JP2010538271A - 滅菌方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、感受性リガンドを有するクロマトグラフィー媒体などの様々な材料、特に感受性材料の、滅菌方法に関する。クロマトグラフィー分離媒体のこの滅菌方法は、分離媒体を、約121℃〜約135℃のあいだの温度で加圧蒸気に対して曝露することを含む。
【選択図】なし

Description

関連出願への相互参照
本件出願は、2007年8月30日に英国で出願された出願番号0716900.6に基づく優先権を主張し；その開示は、全体として、参照として本明細書中に援用される。

技術分野
本発明は、様々な材料、特に感受性材料、および特に、親和性リガンド（タンパク質性リガンド等）を結合させたクロマトグラフィー媒体、の滅菌方法に関する。

バイオ医薬、特に、タンパク質、ペプチドおよび核酸等の生物活性分子に基づく薬品、の製造には、これらの分子を工業規模で製造しそして精製することが必要である。特に、バイオ医薬生成物としてのモノクローナル抗体（MAb）についてのますます高まる需要は、高い発現レベルを伴う細胞培養を開発することを促進し、そして結果として、より効率的な精製プロセスについての需要を増大させた。例えば、モノクローナル抗体は、多数の病気の治療に革命をもたらし、そしてそれらは、指向性薬物治療の主要な指標となった。欧州のモノクローナル抗体治療薬市場の最新の推計は、2011年までに114億ドル（87億ユーロ）の数字に届く。この需要の増大のために、SEPHAROSE^TM、MABSELECT ^TM、SOURCE ^TMおよびCAPTO ^TM（GE Healthcare）等の分離媒体でパッキングされたカラムを含む大型の進歩的なクロマトグラフィーシステムを使用することが必要となった。

バイオ医薬のクロマトグラフィー分離のあいだ、プロセスを滅菌条件下で行うこと、そして潜在的に有害な汚染物質は使用前にシステムから取り除かれること、を確実にすることが極めて重要である。細菌およびその他の微生物によるコンタミネーションは、多数のバイオテクノロジー的用途および生物医学的用途において、しばしば直面する問題である。例えば、水酸化ナトリウム、過酢酸、リン酸、エチレンオキシド、二酸化塩素およびベンジルアルコールなどの様々な薬剤が、微生物個体群を不活性化しおよび／または破壊するその能力について知られている。しかしながら、カラムおよびクロマトグラフィー媒体の消毒、特にタンパク質性媒体、すなわち、タンパク質性リガンドとともに提供されるクロマトグラフィー媒体（例えば、様々な親和性クロマトグラフィー媒体）の消毒は、煩わしいものである。強酸またはアルカリ、第4級アンモニウム化合物、ハロゲン-含有化合物、酸化剤、およびフェノールおよび関連する化合物などの最も効果的な殺菌剤および衛生試薬は、ほとんどのクロマトグラフィー媒体に対して、特にタンパク質性親和性媒体に対して、有害であると考えられる。さらに、ガンマ線照射やオートクレーブなどの滅菌方法もまた、それらの媒体に対して大きな有害効果を有するものと考えられている。

さらに、酸またはアルカリ、第4級アンモニウム化合物、ハロゲン-含有化合物、酸化剤、およびフェノールおよび関連する化合物が関連する多くの衛生方法または滅菌方法は、有害でありおよび／または毒性である。このように、クロマトグラフィー媒体などの感受性材料を、効率的に滅菌するための方法が必要とされる。

US 5817528（Bohm, W. et al）は、タンパク質が結合されるマトリクス材料を含有する滅菌され、そして発熱物質不含のカラムを製造する方法を記載する。適切には、カラムに結合されるタンパク質は、Staphylococcus aureusプロテインA、またはStreptococcusプロテインGであり、またはタンパク質は、抗-ヒトLDLイムノグロブリンまたは抗-ヒトIgイムノグロブリンなどの抗体であってもよい。この方法は、CNBr/トリエチルアミンを使用してまたは1,1'-カルボニルジイミダゾールを使用して化学的に活性化される、アガロースなどのカラムマトリクス材料を提供する。クロマトグラフィーマトリクス材料は、好ましくは、115℃での蒸気滅菌により滅菌されたのち、無菌条件下で病原体-不含の精製タンパク質と組合せ、タンパク質をマトリクス材料に対して結合させる。

US 5817528

本発明は、細菌コンタミネーションおよび／またはウィルスコンタミネーションのために、特に、バイオ医薬材料の精製において使用されるクロマトグラフィー分離媒体における、新規な滅菌方法を提供する。本件発明者らは、本明細書中で定義するような特定のタンパク質性リガンドを有し、そして固体支持体マトリクスに対して結合されているクロマトグラフィー分離媒体が、驚くべきことに、オートクレーブによる滅菌による変性に対して耐性であることを見出した。

このように、第一の側面において、クロマトグラフィー分離媒体の滅菌方法を提供する。ここで、クロマトグラフィー分離媒体が、固体支持体マトリクスに結合されたタンパク質性リガンドを含むものであり、この方法は、クロマトグラフィー分離媒体を、約121℃（250°F）〜約135℃（270°F）の温度で加圧蒸気に対して曝露することを含む。

適切なタンパク質性リガンドは、抗体-結合分子、特にプロテインAおよびプロテインGの機能的類似体、からなる群から選択される。一態様において、クロマトグラフィー分離媒体は、タンパク質性リガンドを結合させた固体支持体マトリクスを含み、そしてタンパク質性リガンドは、アルカリ-安定化プロテインA誘導性リガンドである。

一態様において、クロマトグラフィー分離媒体は、2バール〜35バールの範囲の圧力下、加圧蒸気に対して曝露される。
一態様において、クロマトグラフィー分離媒体は、30〜35バールの範囲の圧力下、より好ましくは34〜35バールの範囲の圧力下、加圧蒸気に対して曝露される。

一態様において、クロマトグラフィー分離媒体は、10〜60分の範囲の期間、加圧蒸気に対して曝露される。
特定の態様において、タンパク質性リガンドを結合させた固体支持体マトリクスを含むクロマトグラフィー分離媒体を、121℃の温度および34バールで、12分間、媒体を加圧蒸気に対して曝露することにより、滅菌する。

好ましくは、滅菌すべきクロマトグラフィー分離媒体は、クロマトグラフィーカラム中に含有されるか、またはフィルター上に支持化される。

図1は、MABSELECTの参照サンプルの動的IgG結合能力を、121℃、34.4バールで12分間、オートクレーブした後のMABSELECTと比較して示すプロットである。 図2は、MABSELECT SUREの参照サンプルの動的結合能力を、121℃、34.4バールで12分間、オートクレーブした後のMABSELECT SUREと比較して示すプロットである。

本発明は、クロマトグラフィーカラム／媒体およびフィルター、特にタンパク質性リガンドを結合させたクロマトグラフィー分離媒体、の新規で効率的な滅菌方法を提供する。特に、本発明は、アルカリ安定化プロテイン-A誘導性リガンドを結合させたクロマトグラフィー分離媒体の、細菌およびウィルスの不活性化のための方法に関する。この方法は、約121℃〜約135℃の温度、より具体的には約121℃〜約123℃の温度で、分離媒体を加圧蒸気に対して曝露することに基づく。特に好ましい態様において、クロマトグラフィー分離媒体を、121℃の温度で、加圧蒸気に対して曝露する。

一般的には、オートクレーブによる湿式加熱滅菌は、少なくとも2バールの圧力の下、オートクレーブ（例えば、比重置換装置（gravity displacement apparatus））中で材料を加熱して、約121℃〜約135℃の温度を達成することをいう。滅菌プロセスにおいて、微生物は、水蒸気および高められた圧力の存在下で加熱されることにより、殺菌される。例えば、“Understanding the Operation & Validation of Autoclaves: A Practical Approach”, Reeks, B., BDR Publishing（September 1999）を参照。必要とされる滅菌時間は、滅菌されるサンプルの温度およびサイズの両方に依存し、そして10〜60分の範囲の間であってもよい。温度および圧力が上昇するにつれて、完全な滅菌を達成するために必要とされる時間を、表1に示すように、通常は減少させることができる。

従来、充填カラムの形態でのクロマトグラフィー媒体は、オートクレーブにより滅菌することができない。というのも、カラム充填が破壊される可能性があるためである。このように、クロマトグラフィー媒体は、通常、消毒（微生物汚染物質の数を許容可能なレベルまで減少させる）はされるが、媒体を完全に滅菌することまではされない。本明細書中で記載されるクロマトグラフィー分離媒体を滅菌する方法を試験するため、本件発明者らは、水をその沸点以下に維持するために、ASE 200、Accelerated Solvent Extraction System（Dionex Corp）を用いて得られる高い温度および高い圧力を使用した。ASE 200装置は、温度、時間および圧力についてプログラムすることができる。ASE 200装置により得られるより圧力下限が約34バールであるため、本件発明者らは、必要とされる通常の滅菌温度、すなわち、121℃で行われる高圧蒸気滅菌を評価することができた。

本明細書中で使用される場合、用語“クロマトグラフィー分離媒体”は、選択された移動相条件の下で分析対象物を結合する（すなわち、吸着する）ために効果的であり、そしてその他の選択された移動相条件の下で分析対象物を放出するために効果的である、固定相または粒子相のことを言う。本明細書中で記載されるプロセスは、結合されたタンパク質性リガンドを含有するクロマトグラフィー媒体を滅菌するために特に適切である。好ましいクロマトグラフィー分離媒体は、MABSELECT SURE^TMである。MABSELECT SURE（Superior Resistance）は、WO 03/080655（Hober, S）において開示されたクロマトグラフィー媒体であり、そしてアルカリ-安定化プロテインA-誘導化リガンドに基づくものであり、ここでタンパク質のアミノ酸配列は、親タンパク質リガンドと比較して、少なくとも1個のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸で置換することにより変異させたものである。クロマトグラフィー分離媒体において使用される場合、変異されたタンパク質リガンドは、親タンパク質分子を含む分離媒体と比較して、断続的なアルカリ洗浄を伴う2回以上の分離のあいだ、結合能力が増加することが示される。好ましくは、本明細書中で記載されるタンパク質性リガンドは、IgG、IgAおよび／またはIgMタンパク質、より好ましくはIgGの選択的結合のために使用することができるFc-フラグメント-結合タンパク質である。

本発明による分離媒体の固体支持体マトリクスは、適切な周知のもののいずれであってもよい。従来型の親和性分離マトリクスは、しばしば有機性のものであり、そして親水性表面を使用される水性媒体に対して曝露するポリマー、すなわち、その外部に対してそして存在するならばその内部表面に対してヒドロキシ（-OH）、カルボキシ（-COOH）、カルボキサミド（-CONH₂、N-置換型であってもよい）、アミノ（-NH₂、置換型であってもよい）、オリゴ-またはポリエチレンオキシ基を曝露するポリマー、に基づくものである。一態様において、ポリマーは、例えば、多糖類（例えば、デキストラン、スターチ、セルロース、プルラン、アガロースなど）に基づくものであってもよく、これらは好都合には、例えばbis-エポキシド、エピハロヒドリン、1,2,3-トリハロ-置換低級炭化水素と架橋して、適切な多孔性および剛性を提供した。最も好ましい態様において、固体支持体は、多孔性のアガロースビーズである。

あるいは、固体支持体は、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドなどの、合成ポリマーに基づくものである。ジビニル置換およびモノビニル置換ベンゼンに基づくマトリクスなどの疎水性ポリマーの場合、マトリクスの表面を、しばしば親水性化して、上述した親水基を、周囲の水溶液に対して曝露する。

さらに別の代替手段において、固体支持体は、例えば、シリカ、酸化ジルコニウムなどの無機性のものであってもよい。
さらに別の態様において、固体支持体は、表面、チップ、キャピラリー、またはフィルターなどの別の形態である。

リガンドを、例えば、リガンド中に存在するアミノ基および／またはカルボキシ基を使用する従来からのカップリング技術を介して、支持体に対して結合させることができる。Bis-エポキシド、エピクロルヒドリン、CNBr、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（NHS）等は、周知のカップリング試薬である。スペーサー基を、支持体とリガンドとの間に導入することができ、それによりリガンドの利用性を高め、そしてリガンドの支持体への化学的カップリングを促進する。あるいは、物理的吸着または生体特異的吸着などの非-共有結合により、リガンドを支持体に対して結合させることができる。

この方法は、厳しい条件下では劣化に晒されやすい媒体（MABSELECT SURE^TMなど）の滅菌のために、特に適切である。
この滅菌方法は、幅広く適用が可能であり、そして抗体（特にモノクローナル抗体）、核酸（例えば、ゲノムDNA、RNA）を含む生物活性分子の単離等のいずれかの目的のため、そして生物学的サンプルから細胞を単離および分離するために意図された、クロマトグラフィー媒体を滅菌するために使用することができる。

この滅菌方法は、使い捨てのカラムおよびフィルターのためにも適切である。使い捨てのカラム／フィルターは、さらに洗浄や滅菌をする必要なしにすぐに使用できるという利点をもたらす。このことは、カラム／フィルターが十分に滅菌されていること、または少なくとも微生物コンタミネーションがないことを意味する。

本明細書中で使用される場合、用語生物学的サンプルは、核酸またはモノクローナル抗体などのポリペプチドを含有するかまたは含有することが疑われるin vivoまたはin situで得られた生物学的組織または細胞のサンプルを含む、いずれかの生物学的供給源から得られたサンプルのことを言う。

本発明は、添付した請求項1〜6のいずれかにおいて開示された方法により滅菌されたクロマトグラフィー分離媒体、特に、媒体、MABSELECT SURE、もまた、提供する。
本発明は、以下の実施例および図面を参照することによりさらに説明される。

1. 湿式加熱（蒸気）滅菌
MABSELECT媒体およびMABSELECT SURE媒体を、34.4バールの圧力および121℃の温度で、12分間、湿式加熱滅菌（オートクレーブ）に供した。この目的のため、33 mlのゲルを、Accelerated Solvent Extractor（ASE 200）（Dionex, USA）のカラム中に、0.1M NaCl溶液を用いて充填し、そして121℃および34.4バールの条件に、12分間曝露した。ASE 200は、プログラム可能な圧力および34.4バールでの最低圧力での加熱を提供する高圧装置である。

MABSELECT媒体およびMABSELECT SURE媒体の曝露されたゲルのIgG結合能力を、非処理ゲルと比較して、測定した。非処理媒体（参照カラム1〜4）およびオートクレーブ処理媒体についての動的結合能力データは、表2および表3に示される。DBC_n%は、n%のブレイクスルーで測定された動的結合能力である。

この結果から、本明細書中で記載される方法による湿式加熱滅菌が、MABSELECT SUREの結合能力に対しては何ら作用を有さないことが示された。一方、MABSELECTは、同一条件の下での湿式加熱滅菌の後に、そのIgG結合能力の45%を失った。

本明細書中で言及される全ての特許、特許出願、およびその他の刊行物は、それぞれが本明細書中に参考文献として個別にそして具体的に援用されるように、その内容を参考文献として援用される。本発明の好ましい例示的態様が記載されているものの、説明のみの目的で限定することを目的とせずに提供される記載された態様以外の態様により、本発明を実施することができることを、当業者であれば認識する。本発明は、添付の請求の範囲によってのみ限定される。

Claims (13)

1. 約121℃〜約135℃の温度でクロマトグラフィー分離媒体を加圧蒸気に対して曝露することを含む、固体支持体マトリクスに対して結合させたタンパク質性リガンドを含むクロマトグラフィー分離媒体の滅菌方法。
2. クロマトグラフィー分離媒体が、2バール〜35バールの範囲の圧力下、加圧蒸気に対して曝露される、請求項1に記載の方法。
3. クロマトグラフィー分離媒体が、30〜35バールの範囲の圧力下、加圧蒸気に対して曝露される、請求項1に記載の方法。
4. クロマトグラフィー分離媒体が、34〜35バールの範囲の圧力下、加圧蒸気に対して曝露される、請求項1に記載の方法。
5. クロマトグラフィー分離媒体が、10〜60分の範囲の期間、加圧蒸気に対して曝露される、請求項1に記載の方法。
6. クロマトグラフィー媒体が、34.4バールの圧力および約121℃の温度の下、蒸気に対して曝露される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
7. 滅菌すべきクロマトグラフィー分離媒体が、クロマトグラフィーカラム中に含有されるか、またはフィルター上に支持化される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
8. タンパク質性リガンドのアミノ酸配列が、親タンパク質リガンドと比較した場合、少なくとも1つのアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸により置換することにより変異させたものである、請求項1に記載の方法。
9. タンパク質性リガンドが、Fc-フラグメント-結合タンパク質である、請求項1に記載の方法。
10. 滅菌すべきクロマトグラフィー分離媒体が、支持体マトリクスに結合させたアルカリ-安定化プロテインA-誘導性リガンドである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
11. クロマトグラフィー分離媒体が、MABSELECT SUREである、請求項10に記載の方法。
12. 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法により滅菌された、クロマトグラフィー分離媒体。
13. 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法により滅菌された、MABSELECT SURE。