CN113651890A - 一种抗sal单链抗体及其筛选方法和应用 - Google Patents

一种抗sal单链抗体及其筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗SAL单链抗体及其筛选方法和应用。该单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码该单链抗体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明利用抗体基因工程技术和噬菌体展示技术构建SAL免疫噬菌体单链抗体库，从中筛选出SAL的ScFv，为后期建立SAL的免疫学快速检测方法提供理论依据和物质基础。

Description

一种抗SAL单链抗体及其筛选方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种抗SAL单链抗体及其筛选方法和应用。
背景技术
沙丁胺醇(Salbutamol,SAL)，又名舒喘宁，是一种选择性肾上腺素支气管扩张剂，为白 色结晶性粉末；无臭，几乎无味，在乙醇中溶解，在水中略溶，在乙醚中不溶，其熔点为154℃-158℃，熔融时同时分解。临床和添加剂一般用其硫酸盐，为白色或类白色的粉末，无臭，味微苦，在水中易溶，能溶于甲醇，在乙醚或三氯甲烷中几乎不溶，需避光保存。SAL有松弛平滑肌等作用，在医学上常用于预防和治疗支气管哮喘以及哮喘型慢性支气管炎、肺 气肿等呼吸系统疾病。因其具有蛋白同化作用，通过刺激蛋白质的合成而引起纤维细胞内物 质增多，体积增大及蛋白质降解减缓，减少脂肪的形成，提高瘦肉和脂肪的比率，因此在畜 禽养殖过程中常被用作促生长剂使用。
目前，检测沙丁胺醇残留的方法主要集中于放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)、 胶体金免疫层析法、酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)等方法。 但目前关于沙丁胺醇抗体鲜有报道，因此开发SAL抗体对构建和完善我国药物残留检测体系 具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种抗SAL单链抗体及其筛选方法和应用，开 发得到的抗SAL单链抗体具有优异的特异性和灵敏度，能够用于SAL的免疫学检测的构建。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种抗SAL单链抗体，该单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，单链抗体的轻链可变区和重链可变区通过连接多肽连接。
进一步地，连接多肽的基因为编码3组重复Gly4Ser的核苷酸序列。
一种编码上述抗SAL单链抗体的基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种表达载体，包括上述核苷酸。
一种SAL抑制剂，包括上述抗SAL单链抗体。
一种噬菌体，该噬菌体可表达上述基因。
上述抗SAL单链抗体在SAL免疫学检测中的应用。
一种用于进行SAL免疫学检测的试剂盒，包括上述抗SAL单链抗体。
一种筛选上述抗SAL单链抗体的方法，包括以下步骤：
(1)构建SAL完全抗原；
(2)提取经SAL完全抗原免疫后的样本RNA，然后PCR扩增分别得到轻链可变区基因和重链可变区基因，再用连接片段连接；
(3)将步骤(2)所得基因克隆至载体中，然后转化至大肠杆菌内，经噬菌体拯救后获 得SAL噬菌体单链抗体库，然后通过制备得到的完全抗原筛选得到该抗SAL单链抗体。
进一步地，在构建SAL完全抗原时，首先需要通过琥珀酸酐法使SAL的羟甲基与丁二 酸酐发生醇解反应，生成琥珀酸衍生物，再用混合酸酐法和活化酯法与载体蛋白偶联，从而 构建SAL完全抗原。
进一步地，步骤(3)中所用载体为噬菌粒载体pCANTAB5E，其在单链抗体与PIII蛋白 之间存在E-tag标签蛋白序列和琥珀型止子TAG。
本发明的有益效果：
1、本发明利用抗体基因工程技术和噬菌体展示技术构建SAL鼠源免疫噬菌体单链抗体 库，从中筛选出SAL的ScFv，为后期建立SAL的免疫学快速检测方法提供理论依据和物质 基础。
2、本发明用的是15肽的(Gly4Ser)3，其中主要的原因是Gly的分子量是最小的，而且 也是侧链最短的氨基酸，可以增加侧链的柔性；而Ser则是亲水性最强的氨基酸，这样可以 增加Linker的亲水性[90]。如果Linker的长度太短(<10个氨基酸)，则很有可能对于VH和VL的相互作用起到干扰；如果太长，也会影响抗原部位的结合。
3、转化效率对抗体库库容有着重要的影响。目前，化学转化法和电穿孔转化法是常用的 两种方法。但是前者的转化效率通常较低，故常采用后一种转化法保证转化效率。因此，本 发明采用电穿孔法将重组载体转化至大肠杆菌TG1。同时，为了保证感受态的高活性，在本 发明中转化前提前制备感受态并保证制备完成后能够立即用于转化，最大程度的保证转化的 高效率。
附图说明
图1为SAL-BSA SDS-PAGE电泳鉴定图；其中，M，蛋白质分子量标准品；1，BSA载 体蛋白；2，SAL-BSA偶联产物；
图2为SAL-OVA SDS-PAGE电泳鉴定图；其中，M：蛋白质分子量标准品；1，OVA载 体蛋白；2，SAL-OVA偶联产物；
图3为SAL完全抗原紫外扫描鉴定图；其中，A：SAL-BSA偶联产物紫外扫描；B： SAL-OVA偶联产物紫外扫描；
图4为完全抗原免疫效果评价；
图5为小鼠脾脏RNA提取电泳图；
图6为小鼠抗体VH和VL基因扩增图；其中，M，DL2000 DNA marker；1，2：小鼠 VH基因扩增产物；3，4：小鼠VL基因扩增产物；
图7为小鼠ScFV基因扩增产物；其中，M，DL2000 DNA marker；1，2：小鼠ScFV基 因扩增产物；
图8为重组质粒ScFv/pCANTAB5E菌液PCR鉴定结果；
图9为噬菌体克隆的ELISA检测结果；
图10为重组质粒ScFv-3/pCANTAB5E双酶切鉴定结果；其中，M：DL 5 000DNAMarker； 1：重组质粒ScFv-3/pCANTAB5E；2：重组质粒ScFv-3/pCANTAB5E双酶切产物；
图11为SAL-ScFv-3氨基酸BLAST结果；其中，A：重链可变区比对结果；B：轻链可 变区比对结果；
图12为IMGT法划分SAL-ScFv-3序列CDR区与FR区；
图13为SAL-ScFv-3抗体结合活性Western Blotting结果；其中，M：蛋白分子质量标准； 1：SAL-BSA；2：BSA；3：SAL-OVA；4：OVA；
图14为SAL-ScFv-3抗体亲和力分析结果。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但 应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各 种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一 切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
1、试验动物
BALB/c小鼠，购自河南省试验动物中心。
2、菌株与载体
辅助噬菌体M13K07、大肠杆菌TG1、噬菌粒载体pCANTAB5E均由本实验室保存。
实施例1SAL完全抗原的制备与鉴定
SAL自身只含有羟基和羟甲基，这些基团都不可以直接和载体蛋白上的氨基偶联，所以 在和蛋白质偶联之前，要将SAL小分子改造成含有羧基的衍生物。本文利用琥珀酸酐法先将 SAL的羟甲基与丁二酸酐发生醇解反应，生成琥珀酸衍生物，再用混合酸酐法和活化酯法与 载体蛋白偶联。具体方法如下：
称取5mg SAL溶于1mL甲醇中，在搅拌过程中缓慢加入琥珀酸酐3.6mg，室温过夜搅拌，50℃真空干燥箱干燥得到SAL-HS。反应过程如下所示。
Figure BDA0003148139840000041
1、混合酸酐法制备SAL-BSA
以三乙胺作为催化剂，将SAL-HS溶于1,4-二氧六环、DMF、三乙胺混合液中(3:3:0.1)， 搅拌均匀后，冰浴30min，磁力搅拌器搅拌的过程中加入7μL氯甲酸异丁酯，冰浴搅拌2h。 称取14mg BSA溶于2mL硼酸钠溶液中(0.1mol/L，pH 8.5)放置4℃冰箱中待用，2h后 将上述溶液逐滴加入溶好的BSA溶液中，室温搅拌至第二天。反应结束后，装入透析袋于0.1mol/L，pH 7.4的PBS缓冲液中透析三天，4℃，搅拌，每6-8h换一次透析液。
2、活化酯法制备SAL-OVA
参照史晓亚等人制备完全抗原的方法，将SAL-HS溶于500μL DMF中，搅拌中加入EDC 2.8mg和NHS 1.2mg，室温下磁力搅拌反应过夜。称取10mg OVA溶于2mL硼酸钠溶液中(0.1mol/L，pH 8.5)，将上述溶液逐滴加入溶好的OVA溶液中，4℃下过夜反应。反应结束后，装入透析袋于0.1mol/L，pH 7.4的PBS缓冲液中透析三天，4℃，搅拌，每6-8h换一 次透析液。
3、SDS-PAGE蛋白电泳鉴定
(1)先配制10％的分离胶，往胶板中加入分离胶，然后加异丙醇，目的是为了封住胶 面，在室温放置1h后，查看胶的状态。
(2)待分离胶凝固后，将异丙醇倒掉，然后加配制好的5％浓缩胶，随即插入10孔梳子，在室温下放置30min后，查看胶的状态。
(3)待浓缩胶完全凝固，拔出梳子备用。将BSA载体蛋白与SAL-BSA样品浓度稀释至0.5mg/mL，将OVA载体蛋白与SAL-OVA样品浓度稀释至1mg/mL，取20μL样品与5μL 5×loading buffer缓冲液混匀，沸水浴中煮10min上样。
(4)前30min用80V电压跑，然后调节120V电压继续跑，直到溴酚蓝跑到胶的最下边。待电泳结束后，将胶取出用考马斯亮蓝G-250染色1h，脱色液过夜脱色之后，用紫外凝胶成像系统分析软件分析结果；其结果见图1和图2。
如图1和图2所示，SAL-BSA和SAL-OVA的条带明显高于BSA和OVA的条带，初步 表明SAL与BSA、OVA偶联成功。
4、紫外扫描
将PBS缓冲液、BSA载体蛋白、SAL-BSA溶液、OVA载体蛋白、SAL-OVA溶液全部 稀释至0.5mg/mL，紫外光谱扫描仪扫描每个样品的吸收波长，PBS缓冲液作为基线校准。
如图3所示，载体蛋白BSA和OVA分别在276nm和278nm处出现了最高吸收峰，小 分子SAL在225nm和277nm处各出现了最高吸收峰，SAL-BSA和SAL-OVA分别在274nm 和275nm处出现了最高吸收峰，相比于载体蛋白，由于助色团的作用，偶联物均发生了蓝移， 形成了一种新的共轭结构，导致紫外吸收光谱发生了改变。因此可以进一步判断完全抗原制 备成功。
5、三硝基苯磺酸(TNBS)法测定偶联比
(1)标准曲线的制作
把BSA载体蛋白用0.1mol/L，pH 7.4的PBS溶液配制成浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的溶液，各取500μL加入到500μL的碳酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH 9.0)中，随 后加入500μL TNBS(0.1％)溶液，放在室温下孵育15min，用酶标仪读取OD420nm的吸光 值。建立标准曲线的时候，BSA蛋白浓度作为横坐标，吸光度值作为纵坐标，曲线斜率则是 标准蛋白单位浓度的吸光值。
(2)样品测定操作步骤
把制备好的完全抗原用0.1mol/L PBS溶液稀释到浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL 的溶液，其余步骤同上，做出标准曲线，曲线斜率为单位浓度的吸光值。
(3)偶联比的计算
因为载体蛋白中的游离氨基大部分都是来源于赖氨酸的，BSA中含有赖氨酸的个数大致 是61，而OVA中含有赖氨酸的个数大致是20。所以半抗原与载体蛋白的偶联比＝人工抗原的 氨基消耗率×载体蛋白氨基个数；其结果见表1。
表1完全抗原浓度及偶联比检测结果
Figure BDA0003148139840000051
偶联物中的偶联比对于刺激机体产生高特异性抗体有一定影响，偶联率太低容易引起无 关的免疫应答；过高易诱导低特异性抗体的产生，经研究发现，偶联比一般在5:1-25:1较为 合适。如表1所示，本试验中完全抗原SAL-BSA与SAL-OVA的偶联比分别是17:1和6.4:1， 与报道结果一致。
实施例2动物免疫及免疫效果评价
1、动物免疫
将鉴定偶联成功的SAL-BSA抗原免疫BALB/c小鼠，其中抗原量是50μg/只，注射体积 为200μL/只。初次免疫的时候，先将SAL-BSA用PBS稀释后，加完全佐剂(比例为1:1) 开始乳化。完全乳化后免疫小鼠，第二次、第三次免疫时用不完全佐剂乳化SAL-BSA抗原， 每次免疫间隔15d。除第一次免疫外，每次免疫10d后，采集小鼠尾静脉血用PBS稀释后 (1:100)用于检测抗体效价。免疫程序如表2所示。
表2免疫程序
Figure BDA0003148139840000061
2、免疫小鼠效价检测
(1)包被：用OVA、SAL-OVA包被96孔酶标板，其中蛋白包被浓度为3μg/mL，100μL/孔，放于冰箱4℃过夜包被(保鲜膜封口，防止液体挥发)，重复洗板三次，3min/次。
(2)封闭：每孔加200μL 5％脱脂奶粉-PBST，放于37℃恒温箱中封闭2h，重复洗板三次，3min/次。
(3)加一抗：每只小鼠采5μL血液(尾部采血)，加入495μL PBS中进行1:100倍稀释，加到酶标板中，在此之前每孔先加50μL 5％脱脂奶粉-PBST，再加入50μL稀释好的小鼠血液，按1:200、1:400、1:800、1:1 600、1:3 200、1:6 400、1:12 800、1:25 600、1:51 200、1:102 400进行倍比稀释，37℃孵育30min，重复洗板三次，每次3min，同时做阴性对照和空白对 照。
(4)加酶标二抗：用5％脱脂奶粉-PBST溶液按照1:5 000倍稀释羊抗鼠IgG-HRP，100 μL/孔，37℃孵育30min；重复洗板三次，3min/次，洗去未与一抗结合的酶标二抗。
(5)显色：每孔中加TMB单组分显色液100μL，室温避光显色10min，然后加终止液2mol/L H2SO4溶液，70μL/孔。
(6)读数：用空白对照调零，酶标仪检测OD450nm值。设待检样品的OD450nm值为P， 阴性对照的OD450nm值为N，当P/N≥2.1时判为阳性。其结果如表3和图4所示。
表3小鼠血清效价检测
Figure BDA0003148139840000071
如图4和表3的数据可知，小鼠的抗体效价达到了1:12800，其效果良好。
实施例3SAL噬菌体单链抗体库的构建
1、小鼠脾脏RNA的提取
按照TAKARA公司的总RNA提取试剂盒的说明书，将SAL-BSA免疫效果好的小鼠取脾脏进行RNA的提取。然后立即用1.2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定(见图5)，并用分光光度计测量该RNA的浓度。
检测结果如图5所示，将SAL-BSA免疫小鼠的脾脏提取总RNA，电泳后呈明显的三条带，即28S、18S和5S rRNA，纯RNA的OD260/OD280比值通常在1.8-2.0之间，低于1.8说 明有蛋白质等污染；高于2.0表明有盐、胍、糖等杂质，用微量核酸蛋白分析仪测定OD260/OD280比值为1.997，说明提取的总RNA完整且纯度好。
2、反转录合成cDNA
RNA提取结束后立即进行反转录，按照TAKARA公司反转录试剂盒的使用说明书，按照逆转录的反应体系混合各种试剂，为了防止RNA快速降解，所以整个反应过程都要在冰上进行，反应体系见表4；反应条件为：在37℃水浴中反应15min，立即取出置于85℃中水 浴5s，然后取出放在冰上，冷却后放-20℃保存。
表4逆转录反应体系
Figure BDA0003148139840000081
3、抗体可变区VH、VL的扩增
根据小鼠免疫球蛋白的重链可变区基因和轻链可变区基因设计引物，引物序列如表5、6 所示，引物由大连宝生物公司合成。参考《重组抗体》进行PCR的引物设计。遗传密码的简 并现象在分子生物学中是很普遍的。引物设计时，从文库库容量及多样性角度考虑，引物序 列中含有多个简并碱基。具体序列设计如下：
表5抗体重链可变区引物
Figure BDA0003148139840000082
表6抗体轻链可变区引物
Figure BDA0003148139840000083
以步骤2中合成的cDNA产物为模板，扩增VH、VL基因。切下特异性的VH、VL基 因条带进行胶回收纯化。反应程序如下：95℃30s；94℃1min，56℃1min，72℃1min， 35个循环；72℃10min。反应体系如表7所示。
表7VH、VL基因PCR反应体系
Figure BDA0003148139840000084
Figure BDA0003148139840000091
4、目的基因的回收及纯化
使用电子天平对1.5mL离心管进行称量，并做好标记；把目的DNA条带切下，放入1.5 mL离心管中，并称重；按照OMEGA公司的胶回收纯化试剂盒说明书，对VH基因片段和 VL基因片段进行纯化，将洗脱的DNA，置于-20℃保存备用。
5、ScFv基因序列拼接及扩增
(1)接头基因引物设计按照Overlap-PCR的原理，Linker引物序列见表8。并依据抗体 重链上游、轻链下游设计ScFv全长基因片段的上下游引物。
表8单链抗体ScFv片段引物
Figure BDA0003148139840000092
(2)以扩增的VH、VL基因为模板，用SOE-PCR技术将Linker把VH和VL组装成单 链抗体基因，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。PCR反应条件如下(表9)： 94℃45s，56℃45s，10个循环；72℃5min，然后在上述PCR反应产物中补加含有SfiⅠ 酶切位点的VH上游引物和含有NotⅠ酶切位点的VL下游混合物的引物，接着进行PCR扩 增，反应条件如下(表10)：95℃1min；94℃30s，56℃45s，72℃45s，30个循环；72℃ 10min，4℃保存，PCR反应体系如下：
表9ScFv基因PCR反应体系(step1)
Figure BDA0003148139840000093
Figure BDA0003148139840000101
表10ScFv基因PCR反应体系(step2)
Figure BDA0003148139840000102
如图6所示，RT-PCR扩增VH和VL基因，用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定并且胶回收纯化，VH的条带大小约为350bp，VL的条带大小约为320bp，与预期结果的条带大小一致。
将VH、VL的胶回收产物和Linker片段利用SOE-PCR技术拼接成ScFv基因后，用1.5％ 琼脂糖凝胶电泳鉴定并且胶回收纯化，ScFv的条带大小约为750bp，与预期结果的条带大小 一致，结果如图7所示。
6、单链抗体库的构建及鉴定
(1)ScFv基因与pCANTAB5E载体连接
S1.使用琼脂糖凝胶电泳回收纯化ScFv基因。
S2.用NotⅠ和SfiⅠ内切酶双酶切pCANTAB5E载体，由于2种内切酶酶切时的最适温度 不同，所以酶切需要2步，先进行NotⅠ酶切，再进行SfiⅠ酶切，反应体系如表11所示。
表11ScFv基因与pCANTAB5E载体酶切体系
Figure BDA0003148139840000103
Figure BDA0003148139840000111
S3.酶切完成后，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，并将酶切产物进行胶回收。将ScFv片 段与pCANTAB5E载体用T4 DNA连接酶进行连接，其反应体系如表12。
表12ScFv基因与pCANTAB5E载体连接体系
Figure BDA0003148139840000112
操作全程在冰上操作，16℃水浴连接过夜。
(2)TG1感受态细胞的制备
S1、将-80℃保存的E.coli TG1菌液进行复苏后，划线接种于2×YT固体培养板，在37℃ 培养箱培养过夜。
S2、第二天挑取单菌落接种于3mL 2×YT液体培养基中，于37℃恒温摇床中过夜培养； 次日接种于300mL 2×YT液体培养基中扩大培养，直至OD600nm达到0.5左右，此时的大肠杆菌菌液呈雾状。
S3、将步骤S2中对数期大肠杆菌的菌液冰浴30min，然后在4℃，5 000r/min离心15min，弃掉上清。
S4、将沉淀的细胞重悬于预冷的10mL 10％甘油中，然后在4℃，4 500r/min离心20min， 弃掉上清。
S5、沉淀细胞重悬于预冷的5mL 10％甘油中，然后在4℃，4 000r/min离心25min，弃上清。
S6、沉淀细胞重悬于预冷的2mL 10％甘油中，然后在4℃，4 000r/min离心25min，弃上清。
S7、用100μL 10％甘油重悬沉淀，分装到1.5mL EP管中，置于-80℃保存备用。
(3)连接产物电转化
S1、将冻存的TG1感受态细胞在冰上融化后，加入10μL连接产物混匀之后冰浴30min。
S2、然后加到预冷的预先清洗好的电转杯中，设定最高电压为2 000V，脉冲时间为5ms。
S3、把电转杯外壁的冷凝水擦干，立即放入电转仪中进行转化。
S4、将电转后的菌液转移900μL到37℃水浴预热的SOB液体培养基中，37℃200r/min 振荡培养1h，使载体的抗性复苏，然后将菌液5 000r/min，离心3min。
S5、取出100μL菌液涂在2×YT-AG平板上，取100μL未经转化的感受态TG1做阴性对照。
S6、之后放于37℃恒温培养箱中过夜培养，第二天计数菌落，估算转化效率。
S7、将所有的连接产物按上述步骤转入TG1感受态细胞，培养过夜的平板密封后置于 4℃保存。
(4)重组质粒ScFv/pCANTAB5E转化效果鉴定
为了确定转化的菌株中是否含有外源基因，把转化后的菌液进行涂板放到37℃恒温箱 过夜培养，第二天随机挑取24个单菌落以pCANTAB5E-S1，pCANTAB5E-S6为引物进行菌液PCR鉴定(表14)，24个克隆中，有20个克隆能扩增出约750bp大小的条带，其正确的 插入率为83.3％，结果如图8所示。pCANTAB5E-S1，pCANTAB5E-S6引物序列如表13所示。
表13DNA测序引物
Figure BDA0003148139840000121
表14菌液PCR鉴定
Figure BDA0003148139840000122
PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，56℃45s，72℃45s，30个循环；72℃5min， 然后用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
再用DNAMAN分析软件对测序结果进行序列比对，抗体库的多样性为85％，再根据公 式：
Figure BDA0003148139840000131
计算得到抗体 库的库容为5.75×105cfu/mL。
(5)单链抗体初级库的菌株保存
将鉴定为阳性克隆菌的平板用2×YT-AG液体培养基洗下平板上所有转化菌落，并吹打 混匀，取一部分加50％甘油使终浓度为15％，然后放于－80℃保存。
(6)制备辅助噬菌体M13K07
S1、从TG1平板上挑2个单菌落加到3mL的2×YT液体培养基中，在37℃，200r/min下过夜培养，第二天把过夜摇的菌液加入到200mL 2×YT液体培养基中，在37℃，200r/min条件下振荡到对数期(OD600nm为0.5)。
S2、从－80℃保存的辅助噬菌体M13K07取10μL加入到上述菌液中，在37℃，200r/min 振荡1h之后，继续加入卡那青霉素(Kan)，按照1:1 000的比例，然后在37℃，200r/min条件下过夜培养。
S3、把50mL离心管提前预冷好，将过夜培养的菌液在4℃，11 000r/min条件下离心15min，然后把所有上清重新加到一个无菌的锥形瓶(提前预冷)中，用1/5体积的PEG/NaCl来沉淀噬菌体，充分混匀后，在冰上静置4h。
S4、在4℃，11 000r/min条件下离心15min，然后弃掉上清；沉淀用1mL的PBS重 悬，4℃，11 000r/min离心10min；把上清转移到2mL离心管中，用1/5体积的PEG/NaCl 来沉淀噬菌体，充分混匀后，在冰上静置1h。
S5、4℃，11 000r/min离心10min，弃掉上清，沉淀用200μL的PBS重悬后，放4℃ 保存备用。
(7)SAL噬菌体单链抗体库的构建
S1、将含有转化后阳性菌落的菌液接种于10mL2×YT-A液体培养基中，在37℃，200r/min 培养至OD600nm为0.5左右，停止培养，冰水浴10-15min增强感染效果；加入1010pfu/mL的 辅助噬菌体M13K07，其中细菌数与辅助噬菌体数的比例大约是1/20[细菌数量计算： 1A600nm＝8×108个细菌；辅助噬菌体加入量(mL)＝1A600nm的值×8×108×20×培养液毫升数÷噬 菌体滴度(1012cfu/mL)]。
S2、37℃，200r/min振荡培养1h后，在4℃，8 000r/min离心10min沉淀细菌，弃 掉上清，沉淀用10mL 2×YT-AK进行重悬，并在37℃，200r/min条件下振荡过夜。次日在 4℃，11 000r/min条件下离心15min，吸取上清用1/5体积的PEG/NaCl沉淀噬菌体(共沉 淀两次)，最后一次沉淀用500μL PBS重悬得到SAL噬菌体单链抗体库，4℃保存，用于下 一步免疫亲和筛选和富集。
实施例4SAL单链抗体的筛选及鉴定
1、SAL单链抗体库富集淘选
在实施例3构建得到的噬菌体抗体库的基础上，采用SAL-BSA和SAL-OVA交叉包被酶 标板进行筛选，对SAL噬菌体库进行四轮“吸附-洗脱-扩增”淘选富集。具体过程如下：
(1)包被：用碳酸盐缓冲液将SAL-BSA稀释到浓度为50μg/mL(第2轮选用SAL-OVA包被，包被浓度为25μg/mL；第3轮用SAL-BSA包被，包被浓度为10μg/mL；第4轮用 SAL-OVA包被，包被浓度为5μg/mL)包被酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜。
(2)封闭：第二天将洗好的酶标板加入3％BSA，200μL/孔，37℃孵育2h；用PBST 溶液洗三次，5min/次。
(3)加抗体库结合：先每孔加50μL PBS，然后每孔加50μL噬菌体单链抗体库，37℃孵育1h。用0.1％TBS洗10次，2min/次；0.1％TBST洗10次，2min/次(第2轮用0.1％TBS 洗15次，0.1％TBST洗15次；第3轮用0.5％TBS洗20次，0.5％TBST洗20次；第4轮 用0.5％TBS洗25次，0.5％TBST洗25次)。
(4)洗脱与中和：每孔加200μL洗脱液(pH 2.2)，振荡器振荡8min，立即加入中和液(pH 9.1)，10μL/孔，来中和洗脱下来的噬菌体溶液，即为第1轮的筛选洗脱液。
(5)滴度测定：取1μL洗脱液进行滴度测定。将洗脱液用2×YT液体培养基进行倍比稀释，稀释倍数分别是10-2、10-4，然后取10μL稀释液体加入到200μL对数期的TG1菌液 中，37℃静置30min，将菌液涂2×YT-AG抗性平板，在37℃恒温培养箱中培养过夜，第二 天计算平板上的菌落数。
(6)扩增：取100μL洗脱物加到5mL 2×YT-AG培养基中摇至对数期(OD600nm为0.5)，冰上放置10min，加入2×1010pfu/mL辅助噬菌体M13K07，37℃静置30min，于37℃，200 r/min恒温震荡培养1h。将培养菌液以8 000r/min离心10min，弃上清。沉淀重悬于25mL 2×YT-AK培养基中，37℃，200r/min过夜培养。
(7)PEG/NaCl沉淀：在4℃，11 000r/min条件下离心15min，用1/5体积的PEG/NaCl来沉淀噬菌体，充分混匀后，在冰上静置4h。在4℃，11 000r/min条件下离心20min，然 后弃掉上清；沉淀用1mL的PBS重悬，4℃，11 000r/min离心15min；把上清转移到2mL 离心管中，用1/5体积的PEG/NaCl来沉淀噬菌体，充分混匀后，在冰上静置1h。4℃，11 000 r/min离心20min，弃掉上清，沉淀用200μL的PBS重悬，然后高速离心除去不溶的细胞碎 片。
在4轮筛选过程中，噬菌体回收率逐渐升高，最终富集倍数达到了116倍，富集效果见 表14。
表14抗体库富集效果
Figure BDA0003148139840000151
2、淘选菌落的PCR鉴定
从第四轮富集淘选的平板上随机挑取96个单菌落进行扩大培养，分别以pCANTAB5E-S1，pCANTAB5E-S6为引物进行菌液PCR鉴定(表15)。
表15菌液PCR鉴定
Figure BDA0003148139840000152
PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，56℃45s，72℃45s，30个循环；72℃5min， 然后用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
3、噬菌体单链抗体的制备
(1)从经PCR鉴定为阳性的克隆菌液按照1:100的比例接种于5mL 2×YT-AG液体培养 基中，37℃，200r/min培养至对数期(OD600nm为0.5)。
(2)加入2×1010pfu/mL辅助噬菌体M13K07，37℃静置30min，然后在37℃，200r/min条件下培养1h。
(3)4℃，8 000r/min离心10min，弃上清，沉淀重悬于2×YT-AK培养基中，37℃，200r/min过夜培养。
(4)次日在4℃，11 000r/min条件下离心15min，取上清，用1/5体积的PEG/NaCl 来沉淀噬菌体，充分混匀后，在冰上静置4h。在4℃，11 000r/min条件下离心20min，弃 上清；沉淀用1mL的PBS重悬，4℃，11 000r/min离心15min；把上清转移到2mL离心 管中，用1/5体积的PEG/NaCl来沉淀噬菌体，充分混匀后，在冰上静置1h。4℃，11 000r/min 离心20min，弃上清，沉淀用300μL PBS重悬，然后高速离心除去不溶的细胞碎片。此悬液 即为噬菌体单链抗体，4℃保存备用。
4、Phage ELISA检测阳性噬菌体单链抗体
将菌液PCR鉴定为阳性的噬菌体进行Phage ELISA检测，辅助噬菌体M13K07作为阴性对照，当P/N≥2.1时，即为阳性克隆。结果如表16、图9所示，第3个样品为噬菌体阳性 克隆，3号噬菌体抗体相比于其他抗体有较高的抗体水平(p<0.01)，初步判定3号噬菌体抗 体可以与SAL特异性结合。具体过程如下：
(1)包被抗原：用5μg/mL SAL-BSA、SAL-OVA、BSA、OVA分别包被酶标板，每孔 50μL，4℃过夜，重复洗板三次，3min/次。
(2)封闭：每孔加5％脱脂奶粉-PBST 200μL，放于37℃恒温箱封闭2h，重复洗板三次，3min/次。
(3)待测样品：每孔加50μL噬菌体单链抗体溶液，以PBS缓冲液作为空白对照，辅助噬菌体M13K07作为阴性对照，37℃恒温箱中孵育1h后，重复洗板三次，3min/次。
(4)酶标抗-M13单抗：每孔加50μL 1：5 000倍稀释的HRP标记的anti-M13单克隆抗体溶液，于37℃恒温箱中孵育30min后，重复洗板三次，3min/次。
(5)显色：每孔加50μL TMB单组分显色液，室温避光反应10min，然后加终止液2mol/L H2SO4，每孔50μL。
(6)读取数据：酶标仪检测OD450nm值，空白对照调零。设待检样品的OD450nm值为P，阴性对照的OD450nm值为N，当P/N≥2.1时判为阳性。
(7)采用IBM SPSS Statistics 26软件进行统计分析，所获得的数据用均值±标准误差
Figure BDA0003148139840000161
表示，并用单因素方差进行显著差异性分析，p<0.05表示差异显著，p<0.01表示差 异极显著。
表16噬菌体克隆的ELISA检测结果
Figure BDA0003148139840000162
Figure BDA0003148139840000171
5、双酶切鉴定
将Phage ELISA检测为阳性的单菌落接种于5mL 2×YT-AG液体培养基中，37℃，200 r/min过夜培养。次日，将菌液提取质粒，提取步骤按照美国OMEGA公司的质粒提取试剂盒 的说明书进行；选用NotⅠ和SfiⅠ快切酶进行双酶切鉴定。酶切完成后，1.2％琼脂糖凝胶电 泳进行检测。
结果如图10所示，在NotI和SfiI快切酶的作用下，核酸琼脂糖凝胶电泳显示重组噬菌 粒载体被切割为两个片段，其中750bp大小的片段，与预期结果一致。
6、阳性噬菌体单链抗体序列分析
将阳性菌液分别以pCANTAB5E-S1，pCANTAB5E-S6为引物送去上海生工生物有限公司进行测序。测序结果利用NCBI BLAST数据库对SAL-ScFv-3基因序列进行同源性分析； 将氨基酸序列输入到Ig Blast Tool(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/igblast.cgi)数据库中， 并按照IMGT方法区分单链抗体重链、轻链的FR区和CDR区。然后利用ExPASy在线网站 分析SAL单链抗体的理化性质。
测序结果显示外源片段SAL-ScFv正确插入pCANTAB5E载体中，并且插入序列的开放 阅读框符合三联体密码子顺序，没有提前终止编码。在NCBI BLAST上进行序列比对，SAL-ScFv-3基因片段，去除酶切位点后，核苷酸序列大小为702bp(SEQ ID NO.2)，共编码234个氨基酸残基(SEQ ID NO.1)。其中VH为336bp，编码112个氨基酸；VL为321bp， 编码107个氨基酸。SAL的VH基因序列与小鼠免疫球蛋白重链可变区(GenBank： AAT06087.1)的同源性为90.18％，SAL的VL基因序列与小鼠免疫球蛋白轻链κ链(GenBank： ABC86066.1)的同源性为91.59％，结果如图11所示。
将SAL-ScFv-3氨基酸序列输入到Ig Blast Tool (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/igblast.cgi)数据库中，并按照IMGT方法区分单链抗体重链、轻链的FR区和CDR区，结果如图12所示。然后利用ExPASy在线网站分析SAL单 链抗体的理化性质，分析结果如下：SAL-ScFv-3的分子量为25.06kDa，等电点pI为8.74， 亲水性平均值(GRAVY)为-0.471，不稳定指数为50.69。具有此特点的蛋白质稳定性较差， 如果直接进行表达则难以保持活性，所以需要对其进行适当的结构改造并借助合适的载体及 优化表达条件，以期得到更稳定、活性更高的蛋白质。
7、SAL-ScFv的活性检测
(1)间接ELISA检测
采用间接ELISA测定SAL-ScFv可溶性重组抗体的效价，其结果见表17。具体过程如下：
S1、包被抗原：用10μg/mL SAL-OVA包被酶标板，每孔50μL，4℃过夜，重复洗板 三次，3min/次。
S2、封闭：每孔加5％脱脂奶粉-PBST 200μL，放于37℃恒温箱封闭2h，重复洗板三次，3min/次。
S3、待测样品：每孔加50μL可溶性重组抗体，细菌周质腔提取物从1:5开始，用E.coli HB2151空菌作阴性对照，37℃恒温箱中孵育1h后，重复洗板三次，3min/次。
S4、HRP抗E-tag抗体：每孔加50μL 1:5 000倍稀释的HRP标记的抗E-tag抗体溶液，于37℃恒温箱中孵育30min后，重复洗板三次，3min/次。
S5、显色：每孔加50μL TMB单组分显色液，室温避光反应10min，然后加终止液2mol/L H2SO4，每孔50μL。
S6、读取数据：酶标仪检测OD450nm值，空白对照调零。设待检样品的OD450nm值为P，阴性对照的OD450nm值为N，当P/N≥2.1时判为阳性。
表17可溶性SAL-ScFv-3抗体效价检测结果
Figure BDA0003148139840000181
如表17所示，细菌周质腔提取物从1:5开始稀释，当P/N≥2.1时，判断为阳性，所以该 提取物中SAL-ScFv-3的效价约为1:320。
(2)可溶性SAL-ScFv抗原结合活性鉴定
采用Western Blotting法检测可溶性SAL-ScFv-3抗体是否和SAL特异性结合，结果如图 13示，具体过程如下：
S1、SAL-BSA、BSA、SAL-OVA、OVA四种抗原在SDS-PAGE电泳结束后，做WesternBlotting鉴定。转膜时选用PVDF膜，在350mA恒流下1h。
S2、封闭：加入5％的TBST-脱脂奶封闭液在摇床上振荡孵育2h；再用TBST溶液洗去膜上多余的封闭液，重复操作3次，5min/次。
S3、加一抗：加入制备好的可溶性SAL-ScFv-3抗体，用5％的TBST-脱脂奶按1:500倍 稀释，摇床上振荡孵育1h；TBST溶液洗PVDF膜，重复操作3次，5min/次。
S4、加二抗：加入HRP标记的抗E-tag抗体，用5％的TBST-脱脂奶按照1:2 000倍稀释， 摇床上振荡孵育1h；TBST溶液洗PVDF膜，重复操作3次，5min/次。
S5、化学发光：按照ECL化学发光显色试剂盒说明书配制HRP显色底物，加到PVDF膜上并在化学发光仪上曝光显影。
如图13所示，所获得的周质腔内的SAL-ScFv-3抗体只与SAL-BSA、SAL-OVA结合，而不与BSA和OVA载体蛋白结合。
(3)可溶性SAL-ScFv-3的亲和力分析
采用间接竞争ELISA法分析周质腔提取物中SAL-ScFv-3的抗原结合活性，具体过程如 下：
S1、包被抗原：用10μg/mL SAL-OVA包被酶标板，每孔100μL，4℃过夜，重复洗板 三次，每次3min。
S2、封闭：每孔加5％脱脂奶粉-PBST 200μL，放于37℃恒温箱封闭2h，重复洗板三次， 每次3min。
S3、竞争反应：每孔加50μL稀释至合适浓度的细菌周质腔提取物，然后立即加入50μL 沙丁胺醇标准品(浓度分别为10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、160ng/mL、320ng/mL、 640ng/mL、1 280ng/mL)，未加沙丁胺醇标准品的孔记为阳性对照，37℃恒温箱中孵育1h 后，重复洗板三次，每次3min。
S4、HRP抗E-tag抗体：每孔加100μL 1:5 000倍稀释的HRP标记的抗E-tag抗体溶液， 于37℃恒温箱中孵育30min后，重复洗板三次，每次3min。
S5、显色：每孔加100μL TMB单组分显色液，室温避光反应10min，然后加终止液2mol/L H2SO4，每孔80μL。
S6、读取数据：酶标仪检测OD450nm值，空白对照调零。
S7、计算：使用origin9.0软件中的四参数拟合函数对数据进行拟合，以标准品浓度的对 数值为横坐标，以吸光值B/B0作为纵坐标绘制标准曲线，计算其半数抑制浓度IC50。
以沙丁胺醇标准品浓度的对数值为横坐标(X)，以吸光值B/B0为纵坐标(Y)，应用Origin9.0软件中的四参数拟合竞争标准曲线，建立ic-ELISA的标准曲线，如图14所示，其曲线的回归方程，相关系数R2为0.9616，IC50为294.86μg/L，最低检测限(IC10)为13.62μg/L，线性范围IC20-IC80为35.07μg/L-1085.46μg/L。
(4)可溶性SAL-ScFv-3的特异性分析
选取CLB、CIB、RAC、CIM、TBL、DH作为抑制物，评价该方法的特异性。按照步 骤(3)测定，绘制标准曲线，计算相对应的交叉反应率。公式：CR％＝IC50(标准品)/IC50 (结构类似物)×100％。
SAL-ScFv-3抗体与侧链上含有叔丁基官能团的结构类似物有较强的交叉反应，例如与 CLB、CIB小分子均有很高的交叉反应率，与其他小分子的交叉反应率均﹤0.1％，结果如表 18所示。
表18SAL-ScFv-3与结构类似物的交叉反应率
Figure BDA0003148139840000201
序列表
<110> 新乡学院
<120> 一种抗SAL单链抗体及其筛选方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile His Pro Asn Thr Phe Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
115 120 125
Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu
130 135 140
Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr
145 150 155 160
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Leu
165 170 175
Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly
180 185 190
Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Ile Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp
195 200 205
Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe
210 215 220
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
225 230
<210> 2
<211> 703
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccaggtcaag ctgcaggagt ctggggctga actggcaaaa cctggggcct cagtgaagat 60
gtcctgcaag gcttctggct acacctttac tagccactgg atgcactggg taaaacagag 120
gcctggacag ggtctggaat ggattggata cattcatcct aacacttttt atactgagta 180
caatcagaag ttcaaggaca aggccacatt gactgcagac aaatcctcca gtacagccta 240
catgcaactg agcagcctga catctgagga cactgcagtc tattactgtg caagggggcc 300
ttactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcaggt ggaggcggtt caggcggagg 360
tggctctggc ggtggcggat cggacattga gctcacccag tctccagcaa tcatgtctgc 420
atctccaggg gagaaggtca ccatgacctg cagtgccagc tcaagtgtaa gttacatgta 480
ctggtaccag cagaagccaa gatcctcccc caaaccctgg atttatctca catccaacct 540
ggcttctgga gtccctgctc gcttcagtgg cagtgggtct gggacctctt actctctcat 600
aatcagcagc atggaggctg aagatgctgc cacttattac tgccagcagt acagtggtta 660
cccgtacacg ttcggagggg ggaccaagct ggagctgaaa cgg 703

Claims (9)

1.一种抗SAL单链抗体，其特征在于，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的抗SAL单链抗体，其特征在于，所述单链抗体的轻链可变区和重链可变区通过连接多肽连接。
3.一种编码权利要求1或2所述抗SAL单链抗体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种表达载体，其特征在于，包括权利要求3所述的核苷酸。
5.一种SAL抑制剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的抗SAL单链抗体。
6.一种噬菌体，其特征在于，包括权利要求3所述的核苷酸。
7.权利要求1或2所述的抗SAL单链抗体在SAL免疫学检测中的应用。
8.一种用于进行SAL免疫学检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的抗SAL单链抗体。
9.一种筛选权利要求1或2所述抗SAL单链抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建SAL完全抗原；
(2)提取经SAL完全抗原免疫后的样本RNA，然后PCR扩增分别得到轻链可变区基因和重链可变区基因，再用连接片段连接；
(3)将步骤(2)所得基因克隆至载体中，然后转化至大肠杆菌内，经噬菌体拯救后获得SAL噬菌体单链抗体库，然后通过制备得到的完全抗原筛选得到该抗SAL单链抗体。
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