CN116350775B - 酪氨酸酶和咖啡酸联合半乳甘露聚糖交联屋尘螨减轻过敏性哮喘的方法 - Google Patents
酪氨酸酶和咖啡酸联合半乳甘露聚糖交联屋尘螨减轻过敏性哮喘的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了酪氨酸酶(Tyr)和咖啡酸(CA)联合半乳甘露聚糖(Man)交联屋尘螨(HDM)减轻过敏性哮喘的方法，属于抗过敏技术领域。本发明公开酪氨酸酶和咖啡酸联合半乳甘露聚糖交联HDM减轻过敏性哮喘的方法，通过酪氨酸酶和咖啡酸催化HDM与半乳甘露聚糖交联，改变HDM的构象结构和致敏能力。本发明公开的低过敏性交联高分子量HDM，可以影响T细胞介导的免疫反应。这种新的免疫治疗产品，通过减少嗜酸性气道炎症和恢复正常的1型辅助型T细胞(Th1)/Th2免疫平衡来减轻过敏性疾病的严重程度，可以作为一个潜在的抗原特异性免疫治疗(ASIT)候选分子来治疗过敏性疾病。
Description
技术领域
本发明涉及抗过敏技术领域，更具体的说是涉及酪氨酸酶和咖啡酸联合半乳甘露聚糖交联屋尘螨(HDM)减轻过敏性哮喘的方法。
背景技术
过敏性哮喘是最常见的慢性呼吸道疾病之一，哮喘涉及呼吸系统的喘息、呼吸急促、胸闷以及咳嗽等一系列症状，并常伴有多器官过敏和非过敏性疾病，严重影响人类的健康和生活。哮喘通常由花粉、霉菌、尘螨等过敏性刺激和冷空气等非过敏性诱因诱发，其中，屋尘螨(HDM)是哮喘的主要危险因素。皮质类固醇、长效β2-肾上腺素受体激动剂、长效毒蕈碱拮抗剂、白三烯受体拮抗剂等药物，虽能缓解哮喘的症状，但易复发、难治愈以及伴随多种并发症的特点依然给人们造成了严重的精神压力和经济压力。
因此，提供一种安全有效的制剂减轻过敏性哮喘的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是开发一种降低HDM过敏原性的技术，提供一种低过敏性高分子量HDM来减轻过敏性哮喘，具体是提供酪氨酸酶和咖啡酸联合半乳甘露聚糖交联HDM减轻过敏性哮喘的方法，使经改造后的过敏原产品可使用更高的免疫治疗起始剂量，并且对过敏性哮喘起到预防和治疗的效果。
酪氨酸酶(Tyr)和咖啡酸(CA)联合半乳甘露聚糖(Man)交联屋尘螨(HDM)减轻过敏性哮喘的方法，具体步骤如下：
(1)制备HDM悬浊液：采用PBS溶液溶解HDM，获得50～400mg/ml的HDM悬浊液；
(2)将步骤(1)制备的HDM悬浊液在冰浴环境下研磨成细颗粒，并进一步用PBS溶液稀释获得2～20mg/mL的HDM溶液；
(3)将步骤(2)制备的HDM溶液在85～100℃下加热处理15～30分钟以松散HDM的蛋白质结构；
(4)采用PBS溶液溶解Man，获得0.5～4.0mg/ml的Man溶液；按2：1的体积比添加到步骤(3)所得HDM溶液中；
(5)采用PBS溶液溶解酪氨酸酶，获得活性水平为0.2～0.8U/mg的酪氨酸酶溶液；按100：1的体积比添加到步骤(4)所得溶液中；
(6)在步骤(5)的交联反应液中继续加入0.5～1.5mMCA提高交联效率；
(7)将步骤(6)获得的溶液置于无菌容器中，在35-39℃下连续搅拌孵育12-24小时；所述容器大小为所盛装溶液体积的40～60倍，且在孵育过程中每间隔8小时在无菌环境下开盖更换新鲜空气一次；
(8)孵育结束后，85～100℃加热10～30分钟，通过失活酶促反应终止反应；获得低过敏性交联高分子量HDM。
作为优选的技术方案，所述PBS溶液浓度为0.2～2mM。
作为优选的技术方案，步骤(1)体系的pH值为6.0～9.0。
作为优选的技术方案，步骤(6)孵育时搅拌转速为250～500rpm。
作为优选的技术方案，步骤(8)所得低过敏性交联高分子量HDM，在-20℃保存。
本发明的另一目的是，提供上述的低过敏性交联高分子量HDM在制备治疗脱敏制剂中的应用。
酪氨酸酶具有催化单酚邻位羟基化生成邻二酚的能力，邻二酚氧化后进一步转化为同源邻醌。蛋白质的酪氨酸侧链在酪氨酸酶的催化形成醌，由于醌的高反应性，可进一步与不同的基团如胺、酪氨酸、巯基、酰胺和/或彼此反应，建立分子间和/或分子内交联。此外，咖啡酸除了通过提供羟基官能团来增强酪氨酸酶的交联效果，还可以起到交联介质的作用，克服球状蛋白质在酪氨酸酶中的转化能力很差的缺点，从而更有助于改变其致敏潜能。
本发明首次开发了一种基于酪氨酸酶催化交联并联合半乳甘露聚糖的聚合低过敏性HDM衍生物，可以影响T细胞介导的免疫反应。这种新的免疫治疗产品，通过减少嗜酸性气道炎症和恢复正常的Th1/Th2免疫平衡来减轻过敏性疾病的严重程度，可以作为一个潜在的抗原特异性免疫治疗(ASIT)候选分子来治疗过敏性疾病。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了酪氨酸酶和咖啡酸联合半乳甘露聚糖交联HDM减轻过敏性哮喘的方法，首次通过酪氨酸酶和咖啡酸催化的交联与半乳甘露聚糖偶联，改变HDM蛋白质的构象结构和致敏潜能。酪氨酸酶交联的HDM与半乳甘露聚糖偶联可以定位特异性连接糖与蛋白质，改善其功能特性，降低HDM的致敏性。
同时，包含多个过敏原聚合物的表面积比相同数量的过敏原单体更小，跟肥大细胞IgE交联的暴露表位更少。高分子量过敏原向致敏肥大细胞的扩散比过敏原单体更慢，此过程更可能被组织中的抗原递呈细胞干扰，从而进一步减少与致敏肥大细胞反应的机会。这些特性有助于降低交联产品的过敏原性，从而产生更快速的治疗反应。
本发明方法比以前用物理和化学方法来降低HDM的抗原性和过敏原性的效率高很多。酪氨酸酶和咖啡酸交联过敏原的免疫治疗具有更高的安全性，因此比非修饰过敏原更快更简单地给药。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明屋尘螨(HDM)与Tyr/CA交联后的HDM的SDS-PAGE电泳图变化；
M：marker蛋白；条带A：HDM；条带B：Tyr/Man-HDM；
图2附图为本发明Tyr/CA交联HDM结合Man对HDM诱导的小鼠哮喘模型中浸润细胞的影响：小鼠哮喘模型的肺泡灌洗液(BALF)的细胞总数；
图3附图为本发明Tyr/CA交联HDM结合Man对HDM诱导的小鼠哮喘模型中BALF的嗜酸性粒细胞的影响；
其中，A：流式细胞术检测结果直观图；B：统计图；
图4附图为本发明Tyr/CA交联HDM结合Man对HDM诱导的小鼠哮喘模型中肺组织的嗜酸性粒细胞的影响；
其中，A：流式细胞术检测结果直观图；B：统计图；
图5附图为本发明Tyr/CA交联HDM结合Man对HDM诱导的小鼠哮喘模型中肺组织的细胞因子表达情况的影响：Th2细胞特征性细胞因子—白细胞介素(IL)-4、IL-5和IL-13；
图6附图为本发明Tyr/CA联合Man对HDM诱导的小鼠哮喘模型中浸润细胞的影响：小鼠哮喘模型的BALF的细胞总数；
图7附图为本发明Tyr/CA联合Man对HDM诱导的小鼠哮喘模型中BALF的嗜酸性粒细胞的影响；
其中，A：流式细胞术检测结果直观图；B：统计图；
图3～图7中，结果以每组4～6只小鼠的平均值±标准差表示；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001与HDM组相比。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了酪氨酸酶和咖啡酸联合半乳甘露聚糖交联屋尘螨(HDM)减轻过敏性哮喘的方法，所涉及的原料试剂均为市售可得，例如HDM可购自GREER(d.pteronyssinusMilled原料,5g,RMB84M)，对其来源不做具体限定；未提及的方法均为常规操作，在此不再一一赘述。
实施例1
酪氨酸酶和咖啡酸联合半乳甘露聚糖交联屋尘螨(HDM)减轻过敏性哮喘的方法，具体步骤如下：
(1)制备HDM悬浊液：将100mgHDM用1mL浓度为1mM的PBS溶解，获得100mg/ml的HDM悬浊液，体系pH＝7.4；
(2)将步骤(1)制备的200uLHDM悬浊液在冰浴条件下研磨成细颗粒，并用800uL浓度为1mM的PBS稀释，获得20mg/mL的HDM溶液；
(3)将步骤(2)制备的HDM溶液在90℃下加热处理20分钟以松散HDM的蛋白质结构
(4)用500uL浓度为1mM的PBS溶解2mgMan，获得4mg/ml的Man溶液；将Man溶液加入步骤(3)加热处理后的HDM溶液中；
(5)用浓度为1mM的PBS溶解酪氨酸酶，获得活性水平为0.4U/mg的酪氨酸酶溶液；在步骤(4)获得的溶液中加入15uL酪氨酸酶溶液引发交联反应；
(6)在步骤(5)的交联反应液中继续加入1mMCA提高交联效率；
(7)将步骤(6)获得的溶液置于干净无菌corning50mL离心管中，在37℃下连续搅拌孵育24小时，搅拌转速为250rpm，每间隔8小时在超净台开盖一次；
(8)孵育结束后，95℃加热10分钟，通过失活酶促反应终止反应；
(9)获得低过敏性交联高分子量HDM，在-20℃保存。
试验例1
利用SDS-PAGE谱和体内模型评价酪氨酸酶和咖啡酸联合半乳甘露聚糖交联HDM的免疫治疗潜力。
(1)通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验验证交联前后HDM蛋白的变化
天然HDM或酪氨酸酶交联后的HDM样品分别与溴酚蓝缓冲液以4:1(v:v)的比例混合，然后在100℃加热变性7分钟。将样品和蛋白质标记物(10～250.0kDa)加入含有12％分离胶和5％浓缩胶中。用80V(浓缩胶)和120V(分离胶)的恒定电压进行电泳。用考马斯亮蓝R-250染料染色后，凝胶脱色后拍摄图像，结果见图1。图1显示：HDM经交联后，在多处的表位消失或者减弱了。
(2)HDM诱导的小鼠过敏性哮喘模型
对照组：在第0天和第2天，6周龄雌性野生型(WT)C57BL/6小鼠通过鼻腔滴注(i.n.)200ug天然HDM，然后在第14、15、16、17、18天连续5天鼻腔滴注80ug天然HDM。第21天麻醉所有小鼠，收集肺、肺泡灌洗液(BALF)等样品待测。
实验组：在第0天和第2天，6周龄雌性野生型(WT)C57BL/6小鼠通过鼻腔滴注(i.n.)200ug酶促交联HDM，然后在第14、15、16、17、18天连续5天鼻腔滴注80ug酶促交联HDM。第21天麻醉所有小鼠，收集肺、肺泡灌洗液(BALF)等样品待测。
结果发现，只有天然HDM能诱导小鼠哮喘，而酶促交联HDM不能诱导小鼠哮喘，这体现了酶促交联HDM的脱敏功能。
(3)肺泡灌洗液(BALF)收集和分析
小鼠麻醉后，使用20号钝针的气管插管用冷PBS反复灌洗肺组织三次。灌洗液在400g离心5分钟后，将细胞重悬于1％胎牛血清的PBS中。
通过在血细胞计数器上计数细胞来确定细胞总数。结果见图2。与HDM组相比，相同剂量的酶促交联HDM处理降低了肺泡灌洗液(BALF)中的浸润细胞总数。通过流式细胞术定量检测肺泡灌洗液(BALF)髓细胞中的嗜酸性粒细胞，结果见图3。图3结果显示：鼻腔滴注天然HDM后的小鼠，肺泡灌洗液(BALF)中分泌出大量的嗜酸粒细胞；而鼻腔滴注酶促交联HDM后的小鼠，肺泡灌洗液中没有明显嗜酸粒细胞浸润，说明HDM经交联后，可以成功减轻过敏性哮喘。
(4)肺单个核细胞分离和分析
将肺组织取出、剪碎，加入含5％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，内含1mg/ml胶原酶，消化组织46分钟，然后使用38％Percoll梯度(GEHealthcareLifeSciences)富集细胞。用ACK裂解缓冲液(R&DSystems)裂解红细胞并再次离心细胞。弃去上清液后，将细胞重悬于1ml1％胎牛血清的PBS中。
通过流式细胞术定量检测肺组织细胞中的嗜酸性粒细胞以及Th2细胞特征性细胞因子白细胞介素(IL)-4、IL-5和IL-13，结果见图4和图5。图4结果显示：鼻腔滴注天然HDM后的小鼠，肺组织细胞中分泌出大量的嗜酸粒细胞；而鼻腔滴注酶促交联HDM后的小鼠，肺组织细胞中没有明显嗜酸粒细胞浸润，说明HDM经交联后，可以成功减轻过敏性哮喘。图5结果显示：鼻腔滴注天然HDM后的小鼠，肺组织细胞中分泌较多的Th2细胞特征性细胞因子IL-4、IL-5和IL-13；而鼻腔滴注酶促交联HDM后的小鼠，肺组织细胞中分泌较少的Th2细胞特征性细胞因子IL-4、IL-5和IL-13。在过敏性哮喘的发病过程中，Th2细胞特征性细胞因子IL-4、IL-5和IL-13通过促进IgE的合成、激活嗜碱性粒细胞和肥大细胞、募集嗜酸性粒细胞等引发严重的气道炎症反应，进而导致哮喘的发生发展，说明HDM经交联后，可以成功减轻过敏性哮喘的发生发展。
(5)Tyr/CA联合Man减轻HDM诱导的小鼠过敏性哮喘
对照组：在第0天和第2天，6周龄雌性野生型(WT)C57BL/6小鼠通过鼻腔滴注(i.n.)200ug天然HDM，然后在第14、15、16、17、18天连续5天鼻腔滴注80ug天然HDM。第21天麻醉所有小鼠，收集肺泡灌洗液(BALF)等样品待测。
实验组：在第0天和第2天，6周龄雌性野生型(WT)C57BL/6小鼠通过鼻腔滴注(i.n.)200ug天然HDM，同时滴入Tyr、CA和Man；在第14、15、16、17、18天连续5天鼻腔滴注80ug天然HDM，同时滴入Tyr、CA和Man。第21天麻醉所有小鼠，收集肺泡灌洗液(BALF)等样品待测。
通过在血细胞计数器上计数细胞来确定细胞总数。结果见附图6，与HDM组相比，相同剂量的HDM与Tyr、CA和Man一起鼻腔滴注处理后，降低了肺泡灌洗液(BALF)中的浸润细胞总数。通过流式细胞术定量检测肺泡灌洗液(BALF)髓细胞中的嗜酸性粒细胞，结果见附图7。附图7结果显示：鼻腔滴注天然HDM后的小鼠，肺泡灌洗液(BALF)中分泌出大量的嗜酸粒细胞；而与Tyr、CA和Man一起鼻腔滴注HDM后的小鼠，肺泡灌洗液中没有明显嗜酸粒细胞浸润，说明HDM在体内经Tyr、CA和Man酶促交联后，可以成功减轻过敏性哮喘。
结果发现，只有天然HDM能诱导小鼠哮喘，而HDM在体内经Tyr、CA和Man酶促交联后不能诱导小鼠哮喘，这体现了Tyr、CA和Man酶促交联治疗HDM诱导的小鼠哮喘的功能。
实施例2
酪氨酸酶和咖啡酸联合半乳甘露聚糖交联屋尘螨(HDM)减轻过敏性哮喘的方法，具体步骤如下：
(1)制备HDM悬浊液：将50mgHDM用1mL浓度为2mM的PBS溶解，获得50mg/ml的HDM悬浊液，体系pH＝8.5；
(2)将步骤(1)制备的200uLHDM悬浊液在冰浴条件下研磨成细颗粒，并用800uL浓度为2mM的PBS稀释，获得10mg/mL的HDM溶液；
(3)将步骤(2)制备的HDM溶液在85℃下加热处理20分钟以松散HDM的蛋白质结构
(4)用500uL浓度为2mM的PBS溶解1mgMan，获得2mg/ml的Man溶液；将Man溶液加入步骤(3)加热处理后的HDM溶液中；
(5)用浓度为2mM的PBS溶解酪氨酸酶，获得活性水平为0.2U/mg的酪氨酸酶溶液；在步骤(4)获得的溶液中加入15uL酪氨酸酶溶液引发交联反应；
(6)在步骤(5)的交联反应液中继续加入0.5mMCA提高交联效率；
(7)将步骤(6)获得的溶液置于干净无菌corning50mL离心管中，在35℃下连续搅拌孵育16小时，搅拌转速为300rpm，每间隔8小时在超净台开盖一次；
(8)孵育结束后，85℃加热15分钟，通过失活酶促反应终止反应；
(9)获得低过敏性交联高分子量HDM，在-20℃保存。
实施例3
酪氨酸酶和咖啡酸联合半乳甘露聚糖交联屋尘螨(HDM)减轻过敏性哮喘的方法，具体步骤如下：
(1)制备HDM悬浊液：将400mgHDM用1mL浓度为0.5mM的PBS溶解，获得400mg/ml的HDM悬浊液，体系pH＝6.5；
(2)将步骤(1)制备的200uLHDM悬浊液在冰浴条件下研磨成细颗粒，并用800uL浓度为0.5mM的PBS稀释，获得80mg/mL的HDM溶液；
(3)将步骤(2)制备的HDM溶液在100℃下加热处理15分钟以松散HDM的蛋白质结构
(4)用500uL浓度为0.5mM的PBS溶解1mgMan，获得16mg/ml的Man溶液；将Man溶液加入步骤(3)加热处理后的HDM溶液中；
(5)用浓度为0.5mM的PBS溶解酪氨酸酶，获得活性水平为0.8U/mg的酪氨酸酶溶液；在步骤(4)获得的溶液中加入15uL酪氨酸酶溶液引发交联反应；
(6)在步骤(5)的交联反应液中继续加入1.5mMCA提高交联效率；
(7)将步骤(6)获得的溶液置于干净无菌corning50mL离心管中，在39℃下连续搅拌孵育22小时，搅拌转速为350rpm，每间隔8小时在超净台开盖一次；
(8)孵育结束后，100℃加热15分钟，通过失活酶促反应终止反应；
(9)获得低过敏性交联高分子量HDM，在-20℃保存。
实施例2和实施例3的结果与实施例1基本一致，在此处不再赘述。
综上所述，酪氨酸酶和咖啡酸催化的交联导致了高分子量交联的形成，从而改变了HDM的构象结构和潜在的过敏反应性。酶促交联HDM抑制了HDM诱导的Th2特征性细胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)的产生，减少了嗜酸性粒细胞的募集和浸润，显著改善过敏性哮喘。
本发明可以作为一种低过敏性产品及过敏性疾病特异性免疫治疗的候选药物，并作为诱导全身免疫耐受和减轻过敏性疾病的一种有吸引力的治疗干预措施，具有显著的实际应用范围。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (4)
1.酪氨酸酶和咖啡酸联合半乳甘露聚糖交联屋尘螨在制备低过敏性交联高分子量屋尘螨中的应用，其特征在于，制备低过敏性交联高分子量屋尘螨的具体步骤如下：
（1）制备屋尘螨悬浊液：采用PBS溶液溶解屋尘螨，获得50~400mg/ml的屋尘螨悬浊液；体系pH值为6.0~9.0；
（2）将步骤（1）制备的屋尘螨悬浊液在冰浴环境下研磨成细颗粒，并进一步用PBS溶液稀释获得2~20mg/mL的屋尘螨溶液；
（3）将步骤（2）制备的屋尘螨溶液在85~100℃下加热处理15~30分钟以松散屋尘螨的蛋白质结构；
（4）采用PBS溶液溶解半乳甘露聚糖，获得0.5~4.0mg/ml的半乳甘露聚糖溶液；按半乳甘露聚糖溶液与步骤（3）所得屋尘螨溶液体积比1:2的比例，将所述半乳甘露聚糖溶液添加到步骤（3）所得屋尘螨溶液中；
（5）采用PBS溶液溶解酪氨酸酶，获得活性水平为0.2~0.8U/mg的酪氨酸酶溶液；按酪氨酸酶溶液与步骤（4）所得溶液体积比1:100的比例，将所述酪氨酸酶溶液添加到步骤（4）所得溶液中；
（6）在步骤（5）的交联反应液中继续加入0.5~1.5 mM 咖啡酸提高交联效率；
（7）将步骤（6）获得的溶液置于无菌容器中，在35~39℃下连续搅拌孵育12-24小时；所述容器大小为所盛装溶液体积的40~60倍，且在孵育过程中每间隔8小时在无菌环境下开盖更换新鲜空气一次；
（8）孵育结束后，85~100℃加热10~30分钟，通过失活酶促反应终止反应；获得低过敏性交联高分子量屋尘螨；
其中，所述PBS溶液浓度为0.2~2mM。
2.根据权利要求1所述的酪氨酸酶和咖啡酸联合半乳甘露聚糖交联屋尘螨在制备低过敏性交联高分子量屋尘螨中的应用，其特征在于，步骤（7）孵育时搅拌转速为250~500 rpm。
3.根据权利要求1所述的酪氨酸酶和咖啡酸联合半乳甘露聚糖交联屋尘螨在制备低过敏性交联高分子量屋尘螨中的应用，其特征在于，步骤（8）所得低过敏性交联高分子量屋尘螨，在-20℃保存。
4.权利要求1-3任一所述的低过敏性交联高分子量屋尘螨在制备治疗过敏性哮喘制剂中的应用。
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Legal Events
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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