CN114524874B - 漆酶/咖啡酸交联并联合半乳甘露聚糖减轻卵清蛋白过敏性的方法 - Google Patents

漆酶/咖啡酸交联并联合半乳甘露聚糖减轻卵清蛋白过敏性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了漆酶/咖啡酸交联并联合半乳甘露聚糖减轻卵清蛋白过敏性的方法，属于过敏技术领域。本发明公开的漆酶/咖啡酸交联并联合半乳甘露聚糖减轻卵清蛋白过敏性的方法，通过Lac/CA催化的交联与Man偶联，改变OVA的构象结构和致敏潜能。本发明公开的低过敏性交联高分子量OVA，可以影响T细胞介导的免疫反应；这种新的免疫治疗产品，通过减少嗜酸性气道炎症和恢复正常的Th1/Th2免疫平衡来减轻过敏性疾病的严重程度，可以作为一个潜在的ASIT候选分子来治疗过敏性疾病。

Description

漆酶/咖啡酸交联并联合半乳甘露聚糖减轻卵清蛋白过敏性 的方法
技术领域
本发明涉及过敏技术领域，更具体的说是涉及漆酶/咖啡酸交联并联合半乳甘露聚糖减轻卵清蛋白过敏性的方法。
背景技术
过敏性哮喘和食物过敏已是一个重大的公共卫生问题，占IgE介导的不良反应的90％以上。卵清蛋白(OVA)是引起过敏反应的主要危险因素。为了降低OVA的抗原性和致敏原性，之前采用过几种物理和化学方法(如热处理、糖化、静水高压、辐照等)，但在实际加工中可以广泛应用的方法较少。
目前通过甲醛和戊二醛来制备低过敏性产品，它们与赖氨酸残基的ε-氨基反应，形成分子内和分子间交联的高分子量过敏原聚合物；通过这种方式，构象IgE表位被破坏，而线性T细胞表位不受影响。然而，由于甲醛和戊二醛可能具有的毒性作用，这种改良过敏原的方法受到一定限制。
因此，提供漆酶/咖啡酸交联并联合半乳甘露聚糖减轻卵清蛋白过敏性的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是开发一种降低OVA过敏原性的技术，具体是提供漆酶/咖啡酸交联并联合半乳甘露聚糖减轻卵清蛋白过敏性的方法，使经改造后的过敏原产品可使用更高的免疫治疗起始剂量，并在短时间内达到最大剂量，产生更快的疗效。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
漆酶/咖啡酸交联并联合半乳甘露聚糖减轻卵清蛋白过敏性的方法，具体步骤如下：
(1)溶解OVA溶液：采用浓度为0.2～2mM的PBS(磷酸盐缓冲液)溶解OVA，获得0.5～4.0mg/ml的OVA溶液，体系pH＝6.0～9.0；
(2)将步骤(1)制备的OVA溶液在85～100℃下加热处理15～30分钟以松散OVA的结构；
(3)采用浓度为0.2～2mM的PBS溶解Man(半乳甘露聚糖)，获得0.5～4.0mg/ml的Man溶液；按1：1的体积比在步骤(2)加热处理后的OVA溶液中加入Man溶液；
(4)采用浓度为0.2～2mM的PBS溶解Lac，获得活性水平为0.1～0.8U/mg的Lac溶液；按25：1的体积比在步骤(3)获得的溶液中加入Lac溶液；
(5)在步骤(4)的交联反应液中继续加入0.5～1.5mM CA提高交联效率；
(6)将步骤(5)获得的溶液置于开放容器中，在35-39℃下连续搅拌孵育12-24小时(反应的容器保持打开以确保充分通气；即搅拌时，容器敞开，以便获得交联所需的氧气)；
(7)孵育结束后，85～100℃加热10～30分钟，通过失活酶促反应终止反应；
(8)获得低过敏性交联高分子量OVA，在-20℃保存。
进一步，步骤(6)所述搅拌转速为250～500rpm。
进一步，所述的低过敏性交联高分子量OVA在制备治疗过敏性和炎症性疾病药物中的应用。
漆酶(Lac)通过单电子去除机制催化酪氨酸侧链的氧化，已经显示出作为一种新型交联剂的广泛应用前景。漆酶氧化形成不稳定的芳香族自由基，可与蛋白质反应，形成交联产物。蛋白质中的酚基主要暴露在Lac介导的氧化底物中，由此产生的酚氧自由基可能同时与氨基反应，引发进一步的交联反应。此外，咖啡酸(CA)除了通过提供羟基官能团来增强Lac的交联效果，还可以在克服靶蛋白表面暴露的酪氨酸残基的缺失方面发挥部分作用，从而更有助于改变其致敏潜能。
本发明首次开发了一种基于Lac催化交联结合半乳甘露聚糖(Man)的聚合低过敏性OVA衍生物，可以影响T细胞介导的免疫反应。这种新的免疫治疗产品，通过减少嗜酸性气道炎症和恢复正常的1型辅助型T细胞(Th1)/Th2免疫平衡来减轻过敏性疾病的严重程度，可以作为一个潜在的抗原特异性免疫治疗(ASIT)候选分子来治疗过敏性疾病。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了漆酶/咖啡酸交联并联合半乳甘露聚糖减轻卵清蛋白过敏性的方法，首次通过Lac/CA催化的交联与Man偶联，改变OVA的构象结构和致敏潜能。Lac交联的OVA与Man偶联可以定位特异性连接糖与蛋白质，改善其功能特性，降低OVA的致敏性。
同时，包含多个过敏原聚合物的表面积比相同数量的过敏原单体更小，跟肥大细胞IgE交联的暴露表位更少。高分子量过敏原向致敏肥大细胞的扩散比过敏原单体更慢，此过程更可能被组织中的抗原递呈细胞干扰，从而进一步减少与致敏肥大细胞反应的机会。这些特性有助于降低交联产品的过敏原性，从而产生更快速的治疗反应。
本发明方法比以前用物理和化学方法来降低OVA的抗原性和过敏原性的效率高很多。Lac/CA交联过敏原的免疫治疗具有更高的安全性，因此比非修饰过敏原更快更简单地给药。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明漆酶(Lac)/咖啡酸(CA)催化的OVA与Man偶联时的交联流程图；
图2附图为本发明酶交联的工作原理；
图3附图为本发明天然卵清蛋白(OVA)与Lac/CA交联后的OVA的电泳、IgG结合活性的变化；
其中，A：SDS-PAGE分析交联后OVA的蛋白的变化；B：通过蛋白质印迹检测IgG对天然OVA和交联后的OVA的结合(反应)能力；
条带1：卵清蛋白；条带2：Lac-Man/OVA；M：marker蛋白；
图4附图为本发明天然OVA及Lac/CA交联的OVA的粒径变化；
其中，A：天然OVA和Lac/CA交联OVA(Lac-Man/OVA)粒径的代表性图像；B：平均粒径分布的统计分析；
图5附图为本发明天然OVA及Lac/CA交联的OVA表面电位的变化；
其中，A：天然OVA和交联OVA的zeta电位的代表性结果；B：天然OVA和交联OVA的zeta电位的平均分布的统计分析；
图6附图为本发明天然卵清蛋白(OVA)与Lac/CA交联后的OVA的紫外吸收光谱分析；
图7附图为本发明天然卵清蛋白(OVA)与Lac/CA交联后的OVA的内在荧光分析；
图8附图为本发明表面疏水性分析；
图9附图为本发明Lac/CA交联OVA结合半乳甘露聚糖在模拟胃液中的稳定性分析；
其中，A：模拟胃液(SGF)消化对天然OVA的影响；B：模拟胃液(SGF)消化对Lac-Man/OVA的影响；
图10附图为本发明Lac/CA交联OVA结合半乳甘露聚糖在模拟肠液中的稳定性分析；
其中，A：模拟肠液(SIF)消化对天然OVA的影响；B：模拟肠液(SIF)消化对Lac-Man/OVA的影响；
图9-图10中，M：标准蛋白标记物(15-180kDA)；0-60和0-120：SGF(消化性)和SIF(胰蛋白酶)消化的不同时间间隔(min)；
图11附图为本发明Lac/CA交联OVA结合Man对OVA诱导的小鼠哮喘模型浸润细胞的影响；
其中，A：在BALF中包含的细胞总数；B：肺内细胞总数；
图12附图为本发明Lac/CA交联OVA结合Man对OVA诱导的小鼠哮喘模型炎症相关基因的影响；
其中，A-E分别为采用qPCR方法检测炎症因子IL-10、IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-13mRNA的表达；
图11-图12中，结果以每组4～6只小鼠的平均值±标准差表示。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001与OVA组相比；
图13附图为本发明苏木精/伊红(H&E)染色分析炎症细胞浸润情况；放大倍数400x，比例尺：50μm；放大倍数100x，比例尺：200μm；
图14附图为本发明肺切片周期性酸希夫(PAS)染色，测量气道周围黏液高分泌；放大倍数400x，比例尺：50μm；放大倍数100x，比例尺：200μm；
图15附图为本发明流式细胞术定量检测肺组织髓细胞中的嗜酸性粒细胞；
其中，A：流式细胞术检测结果直观图；B：统计图；
图16附图为本发明流式细胞术定量检测肺泡灌洗液(BALF)髓细胞中的嗜酸性粒细胞；
其中，A：流式细胞术检测结果直观图；B：统计图；
图15-图16中，与OVA组相比，*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
漆酶/咖啡酸交联并联合半乳甘露聚糖减轻卵清蛋白过敏性的方法，具体步骤如下：
(1)溶解OVA溶液：将2mg OVA用1ml浓度为1mM的PBS溶解，获得2mg/ml的OVA溶液，体系pH＝7.4；
(2)将步骤(1)制备的OVA溶液在90℃下加热处理20分钟以松散OVA的结构；
(3)将2mg Man用1ml浓度为1mM的PBS溶解，获得2mg/ml的Man溶液；将Man溶液加入步骤(2)加热处理后的OVA溶液中；
(4)将Lac用浓度为1mM的PBS溶解，获得活性水平为0.5U/mg的Lac溶液；在步骤(3)获得的溶液中加入80μl Lac溶液引发交联反应；
(5)在步骤(4)的交联反应液中继续加入1mM CA提高交联效率；
(6)将步骤(5)获得的溶液置于37℃下连续搅拌孵育24小时，搅拌转速为250rpm，反应的容器保持打开以确保充分通气；
(7)孵育结束后，95℃加热10分钟，通过失活酶促反应终止反应；
(8)获得低过敏性交联高分子量OVA(Lac-Man/OVA)，在-20℃保存。
漆酶(Lac)/咖啡酸(CA)催化的OVA与Man偶联时的交联流程图见图1；酶交联的工作原理见图2。
试验例
利用体外和体内模型评价Lac-Man/OVA的SDS-PAGE谱、构象结构、粒径分布、消化稳定性、免疫治疗潜力。
1)蛋白质电泳和蛋白质印迹实验验证交联前后卵清蛋白的变化
通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测Lac/CA交联后蛋白分子的变化。天然OVA或Lac/CA交联后的OVA(Lac-Man/OVA)样品分别与溴酚蓝缓冲液以4:1(v:v)的比例混合，然后在100℃加热变性7分钟。将样品和蛋白质标记物(14–180.0kDa)加入含有12％分离胶和5％浓缩胶中。用80V(浓缩胶)和120V(分离胶)的恒定电压进行电泳。用考马斯亮蓝R-250染料染色后，凝胶脱色后拍摄图像，结果见图3A。图3A显示：OVA经交联后，在分子量40处的表位消失或者减弱了。
电泳后，转移到PVDF膜上，进行蛋白质印迹以观察天然OVA和Lac-Man/OVA的IgG结合活性的变化，结果见图3B。图3B显示：OVA经交联后，与IgG的结合能力也显著下降。
2)交联前后卵清蛋白(OVA)颗粒大小及表面电位的变化
采用激光纳米粒度仪对交联前后的OVA的粒径大小进行表征，结果见图4；结果发现，天然OVA的粒径大小约为2000纳米，而经交联后，粒径增大到3500nm左右。
Zeta电位测定结果见图5，交联后，OVA的表面电位略有增加，但没有统计学差异。
3)光谱法分析OVA交联前后的结构变化
在室温下分别使用UV-1101光谱仪(Techcomp Co.Shanghai，China)和F-4600荧光分光光度计(Hitachi，Tokyo，Japan)进行紫外吸收和固有荧光光谱分析。所有样品的浓度在PBS中最终确定为0.2mg/mL。对于紫外光谱，使用光程为1cm的矩形石英比色皿，并以400nm/min的速度从230-350nm扫描。此外，所有样品的本征荧光均使用280nm和300-400nm的激发和发射波长，扫描速度为1200nm/s，狭缝宽度为5nm。按照前面描述的方法，使用ANS(1-苯胺基-8-萘磺酸盐)作为荧光探针观察天然和交联OVA的表面疏水性。为了观察表面疏水性的变化，使用380nm的激发波长和400-600nm的发射波长测定天然OVA和交联OVA的固有荧光。以1200nm/s的扫描速度和5nm的狭缝宽度进行分析。结果见图6-图8。
图6显示，天然卵清蛋白(OVA)与Lac/CA交联后的OVA的紫外吸收光谱分析：交联后卵清蛋白的吸收峰红移，说明原来的表型表位在交联后被隐藏，表位发生了红移。吸收峰从271nm增加到276nm；在276nm处的吸收度从0.742增加到1.656，吸收度增加了123.2％。
图7显示，天然卵清蛋白(OVA)与Lac/CA交联后的OVA的内在荧光分析：卵清蛋白交联后，自发荧光强度降低了91.39％。
图8显示，催化交联后的OVA，表面疏水性降低了28.78％。
4)交联的OVA(Lac-Man/OVA)模拟消化道环境下的稳定性检测
根据公开报道的方法(Ahmed et al.,2020；Lv et al.,2017b)观察天然OVA和Lac-Man/OVA的消化测定。体外模拟胃液环境(Simulated gastric fluid，SGF)，体外模拟肠液消化环境(simulated intestinal fluid，SIF)均按照美国药典(2004)中的说明制备。SGF在NaCl(25mM)中含有猪胃蛋白酶(184U/mg蛋白质)，pH为1.2。在每个样品中加入测试蛋白质之前，将SGF(胃蛋白酶与蛋白质的比例为1：2.2，w:w)在37℃下预热15分钟。加入样品后，在37℃震荡环境下，处理不同时间(0、2、5、15、30和60分钟)，添加Na2CO3(0.2M)以停止消化过程，并取样检测。
肠液环境(SIF1:11胰蛋白酶与蛋白质，w:w)蛋白的稳定性测试与胃液环境类似，即处理不同时间(0、2、10、30、60和120分钟)后，通过在95℃下加热样品5分钟终止反应。
通过SDS-PAGE分析经消化液处理后的样品，结果见图9和图10。
根据图9 SDS-PAGE的结果，天然OVA的原条带在1小时内被胃蛋白酶轻微消化(图9A)。在Lac-Man/OVA的病例中，在消化2分钟后，45kDa处的OVA条带完全消失。Lac-Man/OVA的高分子量聚合物在胃消化1小时后完全降解(图9B)。结果表明，随着消化时间的增加，降解程度更加明显。
同样，根据图10 SDS-PAGE的结果，天然OVA在60分钟前对胰蛋白酶消化具有高稳定性，而在SIF中只有轻微的降解(图10A)。在Lac-Man/OVA的情况下，原始的OVA条带在消化时间2分钟后几乎消失，导致在16和22kDa左右形成被消化的片段(图10B)。消化30分钟后，22kDa的片段随着加热时间增加，蛋白密度降低，完全消化。大分子条带一直保留到10分钟，经胰蛋白酶消化30分钟后完全消失。SGF和SIF结果表明，Lac催化交联结合Man显著提高了OVA的消化率。结果显示，Lac-Man/OVA对消化和胰蛋白酶消化具有较高的敏感性，而天然蛋白具有较高的抗性。
5)OVA诱导小鼠哮喘模型
在第0天和第12天，6周玲雌性野生型(WT)C57BL/6小鼠通过腹腔(ip)注射50μg天然OVA(Sigma-Aldrich公司，美国)+2mg明矾(Thermo Scientific，美国)，构建小鼠哮喘模型；或者腹腔注射50μg交联OVA+2mg明矾，作为对照组。结果发现，只有天然OVA能诱导哮喘，而交联OVA不能诱导哮喘，体现了交联OVA的脱敏功能。
在第0天和第12天，6周玲雌性野生型(WT)C57BL/6小鼠通过腹腔(ip)注射50μg天然OVA+2mg明矾，或者50μg交联OVA+2mg明矾；然后在第20、21、22、23和24天用150μg OVA或交联OVA滴鼻干预小鼠。最后一次免疫后24小时麻醉所有小鼠，收集肺、肺泡灌洗液、血液等样品待测。即小鼠具体分为两组：第一组：腹腔注射天然OVA两次(第0天，第12天)，从第20天到24天，每天滴鼻天然OVA一次，共五天，第25天麻醉，取样本；第二组：腹腔注射交联OVA两次(第0天，第12天)，从第20天到24天，每天滴鼻交联OVA一次，共五天，第25天麻醉，取样本。
6)肺泡灌洗液(BALF)收集和肺单核细胞分离和分析
BALF收集：小鼠麻醉，使用20号钝针的气管插管用冷PBS反复灌洗肺组织三次。灌洗液在4℃下以400xg离心5分钟。
制备肺单核细胞：将肺组织取出、剪碎，加入含5％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，内含1mg/ml胶原酶，消化组织45分钟，然后使用38％Percoll梯度(GE Healthcare LifeSciences)富集细胞。用ACK裂解缓冲液(R&D Systems)裂解红细胞并再次离心细胞。弃去上清液后，将细胞重悬于1ml2％胎牛血清的PBS中。
通过在血细胞计数器上计数细胞来确定细胞总数。结果见图11。与OVA组相比，相同剂量的交联OVA处理显著降低了BALF中的浸润细胞总数(图11A和图11B)。
7)肺组织的RNA提取和qPCR分析
用TRIzol(Invitrogen)提取肺组织的总RNA。使用cDNA RT试剂盒(AppliedBiosystems，Foster City，CA，USA)从总RNA合成互补cDNA。使用Applied Biosystems 7900PCR系统和SYBR Green PCR Master Mix检测基因(IL-4、IL-5、IL-10、IL-13和IFN-γ)表达的变化，结果见图12。
图12的qPCR分析数据显示，交联OVA显著抑制了Th2型细胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)的分泌，提高了IL-10和IFN-γ在肺组织的表达(图12A-图12E)。
8)肺组织病理切片检测
麻醉后的小鼠，经心脏灌注后，取出小鼠肺组织左叶，用4％多聚甲醛(PFA)室温固定24h，石蜡包埋。之后，将肺组织切成5μm的切片并放置在载玻片上并脱蜡。为了评估炎症细胞浸润，组织依次用苏木精和伊红(H&E)染色。而杯状细胞则使用高碘酸-希夫(PAS)染色进行鉴定。光学显微镜成像评估组织病理学指征。
苏木精/伊红(H&E)染色分析炎症细胞浸润情况见图13。图13结果显示：采用卵清蛋白(OVA)干预后，成功诱发了小鼠的气道炎症，气道周围显示出大量的炎性细胞，而经漆酶/咖啡酸(Lac/CA)交联后的OVA对小鼠滴鼻后，并没有诱发气道炎症，说明OVA经交联后，可以成功使天然OVA脱敏。
肺切片周期性酸希夫(PAS)染色，测量气道周围黏液高分泌见图14。图14结果显示：采用卵清蛋白(OVA)干预后，成功诱发了小鼠的气道炎症，气道周围分泌大量黏液，而经漆酶/咖啡酸(Lac/CA)交联后的OVA对小鼠滴鼻后，并没有诱发明显的气道炎症和黏液分泌，说明OVA经交联后，可以成功使天然OVA脱敏。
图13-图14结果表明，与正常对照组相比，OVA组出现了严重的气道炎症反应和杯状细胞黏液分泌。相反，交联OVA组在很大程度上抑制了OVA诱导的肺部炎症和杯状细胞黏液分泌。
流式细胞术定量检测肺组织髓细胞中的嗜酸性粒细胞，结果见图15。图15结果显示：腹腔注射天然OVA后的小鼠，经OVA滴鼻干预后，肺组织中分泌出大量的嗜酸粒细胞；而腹腔注射交联OVA后的小鼠，经交联的OVA滴鼻干预后，肺组织中没有明显嗜酸粒细胞浸润，说明OVA经交联后，可以成功使天然OVA脱敏。
流式细胞术定量检测肺泡灌洗液(BALF)髓细胞中的嗜酸性粒细胞，结果见图16。图16结果显示：腹腔注射天然OVA后的小鼠，经OVA滴鼻干预后，肺泡灌洗液(BALF)中分泌出大量的嗜酸粒细胞；而腹腔注射交联OVA后的小鼠，经交联的OVA滴鼻干预后，肺泡灌洗液中没有明显嗜酸粒细胞浸润，说明OVA经交联后，可以成功使天然OVA脱敏。
图15-图16结果表明，交联OVA组肺组织嗜酸性粒细胞浸润明显减轻。
实施例2
漆酶/咖啡酸交联并联合半乳甘露聚糖减轻卵清蛋白过敏性的方法，具体步骤如下：
(1)溶解OVA溶液：将4mg OVA用1ml浓度为2mM的PBS溶解，获得4mg/ml的OVA溶液，体系pH＝8.8；
(2)将步骤(1)制备的OVA溶液在100℃下加热处理15分钟以松散OVA的结构；
(3)将4mg Man用1ml浓度为2mM的PBS溶解，获得4mg/ml的Man溶液；将Man溶液加入步骤(2)加热处理后的OVA溶液中；
(4)将Lac用浓度为2mM的PBS溶解，获得活性水平为0.2U/mg的Lac溶液；在步骤(3)获得的溶液中加入80μl Lac溶液引发交联反应；
(5)在步骤(4)的交联反应液中继续加入1.5mM CA提高交联效率；
(6)将步骤(5)获得的溶液置于35℃下连续搅拌孵育18小时，搅拌转速为350rpm，反应的容器保持打开以确保充分通气；
(7)孵育结束后，90℃加热30分钟，通过失活酶促反应终止反应；
(8)获得低过敏性交联高分子量OVA(Lac-Man/OVA)，在-20℃保存。
实施例3
漆酶/咖啡酸交联并联合半乳甘露聚糖减轻卵清蛋白过敏性的方法，具体步骤如下：
(1)溶解OVA溶液：将0.5mg OVA用1ml浓度为0.2mM的PBS溶解，获得0.5mg/ml的OVA溶液，体系pH＝6.2；
(2)将步骤(1)制备的OVA溶液在85℃下加热处理30分钟以松散OVA的结构；
(3)将0.5mg Man用1ml浓度为0.2mM的PBS溶解，获得0.5mg/ml的Man溶液；将Man溶液加入步骤(2)加热处理后的OVA溶液中；
(4)将Lac用浓度为0.2mM的PBS溶解，获得活性水平为0.8U/mg的Lac溶液；在步骤(3)获得的溶液中加入80μl Lac溶液引发交联反应；
(5)在步骤(4)的交联反应液中继续加入0.5mM CA提高交联效率；
(6)将步骤(5)获得的溶液置于39℃下连续搅拌孵育12小时，搅拌转速为500rpm，反应的容器保持打开以确保充分通气；
(7)孵育结束后，85℃加热30分钟，通过失活酶促反应终止反应；
(8)获得低过敏性交联高分子量OVA(Lac-Man/OVA)，在-20℃保存。
实施例2和实施例3的结果与实施例1基本一致，在此处不再赘述。
综上所述，Lac/CA催化的交联导致了高分子量交联的形成，从而改变了OVA的构象结构和潜在的过敏性。交联OVA抑制了OVA诱导的Th2细胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)的产生，显著改善过敏性哮喘。
本发明可以作为一种低过敏性产品及过敏性疾病特异性免疫治疗的候选药物，并作为诱导全身免疫耐受和减轻过敏性疾病的一种有吸引力的治疗干预措施，具有显著的实际应用范围。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (2)

1.漆酶/咖啡酸交联并联合半乳甘露聚糖减轻卵清蛋白过敏性的方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）溶解OVA溶液：采用浓度为0.2~2mM的PBS溶解OVA，获得0.5~4.0mg/ml的OVA溶液，体系pH=6.0~9.0；
（2）将步骤（1）制备的OVA溶液在85~100℃下加热处理15~30分钟以松散OVA的结构；
（3）采用浓度为0.2~2mM的PBS溶解半乳甘露聚糖，获得0.5~4.0mg/ml的半乳甘露聚糖溶液；按1：1的体积比在步骤（2）加热处理后的OVA溶液中加入半乳甘露聚糖溶液；
（4）采用浓度为0.2~2mM的PBS溶解漆酶，获得活性水平为0.1~0.8U/mg的漆酶溶液；按25：1的体积比在步骤（3）获得的溶液中加入漆酶溶液；
（5）在步骤（4）的交联反应液中继续加入0.5~1.5 mM 咖啡酸提高交联效率；
（6）将步骤（5）获得的溶液置于开放容器中，在35-39℃下连续搅拌孵育12-24小时；
（7）孵育结束后，85~100℃加热10~30分钟，通过失活酶促反应终止反应；
（8）获得低过敏性交联高分子量OVA，在-20℃保存。
2.根据权利要求1所述的漆酶/咖啡酸交联并联合半乳甘露聚糖减轻卵清蛋白过敏性的方法，其特征在于，步骤（6）所述搅拌转速为250~500 rpm。
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