KR20080107546A

KR20080107546A - 방사선이 조사된 오브알부민을 유효성분으로 함유하는알레르기 질환 예방 및 치료용 백신 조성물

Info

Publication number: KR20080107546A
Application number: KR1020070055431A
Authority: KR
Inventors: 변명우; 이주운; 김재훈; 서지현
Original assignee: 한국원자력연구원
Priority date: 2007-06-07
Filing date: 2007-06-07
Publication date: 2008-12-11
Also published as: US20080306010A1

Abstract

본 발명은 방사선이 조사된 오브알부민(ovalbumin)을 유효성분으로 함유하는 알레르기 질환 예방 및 치료용 백신 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 계란의 난백에서 분리, 정제한 오브알부민에 방사선을 조사하여 알레르기 질환 예방 및 치료 백신용의 면역원을 제조하는 방법, 상기 방법으로 제조된 방사선 조사-오브알부민을 유효성분으로 함유하는 알레르기 질환 예방 및 치료용 백신 조성물, 그리고 상기의 조성물을 유효성분으로 함유하는 백신을 이용하여 알레르기 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 방사선 조사-오브알부민으로 예방 면역된 마우스에서는 체액성 및 세포성 면역원성이 모두 감소됨으로써 알레르기 반응의 유도가 억제되므로, 본 발명의 조성물은 알레르기 질환의 예방 및 치료용 백신으로 매우 유용하게 이용될 수 있다.

방사선 조사, 알레르겐(allergen), 변성면역원, 알레르기 백신, 계란, 오브알부민(ovalbumin)

Description

방사선이 조사된 오브알부민을 유효성분으로 함유하는 알레르기 질환 예방 및 치료용 백신 조성물{A vaccine composition containing irradiated ovalbumin for the prevention and treatment of allergic disease}

도 1은 방사선이 조사된 오브알부민(ovalbumin, OVA)을 함유하는 알레르기 예방 백신의 알레르기 유도 저해에 관한 내용을 모식화하여 나타낸 그림이다.

도 2는 본 발명의 방사선 조사-오브알부민을 마우스에 면역한 후, 알레르기 반응을 유도하여 혈청 내 오브알부민(OVA) 특이 항체 중, IgGAM과 IgE의 생산 정도를 나타낸 그림이다:

*: p <0.001;

N: 어떤 처리도 하지 않은 정상 마우스군;

I: 면역과정 없이 알레르기만 유도한 대조군;

0: 비조사된 오브알부민으로 면역한 후, 알레르기를 유도한 대조군;

10: 10 kGy로 조사된 오브알부민으로 면역한 후, 알레르기를 유도한 실험군;

40: 40 kGy로 조사된 오브알부민으로 면역한 후, 알레르기를 유도한 실험군; 및

100: 100 kGy로 조사된 오브알부민으로 면역한 후, 알레르기를 유도한 실험군.

도 3은 방사선 조사-오브알부민을 마우스에 면역한 후, 알레르기 반응을 유도하여 혈청 내 오브알부민(OVA) 특이 항체 중 하위그룹의 항체의 생산 정도를 나타낸 그림이다:

*: p <0.05;

**: p<0.01;

***: p<0.001;

N: 어떤 처리도 하지 않은 정상 마우스군;

I: 면역과정 없이 알레르기만 유도한 대조군;

도 4는 방사선 조사-오브알부민으로 면역한 후, 알레르기 반응을 유도한 마우스에서 분리된 비장세포의 T 세포에서 분비된 싸이토카인을 측정하여 나타낸 그림이다:

**: p<0.01;

***: p<0.001;

N: 어떤 처리도 하지 않은 정상 마우스군;

I: 면역과정 없이 알레르기만 유도한 대조군;

도 5는 방사선 조사-오브알부민으로 면역한 후, 알레르기 반응을 유도한 마우스에서 분리된 비장세포의 T 세포 증식능을 나타낸 그림이다:

*: p <0.001;

N: 어떤 처리도 하지 않은 정상 마우스군;

I: 면역과정 없이 알레르기만 유도한 대조군;

40: 40 kGy로 조사된 오브알부민으로 면역한 후, 알레르기를 유도한 실 험군; 및

도 6은 방사선 조사-오브알부민을 마우스에 면역시킨 후, 비장세포를 분리하여 T 세포 및 B 세포로 다시 분리한 후, 각각의 세포를 어떤 처리도 되어있지 않은 마우스의 정맥 내에 주사하고 알레르기 반응을 유도하여 혈청 내 오브알부민(OVA) 특이 항체 중, IgGAM을 측정하여 나타낸 그림이다:

*: p <0.05;

**: p<0.01;

N: 어떤 처리도 하지 않은 정상 마우스군;

I: 어떤 처리도 하지 않은 마우스에 알레르기만 유도한 대조군;

도 7은 방사선 조사-오브알부민을 마우스에 면역시킨 후, 비장세포를 분리하여 T 세포 및 B 세포로 다시 분리한 후, 각각의 세포를 어떤 처리도 되어있지 않은 마우스의 정맥 내에 주사하고 알레르기 반응을 유도하여 혈청 내 오브알부민(OVA) 특이 항체 중, IgE를 측정하여 나타낸 그림이다:

*: p <0.05;

**: p<0.01;

***: p<0.001;

N: 어떤 처리도 하지 않은 정상 마우스군;

도 8은 방사선 조사-오브알부민을 마우스에 면역시킨 후, 비장세포를 분리하여 T 세포 및 B 세포로 다시 분리한 후, 각각의 세포를 어떤 처리도 되어있지 않은 마우스의 정맥 내에 주사하고 알레르기 반응을 유도하여 혈청 내 오브알부민(OVA) 특이 항체 중, IgG1와 IgG2a를 측정하여 나타낸 그림이다:

*: p <0.05;

**: p<0.01;

***: p<0.001;

N: 어떤 처리도 하지 않은 정상 마우스군;

도 9는 방사선 조사-오브알부민을 마우스에 면역시킨 후, 분리된 비장세포에서 T 세포를 분리하여 어떤 처리도 되어있지 않은 마우스의 정맥 내에 주사하고 알레르기 반응을 유도하여 T 세포 증식능을 나타낸 그림이다:

*: p <0.05;

**: p<0.01;

N: 어떤 처리도 하지 않은 정상 마우스군;

본 발명은 방사선이 조사된 오브알부민(ovalbumin)을 유효성분으로 함유하는 알레르기 질환 예방 및 치료용 백신 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 계란의 난백에서 분리, 정제한 오브알부민에 방사선을 조사하여 알레르기 질환 예방 및 치료 백신용의 면역원을 제조하는 방법, 상기 방법으로 제조된 방사선 조사-오브알부민을 유효성분으로 함유하는 알레르기 질환 예방 및 치료용 백신 조성물, 그리고 상기의 조성물을 유효성분으로 함유하는 백신을 이용하여 알레르기 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

알레르기 질환(allergic disease)은 선진국뿐만 아니라 국내에서도 발생되고 있으며 그 유병률은 매년 증가하고 있다. 알레르기를 일으키는 원인 항원인 알레르겐(allergen)에는 집먼지 진드기, 벌독, 꽃가루 또는 식품 등이 있으며, 알레르기는 알레르겐에 대해 특이 IgE 항체를 가진 사람이 임상적인 증후를 보이는 경우 를 일컫는다. 알레르기 반응은 국소적인 두드러기, 발진, 알레르기성 비염, 천식 뿐 아니라 아나필락시스(anaphylaxis)와 같은 전신적인 반응을 일으켜 심할 경우, 사망에 이를 수 있다(Broide DH. J Allergy Clin Immunol 2001; 108:s65-71).

특히, 식품 알레르기는 특정 식품에 대해 IgE가 매개된 면역과민 반응을 나타내는 것으로 정의된다. 식품 알레르기는 지난 20년간 미국과 유럽 지역을 중심으로 지속적으로 증가하여 유병률은 성인의 경우 2% 이상, 아동의 경우 8% 이상으로 보고되고 있다(Sampson HA. J Allergy Clin Immunol 2003; 111:s540-7).

식품 알레르기는 대부분 3세 미만의 영유아기에 나타나는데, 식품 알레르기 질환을 가진 아동의 90% 이상은 우유, 계란, 대두, 밀가루, 땅콩 또는 어패류에 알레르기 증상을 나타내며 성인의 경우에는 땅콩 및 어패류에서 증상이 나타난다. 국내에서는 고등어, 복숭아, 돼지고기, 우유, 계란, 메밀, 갑각류, 밀, 번데기, 토마토 등에 의한 알레르기 유발이 높은 것으로 보고되고 있으며 이는 식이 습관의 차이에 따라 다양하다(김세훈 외, 천식 및 알레르기 2003;23: 502-14; 한재숙 외, 한국식품영양학회지 1997;26:1-9).

식품 알레르기에 대한 임상적인 증후의 대부분은 소화기와 피부에서 나타난다. 소화기 질환은 주로 알레르기성 호산구성 위장염(allergic eosinophilic gastroenteritis)에 의한 소화불량, 설사, 구토 등이 일어나며 피부질환에서는 피부 발진, 아토피성 피부염, 두드러기 및 혈관부종과 같은 다양한 형태로 증상을 보인다.

식품의 단백질은 소화기를 거쳐 점차 작은 분자량의 펩타이드와 아미노산으로 분해되며 이것들은 소장세포에 흡수된다. 알레르겐 흡수에 대한 신체 조직의 생리학적, 면역학적인 장벽에도 식품 알레르겐들은 영아 및 미숙한 소화기관을 가진 아동의 소화기 내로 들어오게 된다(Metchlfe DD, et al., Blackwell Science, USA, 1997).

식품 알레르겐은 장관 내의 M 세포(microfold cell)를 통해 들어와 소장 점막 내로 들어오게 되어 수지상 세포와 같은 항원제시세포(antigen-processing cell)에 도달하게 된다. 항원제시세포에 의해 만들어진 펩타이드는 주 조직적합 복합체 II[MHC(major histocompatibility complex) class II] 분자와 함께 세포막 밖으로 발현하게 된다(Mayer L. Am J Physiol 274:G7-9, 1998). 이러한 가공 과정을 통해 항원제시세포가 활성화 되면 T 세포를 자극하고 또한 활성화시킬 수 있다.

항원 펩타이드와 MHC class II 분자 및 기타 공동자극신호 분자들과의 상호작용을 통해 조력 T 세포-2(Type 2 Helper T cell; Th2 cell)는 IL-4의 방출과 함께 IgE의 합성을 조절하고 IL-5와 IL-13에 의한 염증반응과 관련된 호산구를 생산하게 된다. 이러한 싸이토카인(cytokinke)들은 조력 T 세포와 B 세포를 자극하여 B 세포에서 IgE 항체가 생산되도록 한다. IgE의 생산은 식품 알레르기에서 매우 중요한 매개 물질로 작용한다. IgE 항체는 장내 점막에 있는 비만세포(mast cell) 또는 혈액 내에 있는 호염구에 도달하게 되면 일단 IgE 항체 분자가 비만세포 표면의 고친화성 수용체(FcεRⅠ)에 부착하여 비만세포의 탈과립화를 유도하고 히스타 민과 같은 매개물질을 방출하는 것을 촉진시킨다(Broide DH. J Allergy Clin Immunol, 108:S65-71, 2001). 이러한 염증매개 물질은 기관지, 피부, 눈이나 위장관의 표적기관에 부착하여 알레르기 증상을 일으킨다.

식품 알레르기는 위험한 반응에 대한 잠재성이 있는데도 불구하고 특정한 치료법이 없는 질환이다(Nowak-Wegrzyn A. Inflammation & Allergy-Drug Targets, 5:23-34, 2006). 현재까지 알려진 식품알레르기를 예방하기 위한 최선의 방법은 원인식품 또는 원인식품을 함유한 가공식품을 섭취하지 않는 것이며, 영아의 알레르기 발생 예방을 위해 산모에게 원인식품의 섭취를 제한하도록 한 후, 모유수유를 하게 하는 것이다. 그러나 실제로 원인식품의 완전 제한은 어려우며, 영유아의 성장발달 장애나 영양 불균형을 초래할 수 있다. 또한, 제한 식이가 실패하거나 효과적으로 알레르기 반응이 조절되지 않을 때 또는 급성 알레르기성 증후가 나타날 경우에는 코르티코스테로이드(corticosteroid), 항히스타민제(anti-histaminics), 쇼듐 크로모글리케이트(sodium chromoglicate)와 같은 약물치료를 병행하는 방법이 시행되어 왔으나, 지속적인 사용에 따른 부작용이 일어날 수 있어 일반적으로는 부적절하며 근본적인 해결책의 마련이 필요하다.

이상과 같은 부작용을 감소시키고 알레르기를 치료하기 위해 면역요법이 시행되어왔다. 알레르겐 면역 요법은 IgE 항체가 매개된 환자에 대해 알레르겐에 의한 임상적인 증후의 완화를 목적으로 특이 알레르겐(알레르겐 추출물)을 투여할 때마다 증량시켜 면역학적인 관용을 유도하며 특히 호흡기 알레르기에서는 효과적으 로 사용이 되고 있다. 알레르겐 면역요법을 시행하게 되면 면역학적으로 조력세포의 2가지 반응의 변화가 일어난다. 즉, Th2 면역반응은 혈청 내 IgE 항체, IL-4, IL-5의 싸이토카인의 함량이 감소하며, Th1 면역반응으로 알려져 있는 혈청 내 IgG2a 항체 및 IFN-γ의 싸이토카인의 함량이 증가하여 Th1의 면역 반응으로 유도한다(WHO. WHO position paper, Geneva, Jan 27-29, 1997).

최근에는 식품 알레르겐과 알레르기를 일으키는 이러한 면역학적인 기전에 대한 연구를 바탕으로 식품 알레르기의 치료와 예방에 대한 기술을 발전시키고 있다. 그러나 1900년대부터 시작되어 식품알레르기를 저해하기 위한 연구는 아직까지 특별한 치료법을 내어놓고 있지 못한 상태이다.

IgE 매개 식품 알레르기 질환에 대한 면역요법 연구는 100년 전부터 시작하였으며, 생선 알레르기를 치료하기 위해 면역 주사 요법이 처음 사용되었으며 성공적인 탈감작 결과를 얻었다. 그러나 임상적인 시험 결과, 성공적인 탈감작화를 유도하였지만 호흡기 알레르기에 비해 알레르기 면역요법 동안 전신적인 과민반응의 위험성이 높아 현재 면역 주사요법의 사용을 권하고 있지 않다(Burks AW. Allergy 67:121-4, 2003).

식품 알레르기뿐만 아니라 알레르기 질환에 대한 면역 요법의 부작용을 감소시키기 위해 현재 연구되고 있는 기술들은 항-IgE 항체, 펩타이드, 재조합 알레르겐(미국 특허 US 2005/0774464), 변성 알레르겐, 프로바이오틱스(한국 특허 KR20040068820 및 한국 특허 KR20060088341), 플라스미드 DNA, 올리고디옥시뉴클레오타이드(oligodeoxynucleotide)와 Th1 보강제 병행이 있다.(Pons L, et al., Curr Opin Allergy Clin Immunol 5:558-62, 2005; Nowak-Wegrzyn A. Inflammation & Allergy-Drug Targets 5:23-34, 2006; Crameri R, et al., Curr Opin Immunol, 18:761-8, 2006). 또한 알레르기를 치료하기 위해 한약재제의 사용(국제 공개 WO 2005/092360) 또는 히스타민억제제(국제 공개 WO 2006/038656)를 이용할 수 있다.

이러한 기전들은 알레르기가 일어나는 과정에서 분비되는 물질(히스타민)의 생성을 억제하거나 Th1 면역 반응을 증강시키면서 Th2 반응을 감소시키는데 목적을 두고 있다. 알레르겐을 이용하여 실시하는 면역요법을 살펴보면 현재 가장 많이 사용되고 있는 알레르겐 추출물, 재조합 알레르겐 및 물리적으로 변성시킨 알레르겐, 화학적으로 변성시킨 알레르겐이 있다. 재조합 알레르겐은 그 구조가 알레르겐과 매우 유사하기 때문에 알레르겐 추출물의 표준화를 위한 하나의 대안으로 보고 있지만 면역 요법 동안 부작용을 일으킬 수 있는 단점도 있다. 물리, 화학적으로 처리한 알레르겐을 이용하는 방법으로 IgE와의 결합력이 거의 없으며 T 세포와의 반응은 유지할 수 있도록 하여 기존의 방법에 비해 보다 안전한 알레르기의 예방 및 치료가 가능하다. 알레르겐을 알루미늄 하이드로옥사이드(aluminum hydroxide)와 같은 보강제에 흡착시켜서 축적 효과를 발생시켜 주입 횟수를 줄이는 물리적인 방법과 포름 알데히드(formaldehyde) 및 글루타르알데히드(glutaldehyde)와 같은 화학시약을 이용하여 알레르겐(알레고이드, allergoid)을 중합시켜(미국 특허 5354848) 동물실험에서 알레르기 반응의 지표가 되는 IgE, IgG 및 IL-4의 함 량을 감소시킨 바 있다(Hayglass KT, Stefura WP. J Immunol 147:2455-60, 1991). 그러나 알레고이드는 원래의 알레르기 추출물에서 시행한 것과 비교하여 중합되어 있는 알레르겐의 형태 때문에 많은 양을 투여할 수 있다. 따라서 알레고이드는 투여 횟수가 낮아 환자의 내원 빈도도 낮다는 장점이 있지만 화학적인 중합에 의해 표준화된 조성물을 일괄적으로 제조하기에 어려운 점이 있다.

성공적인 알레르겐 면역요법은 면역학적으로 알레르겐 차단 항체(IgG)의 생산 유도, 호산구 및 T 세포가 조직으로 모이는 현상의 완화, Th2 면역반응에서 Th1 면역반응으로의 패턴의 변화 또는 T 세포 무반응의 유도와 관련된다(Frew AJ. J Allergy Clin Immunol, 111:s 712-9, 2003). 따라서 면역관용 및 Th2 반응의 저해를 위한 알레르겐 조성 또는 보강제에 대한 연구가 상기한 바와 같이 행해지고 있다.

한편, 방사선 조사 기술은 감마선(Co-60 또는 Cs-137), 전자선, X-선 등의 방사능 물질이나 방사선 발생장치에서 나오는 에너지 즉, 이온화된 방사선 에너지를 0.01 kGy ~ 200 kGy 조사선량으로 식품에 조사하는 것으로 식품의 발아억제, 숙도지연, 기생충 및 해충구제, 부패 및 병원성 미생물의 살균 등에 이용된다. 또한, 최근에는 방사선 조사가 식품살균의 목적 외에도 식품 가공 및 저장 중 발생할 수 있는 나이트로즈아민(Nitrosamine)과 바이오제닉아민(Biogenic amine)과 같은 발암성 물질의 구조를 변화시켜 그 독성을 감소시킬 수 있는 것으로 알려졌다.

이와 유사한 연구로 방사선 조사를 이용하여 식품의 알레르기 유발물질을 감 소시키기 위한 몇몇 연구가 수행되었다. 대표적인 알레르기 유발 식품인 계란(Lee JW, et al., J Food Prot 65:1196-9, 2002), 우유(Lee JW, et al., J Food Prot 64:272-6, 2001) 및 새우(Byun MW, et al., J Food Prot 63:940-4, 2000)의 주요 알레르겐에 방사선을 조사한 결과 방사선 조사된 알레르겐은 알레르기 환자의 혈청에 존재하는 IgE와의 결합능이 현저하게 감소하는 것으로 나타났으며, 펩신과 트립신을 이용한 소화 안정성 측정 결과에서 방사선 조사된 계란의 알레르겐인 오브알부민의 알레르기 유발원성(allergenicity)이 소화효소 처리에 의해 더욱 감소되는 것을 확인할 수 있었다(Seo JH, et al., J Food Prot 67:1463-8, 2004). 또한, 계란으로부터 난백을 분리하고 방사선을 조사한 후 빵을 제조하였을 경우에도 알레르기환자의 혈청 IgE와의 결합능이 감소되어 방사선 조사가 식품의 알레르기 유발물질 감소에 효과적임을 확인하였다(Lee JW, et al., Radiat Physics Chem 72:645-650, 2005). 이상에 기술된 것과 같이, 방사선 조사 기술을 이용하여 변형된 알레르겐의 구조는 알레르기원성을 감소시켰다. 이에 따라 방사선 조사 처리된 알레르겐을 실험동물에 복강으로 주사한 후 측정된 면역원성 변화는 IgE 및 그 이외의 항체 서브클래스의 반응이 감소되었으며, IL-4 및 다른 싸이토카인의 반응 또한 감소되었다(Seo JH, et al., Int Immunopham. 7:464-72, 2007).

이에, 본 발명자들은 방사선 기술을 이용하여 알레르기 유발 식품으로 대표적인 계란의 알레르겐인 오브알부민의 구조를 변화시킨 "방사선 조사-오브알부민"을 유효성분으로 함유하는 백신이 알레르기 예방에 효과가 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 알레르기 유발물질인 알레르겐에 방사선을 조사하여 변형된 구조를 갖는 알레르기 질환 예방 및 치료 백신용의 면역원 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알레르기 질환 예방 및 치료 백신용의 면역원 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 방법으로 제조된 방사선이 조사된 오브알부민(ovalbumin)을 면역원으로 함유하는 알레르기 질환 예방 및 치료용 백신 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기의 백신 조성물을 이용한 알레르기 질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은,

1) 계란으로부터 오브알부민(ovalbumin)을 분리, 정제하는 단계; 및

2) 상기 오브알부민을 수용액 상태에서 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 알레르기 질환 예방 및 치료 백신용의 면역원 제조방법을 제공한다.

상기의 오브알부민은 사람 또는 동물에 있어서, 알레르기 반응을 유발할 수 있는 알레르겐(allergen) 특성을 갖는 단백질 또는 당단백질이다.

상기 오브알부민은 계란에서 난백과 난황을 분리한 후, 난백을 인산완충용액으로 희석한 다음, 난백 용액을 컬럼으로 분리, 정제하여 수득하는 것이 바람직하다. 상기 오브알부민은 단백질의 어떠한 정제 방법에 따라서 정제된 것이더라도 실질적으로 정제된 단백질이라면 모두 포함된다.

상기 단계 2)의 수용액은 인산완충용액인 것이 바람직하나, 이제 제한되는 것은 아니며, 생리식염수를 포함한 인체에 사용가능하고 단백질을 용해시킬 수 있는 것이라면 모두 이용가능하다.

상기 단계 2)의 방사선은 고에너지의 감마선, 엑스선 또는 전자선(베타선)인 것이 바람직하며, 식품의 방사선 조사에 사용되는 방사선원으로는 특정 종류의 방사선원인, Co-60 또는 Cs-137의 방사성핵종인 것이 더욱 바람직하며, 5백만 전자볼트(5 MeV)이하의 에너지를 가진 엑스선 발생장치, 10 MeV이하의 에너지를 가진 전자선 장치를 이용할 수 있다.

또한, 상기 방사선의 조사선량은 5 ~ 100 kGy인 것이 바람직하며, 40 kGy ~ 100 kGy인 것이 더욱 바람직하며, 100 kGy인 것이 가장 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니며, 1 kGy이상이라면 가능하다.

상기 단계 2)의 알레르기 질환은 식품 알레르기 질환인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기와 같은 방법으로 제조된 면역원을 하기 "방사선 조사-오브알부민"이라 칭하였다.

상기 방사선 조사-오브알부민은 0.5 ~ 3 ㎍/g의 용량으로 투여되는 것이 바람직하며, 1 ~ 2 ㎍/g인이 더욱 바람직하며, 1 ㎍/g인 것이 가장 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니며, 알레르기 질환 예방 및 치료에 효과를 나타내는 농도라면 모두 가능하다.

또한, 본 발명에서 사용되는 백신 조성물의 면역학적 유효 용량으로는 면역반응 도출에 적당한 용량이 사용될 수 있다. 특정 용량은 치료하고자 하는 환자의 연령, 체중 및 임상 증상과 투여방법에 의해 좌우된다. 이러한 적정용량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

또한, 상기 방사선 조사-오브알부민은 수산화 알루미늄(aluminum hydroxide) 보강제에 1 : 100 ~ 200의 질량부 비율로 흡착된 것이 바람직하며, 수산화 알루미늄 보강제에 1 : 100 ~ 150의 질량부 비율로 흡착된 것이 더욱 바람직하며, 수산화 알루미늄 보강제에 1 : 130의 질량부 비율로 흡착된 것이 가장 바람직하나 각각의 질환에 해당하는 바람직한 비율로 흡착될 수 있다.

상기 알레르기 질환은 식품 알레르기 질환인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

거의 대부분의 알레르겐(allergen)은 단백질로 구성되어 있는데, 이러한 단백질에 방사선을 조사하게 되면 단백질 내부의 이황화결합, 수소결합, 소수성 결합 또는 이온 결합에 영향을 주어 단편화(fragmentation), 또는 응집화(aggregation) 현상이 일어나 단백질의 이차 또는 삼차원적인 구조에 변화를 일으킨다.

본 발명자들은 상기와 같은 원리를 이용하여 방사선 조사에 의해 구조가 변형된 알레르겐, 즉, 상기과 같은 방법으로 제조된 오브알부민(ovalbumin)이 실험동물의 면역학적 증상에 미치는 영향을 조사하였다(도 1 참조).

먼저, 상기와 같은 제조방법으로 제조된 방사선-조사 오브알부민을 복강주사하여 예방 면역된 마우스에서 비조사된 오브알부민으로 유도된 알레르기 반응에 억제효과를 나타내는지 살펴보기 위하여, 예방 면역 후, 알레르기 반응을 유도한 마우스의 체액성 면역을 조사하였다.

그 결과, 방사선 조사-오브알부민으로 면역된 마우스에서 조사 선량에 따라 오브알부민 특이 IgGAM 및 오브알부민 특이 IgE 항체가가 감소하며, 40 kGy 이상의 선량에서 유의적으로 감소하였다(도 2 참조).

상기 오브알부민 특이 IgE는 알레르기 반응을 측정할 수 있는 척도가 되며 혈청 내 오브알부민에 대해 특이적으로 반응하는 IgE의 감소는 방사선 조사-오브알부민의 예방 면역 효과를 나타내며 또한 그 효과는 40 kGy 이상의 선량에서 유의적임을 나타내는 것이다.

또한, 오브알부민 특이 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, 및 IgA 항체 레벨은 방사선 조사-오브알부민으로 면역한 마우스의 혈청에서 조사 선량이 증가함에 따라감소하였다(도 3 참조).

이는 방사선 조사-오브알부민의 예방 면역은 알레르기 반응의 유도에도 전반적으로 오브알부민 특이 항체 생산을 유의적으로 감소시킴을 보여준다. 그러므로 본 발명의 방사선 조사-오브알부민을 유효성분으로 함유하는 백신 조성물은 오브알부민으로 유도된 알레르기에서 오브알부민 특이적인 체액성 면역반응을 효과적으로 억제할 수 있음을 보여준다.

다음으로, 본 발명자들은 방사선 조사-오브알부민을 함유하는 백신의 세포성 면역 효과를 조사하였다.

그 결과, Th1 반응과 관련된 싸이토카인인 IL-2 및 IFN-γ, Th2 반응과 관련된 싸이토카인인 IL-4 및 IL-10은 방사선 조사-오브알부민으로 면역한 마우스에서 감소되는 경향을 나타내었다(도 4 참조). 또한, 방사선 조사-오브알부민으로 면역된 마우스의 T 세포 증식능은 조사 선량에 따라 감소하였다(도 5 참조).

상기와 같은 싸이토카인 생성 및 T 세포 증식능의 감소 결과는 방사선 조사-오브알부민의 예방 면역은 오브알부민으로 유도된 알레르기에 대하여 오브알부민 특이적인 세포성 면역 반응에 억제 효과를 나타냄을 의미한다.

더 나아가, 방사선 조사-오브알부민으로 면역된 마우스에서 나타난 상기 결과들을 다시 한번 확인하기 위하여, 방사선 조사-오브알부민으로 면역된 마우스의 비장세포 및 비장세포에서 T 세포 및 B 세포를 분리하여 어떤 처리도 하지 않은 마우스에 세포를 주입한 후, 다시 알레르기 반응을 유도하여 체액성 면역 및 세포성 면역 반응성을 조사하였다.

방사선 조사-오브알부민으로 면역된 마우스의 비장 세포가 이식된 마우스에서는 상기의 결과와 같이, 체액성 및 세포성 면역원성이 모두 감소하였고(도 6 내지 9 및 표 1 참조), 이와 같은 결과는 비장세포 중 T 세포를 분리하여 이식된 마우스에서 더욱 명확한 결과를 얻을 수 있었다.

상기의 결과로 볼 때, 오브알부민(ovalbumin)을 유효성분으로 함유하는 알레르기 질환 예방 및 치료용 백신 조성물은 알레르기 반응의 유도 후에도 알레르기원성을 감소시키므로 본 발명의 조성물은 알레르기 질환, 특히 식품 알레르기 질환의 예방 및 치료에 매우 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

백신 조성물은 생리 식염수 또는 인산 완충 식염수 또는 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 같은 에탄올 폴리올을 이용하여 약학적 또는 생리학적으로 허용되는 매체(vehicle)에 의해 임의로 투여될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 식물성 오일 또는 이의 에멀션, 계면활성제, 예를 들면 헥사데실아민, 옥타데실 아미노산 에스테르, 옥타데실아민, 라이소레시틴, 디메틸-디옥타데실암모늄 브로마이드, N,N-디옥타데실-N'-N'비스(2-하이드록시에틸-프로판디아민), 메톡시헥사데실글리세롤, 및 플루로닉 폴리올; 폴리아민, 예를 들면, 피란, 덱스트란설페이트, 폴리 IC, 카보폴; 펩타이드, 예를 들면, 뮤라밀 디펩타이드, 디메틸글라이신, 터프트신; 면역 자극 복합체; 오일 에멀션; 리포폴리사카라이드, 예를 들면 MPLR(3-O-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Montana); 및 미네럴 겔 같은 부가적인 보조제를 임의로 포함할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 비경구, 동맥내, 피내, 경피(서방형 중합체의 사용 등에 의해), 근육내, 복강내, 정맥내, 피하 및 비강내 투여경로(이에 국한되지 않음)를 포함하여 다양한 경로에 의해 투여될 수 있다.

방사선 조사-오브알부민을 유효성분으로 함유하는 백신은 1 ~ 6주 간격으로 2 ~ 6회 투여하는 것이 바람직하며, 1 ~ 3주 간격으로 2 ~ 4회 투여하는 것이 더욱 바람직하며, 1주 간격으로 2회 투여하는 것이 가장 바람직하다. 상기 투여는 비경구적 또는 경피의 경로를 통해 투여된다.

이하 본 발명을 실시예, 실험예 및 제제예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제제예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 방사선이 조사된 오브알부민의 제조 방법

<1-1> 오브알부민의 준비

본 발명에서 사용된 알레르겐(allergen)은 계란의 주요 알레르겐인 오브알부 민(ovalbumin)이다.

계란에서 난백과 난황을 분리한 후, 난백을 0.01 M의 인산완충용액(pH 6.5)으로 10배 희석한 다음, 0.45 ㎛의 크기를 가진 필터를 이용하여 불용성물질을 제거하였다. 다음으로, DEAE(Diethylamino ethyl) 레진을 50 × 3 cm의 컬럼에 충진시킨 후, 0.01 M의 인산완충용액(pH 6.5)을 넣어 안정화시켰다. 난백 용액을 컬럼에 넣은 후, 상기의 완충용액으로 타물질이 용출이 되지 않을 때까지 세척하였다. 상기의 완충용액과 0.4 M의 염화나트륨(NaCl)이 포함된 완충용액으로 염농도 구배 과정을 통해 DEAE 레진에 흡착된 단백질을 용출시켰다. 용출된 물질들은 UV 분광 분석기(specrophotometer)를 이용하여 280 nm에서 흡광도를 측정하여 피크를 나타낸 물질을 전기영동으로 확인한 후, 0.01 M 인산완충용액(pH 7.4)로 투석하여, 0.01 M 인산완충용액(pH 7.4)에 오브알부민의 농도가 1 ㎎/㎖이 되도록 준비하였다.

<1-2> 오브알부민에 방사선 조사

상기 실시예 1-1에서 준비된 오브알부민을 1.5 ㎖ 용량의 튜브에 넣어 뚜껑을 닫은 후, 한국원자력연구원 정읍방사선과학연구소내 감마선 조사시설(선원 100만 Ci, Co-60)을 이용하여 실온(10 ± 0.5℃)에서 시간 당 10 kGy의 선량율로 방사선을 조사하였다. 오브알부민의 감마선 조사선량은 0, 10, 40 및 100 kGy의 총 흡수선량을 얻도록 하였으며, 흡수선량 확인은 세릭-세로스 선량계(ceric-cerous dosimeter, Bruker Instruments, Rheinstetten, Germany)를 사용하였고, 총 흡수선 량의 오차는 ± 0.1 kGy였다.

상기 감마선이 조사된 오브알부민을 하기에 "방사선 조사-오브알부민"이라고 명명하였다. 모든 실험은 3회 반복하였으며, 평균값과 표준오차를 나타내어 비조사된 오브알부민과 방사선 조사-오브알부민 시료를 이용한 모든 실험을 비교하기 위해 비조사된 오브알부민에 대한 대응표본 T 검정법(two tailed student t-test)을 실시하였다. 통계처리에서 나타난 P 값이 0.05이하일 경우 유의적으로 차이가 있다고 보았다.

<실시예 2> 방사선 조사-오브알부민을 처리한 마우스의 준비

상기 방사선 조사-오브알부민의 알레르기 반응에 대한 예방 면역 효과를 평가하기 위하여, BALB/c 웅성 6주령의 마우스(오리엔트바이오, 한국)를 구입하여 1주일간 순화기간을 거친 후, 면역을 하였다.

비조사된 오브알부민 20 ㎍과 수산화 알루미늄(aluminum hydroxide) 보강제(하기 "보강제"로 칭함) 2.6 ㎎을 혼합하여 흡착시킨 후, 복강 내 주사법으로 0주와 1주에 주사한 마우스(대조군)와 방사선 조사-오브알부민 20 ㎍과 보강제 2.6 ㎎을 혼합하여 흡착시킨 후, 복강 내 주사법으로 0주와 1주에 주사한 마우스(실험군)로 나누었다. 상기 방사선 조사-오브알부민에 조사된 감마선 조사선량은 상기 실시예 1-2에서 기재된 것과 같이, 10, 40 및 100 kGy이다.

알레르기 반응을 유도하기 위해 마지막 면역 2주 후, 3주 후 및 4주 후에 비조사된 오브알부민 20 ㎍과 보강제를 이용하여 대조군 및 실험군의 복강내로 각각 주사하였다(도 1).

하기에서 방사선 조사-오브말부민의 면역효과를 평가하기 위하여, 마지막 유도 1주일 후, 각각의 마우스군에서 혈액 및 비장조직을 취하였다. 어떠한 처리도 하지 않은 정상 마우스군(하기 "N"이라 칭함) 및 면역과정 없이 상기와 같이 알레르기 반응만 유도한 마우스군(하기 "I"라 칭함)에서도 각각 혈액 및 비장조직을 취하여 하기 실험에 이용하였다.

<실험예 1> 방사선 조사-오브알부민을 함유하는 백신의 체액성 면역 효과 평가

상기 실시예 2에서 방사선 조사-오브알부민의 예방 면역이 비조사된 오브알부민으로 유도된 알레르기 반응에 억제효과를 나타내는지 살펴보기 위하여, 예방 면역 후, 알레르기 반응을 유도한 마우스의 체액성 면역을 평가하였다. 체액성 면역 반응의 측정은 각각의 마우스 혈청 중의 오브알부민 특이 항체에 대한 반응을 효소면역분석법으로 평가하였다.

폴리스티렌(Polystyrene) 플래트-바닥(flat-bottom) 마이크로티터 플레이트(microtiter plates, Maxisorp, Nunc, Kamstrup, Denmark)에 0.2 M 중탄산염(bicarbonate buffer, pH 9.6)을 사용하여 비조사된 오브알부민(IgE; 10 ㎍/㎖ 및 IgG; 1 ㎍/㎖)을 넣어 하룻밤 동안 고정시키고, 세척 후 2% 우혈청 알부민으로 1 시간 동안 반응시켜 다른 특이적인 반응이 일어나지 않도록 하였다. 세척 후 마우스의 혈청을 비오틴으로 라벨된 IgE 항체(IgE-biotin, bioscience, USA)와는 1:20, 비오틴으로 라벨된 IgG2a 항체(IgG2a-biotin, bioscience, USA)와는 1:100, HRP(horseradish peroxidase)로 라벨된 IgGAM 항체(IgGAM-HRP, Southern biotech, USA), 비오틴으로 라벨된 IgG1 항체(IgG1-biotin, bioscience, USA), 비오틴으로 라벨된 Ig2b 항체(IgG2b-biotin, BD bioscience, USA), 비오틴으로 라벨된 IgA 항체(IgA-biotin, BD bioscience, USA) 및 HRP로 라벨된 IgM 항체(IgM-HRP, Southern biotech, USA)와는 1:1,000의 비율로 희석하여, 각각의 항체와 반응시켰다. 반응 시킨 2 시간 후, 세척하고, 항체의 라벨이 비오틴인 것과 HRP인 것에 따라 다음과 같이 반응시켰다. 비오틴이 라벨된 항체에 적합한 이차 항체는 스트랩토아비딘-HRP 접합 용액(streptoavidin-HRP conjugate, BD bioscience, USA)를 1:1,000의 비율로 넣어 1 시간 동안 반응시켰다. 상기 HRP로 라벨된 항체 및 스트랩토아비딘-HRP가 부착된 항체는 세척 후, 효소의 기질용액(TMB, soluble, Calbiochem, USA)를 사용하여 발색시킨 후, 0.5 M 황산으로 반응을 종결시켰다. 각 그룹의 오브알부민 특이 항체의 반응정도는 마이크로플레이트 리더기(microplate reader, Bio-Rad laboratories, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도(OD)를 측정하여 비교하였다.

그 결과, 방사선 조사-오브알부민으로 면역한 마우스(실험군)에 비조사된 오브알부민으로 알레르기 반응을 유도하면, 비조사된 오브알부민으로 면역한 마우스(대조군)에 비조사된 오브알부민으로 알레르기 반응을 유도한 경우보다, 조사 선량에 따라 오브알부민 특이 IgGAM 및 오브알부민 특이 IgE 항체가가 감소하였다. 또한 40 kGy 이상의 선량에서 유의적으로 감소하였다(도 2).

또한, 오브알부민 특이 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, 및 IgA 항체 레벨은 방사선 조사-오브알부민으로 면역한 마우스(실험군)의 혈청에서 감소하였으며, 실 험군 내에서는 조사 선량이 증가함에 따라 더 감소하였다(도 3).

이 결과는 방사선 조사-오브알부민의 예방 면역은 알레르기 반응의 유도에도 전반적으로 오브알부민 특이 항체 생산을 유의적으로 감소시킴을 보여준다.

<실험예 2> 방사선 조사-오브알부민을 함유하는 백신의 세포성 면역 효과 평가

<2-1> 방사선 조사-오브알부민으로 면역한 마우스의 비장세포에서 방출된 싸이토카인 분석

본 발명의 방사선 조사-오브알부민의 세포성 면역을 측정하기 위하여 상기 실시예 1-2에서 언급하였듯이 각각의 마우스군에서 비장 조직을 취하였다. 비장조직은 균질화하여 단일 세포로 만든 후, RPMI-1640 배양액(Gibco, USA)에 10% 우태아혈청, 100 U/㎖의 페니실린 및 스트렙토마이신을 첨가한 완전 배양액에 세포를 혼합한 다음, 96 웰 플레이트(Falcon, USA)에 각 웰당 1 × 10⁶ 세포를 접종하고 비조사된 오브알부민(100 ㎍/㎖)을 첨가하여 재감작시켰다. 72 시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양한 후, 상등액만 수득하여 비장세포에서 방출된 싸이토카인(cytokine)을 분석하였다. Th1 및 Th2 반응에 관련된 싸이토카인의 변화는 BD OptEIA^TM 마우스 IL-2, IL-4, IL-10 및 IFN-γ 세트 제품(BD Biosciences, USA)의 프로토콜에 따라 측정하였다.

그 결과, Th1 반응과 관련된 싸이토카인인 IL-2 및 IFN-γ, Th2 반응과 관련된 싸이토카인인 IL-4 및 IL-10은 방사선 조사-오브알부민으로 면역한 마우스(실험 군)에서 오브알부민으로 면역한 마우스(대조군)에서보다 감소된 경향을 나타내었다(도 4).

<2-2> 방사선 조사-오브알부민으로 면역한 마우스 비장세포의 증식능

상기 실험예 2-1과 같이 사이토카인의 변화를 분석한 후, 방사선 조사-오브알부민으로 면역된 마우스 비장세포의 증식능을 평가하였다. 비장세포 증식능은 MTT[3-(4,5-dimethylthiazolyl)-2,5- diphenyl - tetrazolium bromide, Sigma]에 의해 측정되었다.

MTT 용액(5 ㎎/㎖)을 72 시간 동안 배양된 비장세포에 30 ㎕/웰을 첨가하여, 5% CO₂ 배양기에서 2 시간 동안 반응 시킨 후, 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 100 ㎕의 DMSO(dimethysulfoxide, Sigma, USA)로 세포를 파괴시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 방사선 조사-오브알부민으로 면역된 마우스(실험군)의 T 세포 증식능은 조사 선량에 따라 감소하였으며, 그 증식률은 비조사된 오브알부민으로 면역된 마우스(대조군)의 T 세포와 비교할 경우, 유의적으로 감소하였다. 오브알부민 알레르기만 유도한 마우스(I)의 비장 세포에도 비조사된 오브알부민으로 면역한 효과와 유사한 T 세포 증식을 나타내었다(도 5).

이상의 실험은 방사선 조사-오브알부민으로 면역된 비장세포는 알레르기 반응을 유도하여도 비조사된 오브알부민보다 낮은 반응성을 나타내는 것을 보여준다.

<실험예 3> 방사선 조사-오브알부민으로 면역된 면역세포의 알레르기 유도 저해의 체액성 평가

상기 실시예 2와 같이 대조군은 비조사된 오브알부민으로 면역하였으나 알레르기 유발물질을 재투여하지는 않았고, 실험군은 방사선 조사-오브알부민으로 면역하였나, 역시 알레르기 유발물질을 재투여하지는 않았다. 상기 실시예 2와 같은 방법으로 정상 마우스군(N), 면역과정 없이 알레르기 반응만 유도한 마우스군(I), 대조군 및 실험군에서 각각 비장세포를 취하여, T 세포 및 B 세포로 분리하였다.

T세포는 나일론 울 컬럼을 이용하여 비장세포로부터 분리하였다.

나일론 울 컬럼은 37℃의 RPMI(Gibco, USA)로 세척하고 따뜻하게 데워진 우태아혈청이 포함된 RPMI로 충진시킨 후 비장세포를 첨가하여 37℃에서 45분 동안 반응시켰다. 이 컬럼을 따뜻한 RPMI 배양액 20 ㎖로 용리시키고 수득된 T 세포를 튜브에 모아 하기 실험에 사용하였다.

비장의 B 세포는 1× 10⁷의 비장세포를 2 시간 동안 RPMI 배지에서 부착시킨 후, 항(anti)-Thy 1.2 항체(Cedarlane, Ontario, Canada)를 넣어 배양하였다. 다음으로, 토끼의 보체(Cedarlane)와 함께 배양하여 B 세포가 아닌 세포(주로 T 세포)를 모두 가수분해시키고, 원심분리하여 B 세포를 수득하였다.

상기와 같이 하여 분리된 T 세포, B 세포 및 전체 비장세포에 각각 인산완 충용액 200 ㎕를 첨가하여 1× 10⁷ 세포로 부유시켰다. 1× 10⁷ 세포를 어떤 처리도 하지 않은 동종의 BALB/c 마우스의 꼬리 정맥 내로 이입하였다.

상기 실험예 1과 같이 하여 오브알부민 특이 항체가를 분석하였다.

그 결과, 비조사된 오브알부민으로 면역된 마우스의 비장세포를 이입한 마우스는 오브알부민 특이 IgGAM, 오브알부민 특이 IgE 및 오브알부민 특이 IgG1이 증가하였으나, 오브알부민 특이 IgG2a는 유의적인 차이가 나타나지 않아 Th2 면역반응 즉 알레르기 유도가 성공적으로 수행되었다는 것을 말해준다. 방사선 조사-오브알부민으로 면역된 마우스(실험군) 비장세포, B 세포 및 T 세포가 이입된 마우스의 오브알부민 특이 IgGAM, IgG1 및 IgE는 비조사된 오브알부민으로 면역된 마우스(대조군) 비장세포, B 세포 및 T 세포가 이입된 마우스에 비해 훨씬 낮은 값을 나타내었으며 10 kGy이상의 조사선량에서 유의적으로 낮았다(도 6 내지 도 8). 한편, 오브알부민 특이 IgG2a는 방사선 조사(10 kGy)-오브알부민으로 면역된 마우스의 T 세포에서 약간 낮아진 것을 제외하고 유의적으로 차이가 없거나, 오히려 증가하는 것으로 나타나 Th2 면역(알레르기)반응이 감소하는 결과를 보였다.

상기의 결과에서 T 세포, B 세포 및 전체 비장세포의 면역 관용의 유도측면에서 중요한 역할은 T 세포로 보인다. 이는 전체 비장세포로 이입된 마우스에서 측정된 오브알부민-특이 IgE가 T 세포로 이입된 마우스에서 측정된 오브알부민-특이 IgE와 유사한 결과를 나타내었기 때문이다.

<실험예 4> 방사선 조사-오브알부민으로 면역된 면역세포의 알레르기 유도 저해의 세포성 평가

실험예 3의 결과에서 방사선 조사-오브알부민으로 면역한 마우스의 비장면역세포 중, T 세포가 중심적인 반응을 유도하는 것으로 나타났으므로 세포성 면역 평가에서는 T 세포를 이입한 마우스의 비장세포에서의 T 세포 증식능 및 싸이토카인 생산능을 살펴보았다.

상기 실험예 3과 같이 T 세포만을 분리하여 동종의 BALB/c 마우스의 정맥 내로 이입시켰다. 다음으로, 상기 실시예 2에서와 같은 방법으로 알레르기 반응을 2 회(이입시킨 후 다음 날 및 1주일 후)에 걸쳐 유도하였다. 마지막 유도 1주일 후, 실험예 3과 같은 방법으로 비장세포를 취하여 비조사된 오브알부민과 함께 배양한 72 시간 후에 T 세포 증식능과 싸이토카인 생산 정도를 평가하였다.

그 결과, 방사선 조사-오브알부민으로 면역된 T 세포가 이입된 마우스에서 낮은 T 세포의 증식률을 나타내었다(도 9). 이 결과는 상기 실험예 2에서의 결과와 유사하였다. 이것은 방사선 조사-오브알부민으로 면역된 마우스의 비장세포에서 분리된 T 세포가 T 세포 반응의 증식반응을 제어할 수 있다는 것을 보여준다.

또한 상기 실험예 3에서 수행한 것과 동일한 방법으로 방사선 조사-오브알부민으로 면역된 마우스의 T 세포로 이입한 마우스의 T 세포에서 나온 싸이토카인은 마지막 알레르기 반응 유도 1주일 후에 측정되었으며 싸이토카인은 IL-2, IFN-r, IL-2 및 IFN-r로 평가하였다.

그 결과, Th1(IL-2 및 IFN-r) 및 Th2 관련 싸이토카인(IL-2 및 IFN-r)은 모 두 방사선-조사 오브알부민으로 면역된 공여자 마우스의 T 세포와 비교하였을 경우에 알레르기 반응 유도 후에도 낮은 생산능(표 1)을 보였으며 상기 실험예 2에서 나타난 결과와 유사한 경향을 나타내었다.

상기 실험예에서 나타난 결과에 의하면 방사선이 조사된 오브알부민을 예방적으로 면역하게 되면 알레르기 반응을 유도해도 알레르기 반응이 일어나지 않았으며, 이는 방사선 조사 선량이 증가함에 따라 강하게 나타났다.

방사선 조사-오브알부민으로 면역된 마우스의 비장세포 중 T 세포가 이입된 동종마우스의 비장세포에서 나온 싸이토카인의 함량의 비교

	N	I	0	감마선 처리
	N	I	0	10	40	100
IL-2	2.1±1.8	30.8±12.1	94.2±8.9	112.3±3.6	74.7±8.9*	67.6±7.4*
IL-4	0	95.4±5.2	179.7±11.3	168.3±3.4	96.8±7.4*	38.3±1.5*
IL-6	123.5±21.7	3303.5±71.8	3858.5±56.2	2513.5±15.9*	2318.5±12.6*	1818.5±20.6*
IFN-γ	0	188.7±12.4	275.3±24.1	402.0±10.6*	687.0±7.5*	68.7±20.4**

*: p <0.05;

**: p <0.01;

N: 어떤 처리도 하지 않은 정상 마우스군;

I: 면역과정 없이 알레르기만 유도한 대조군;

0: 비조사된 오브알부민으로 면역된 세포를 마우스에 이입한 후, 알레르기를 유도한 대조군의 비장세포;

10: 10 kGy로 조사된 오브알부민으로 면역된 세포를 마우스에 이입한 후, 알레르기를 유도한 실험군의 비장세포;

40: 40 kGy로 조사된 오브알부민으로 면역된 세포를 마우스에 이입한 후, 알레르기를 유도한 실험군의 비장세포; 및

100: 100 kGy로 조사된 오브알부민으로 면역된 세포를 마우스에 이입한 후, 알레르기를 유도한 실험군의 비장세포.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

<제제예 1> 백신의 제조

본원 발명에 의해 제조된 오브알부민(ovalbumin) 20 ㎍

수산화 알루미늄(aluminum hydroxide) 2.6 ㎎

오브말부민을 수산화 알루미늄의 총 최종량에 흡착시키고, 최종 부피를 인산완충용액(PO₄ 10 mM, NaCl 150 mM)으로 투여량 당 1 ㎖로 조절하였다. 조성물을 사용할 때까지 4℃로 저장하였다.

계란의 난백에서 분리, 정제한 오브알부민(ovalbumin)에 방사선을 조사하여 제조된 방사선 조사-오브알부민은 변형된 알레르겐(allergen)으로서, 상기 방사선 조사-오브알부민으로 면역된 마우스에서는 체액성 및 세포성 면역원성이 모두 감소되며 이는 알레르기 반응을 억제함을 의미하므로 본 발명의 조성물은 알레르기 질환의 예방 및 치료용 백신으로 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

2) 상기 오브알부민을 수용액 상태에서 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 알레르기 질환 예방 및 치료 백신용의 면역원 제조방법.

제 1항에 있어서, 오브알부민은 사람 또는 동물에 있어 알레르기 반응을 유발할 수 있는 알레르겐(allergen) 특성을 갖는 단백질 또는 당단백질인 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 방사선은 감마선, 전자선(베타선) 및 엑스선으로 이루어진 군으로부터 선택되어진 어느 하나인 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 방사선의 조사량은 5 ~ 100 kGy인 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 1항 또는 제 4항에 있어서, 상기 단계 2)의 방사선의 조사량은 40 ~ 100 kGy인 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 5항에 있어서, 상기 단계 2)의 방사선의 조사량은 100 kGy인 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 수용액은 인산완충용액인 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 알레르기 질환은 식품 알레르기 질환인 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 1항의 방법으로 제조된 방사선이 조사된 오브알부민(ovalbumin)을 면역원으로 함유하는 알레르기 질환 예방 및 치료용 백신 조성물.

제 9항에 있어서, 상기 방사선이 조사된 오브알부민은 수산화 알루미늄(aluminum hydroxide) 보강제에 1 : 100 ~ 200의 질량부 비율로 흡착된 것을 특징으로 하는 백신 조성물.

제 10항에 있어서, 상기 방사선이 조사된 오브알부민은 수산화 알루미늄 보강제에 1 : 100 ~ 150의 질량부 비율로 흡착된 것을 특징으로 하는 백신 조성물.

제 11항에 있어서, 상기 방사선이 조사된 오브알부민은 수산화 알루미늄 보강제에 1 : 130의 질량부 비율로 흡착된 것을 특징으로 하는 백신 조성물.

제 9항에 있어서, 상기 알레르기 질환은 식품 알레르기 질환인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.

제 9항의 백신 조성물을 이용한 알레르기 질환 예방 또는 치료 방법.

제 14항에 있어서, 상기 백신 조성물을 1 ~ 6주 간격으로 2 ~ 6회 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 15항에 있어서, 상기 백신 조성물을 1 ~ 3주 간격으로 2 ~ 4회 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 16항에 있어서, 상기 백신 조성물을 1주 간격으로 2회 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 15항에 있어서, 상기 투여는 비경구적 또는 경피의 경로를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.

제 15항에 있어서, 상기 백신 조성물은 방사선이 조사된 오브알부민(ovalbumin)의 함량이 0.5 ~ 3 ㎍/g(체중)으로 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.