰＢＳ中で振盪したのちに得られた上清（試料）の代
りにマウスＩ　ｇＧｌ型モノクローン抗体を１０−３ｎ
９　／ｌｕｔ　〜１０　ｐｆ　／　ｍｅの範囲内の既知
濃度で含有するＰＢＳを用いる以外は同様な操作を行い
、求められた吸光度の差に基づいて検量線を作成した。

この検量線から上清（試料）中のマウスＩｇＧ１型モノ
クローン抗体ＨＡ−７の濃度を求め。

その濃度に基づいて生理活性物質固定化吸着剤のゲル１
２あたりの抗体の遊離量を計算した。得られた結果を第
１表に示す。

第１表 実施例１で得られた吸着剤　　　　１以下実施列２で得
られた吸着剤　　　　１以下実施例３で得られた吸着剤
　　　　２ 参考例１で得られた吸着剤　　　１０ 〔発明の効果〕 本発明によれば、上記の実施例から明らかなと釦り、抗
体などの生理活性物質の遊離量が極めて少ない生理活性
物質固定化吸着剤を簡単な操作により製造することがで
きる。本発明の製造方法は本発明の生理活性物質固定化
吸着剤製造用キットに３いて容易に適用される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の生理活性物質固定化吸着剤製造用キ
ットの一要素を構成することがあるカラムの一例を示す
断面図である。１は液体入口部。 ２は液体出口部、 ３は本体部、 ４釦よび５はいず れも支持部をそれぞれ示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生理活性物質を活性基を有する担体に共有結合法に
   よつて固定化させ、得られた生理活性物質固定化担体を
   必要によりブロッキング剤と接触させたのち、ｐＨが３
   ．５以下の緩衝液とｐＨが５．５以上の緩衝液とで交互
   に洗浄することを特徴とする生理活性物質固定化吸着剤
   の製造方法。 ２、生理活性物質の固定化および生理活性物質固定化担
   体のブロッキング剤との接触をそれぞれ緩衝液中で行う
   請求項１記載の製造方法。 ３、活性基を有する担体、ｐＨが３．５以下の緩衝液お
   よびｐＨが５．５以上の緩衝液からなる生理活性物質固
   定化吸着剤製造用キット。 ４、生理活性物質の活性基を有する担体への固定化用緩
   衝液およびブロッキング用緩衝液が付加されてなる請求
   項３記載の生理活性物質固定化吸着剤製造用キット。 ５、生理活性物質固定化吸着剤を充填しうるカラムが付
   加されてなる請求項３または請求項４記載の生理活性物
   質固定化吸着剤製造用キット。