CN113637737A - 一种检测先天性心脏形态缺陷发生相关基因突变的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测先天性心脏形态缺陷发生相关基因突变的方法和试剂盒,是属于基因突变检测技术领域,本发明的方法和试剂盒使用了两套PCR引物,第一套PCR引物包括168对PCR引物,分两组,第一组包括引物84对(SEQID NO.5‑SEQ ID NO.172),第二组包括引物84对(SEQ ID NO.173‑SEQ ID NO.340),每个上游引物的5’端添加序列SEQ ID NO.1,每个下游引物的5’端添加序列SEQ ID NO.2;第二套PCR引物的上、下游引物序列是SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4,其有益效果在于:地毯式引物设计,可实现全编码区突变检测,不但能对已知突变进行分析,还能发现新的突变;对待检测样品要求量低,可对血浆和血清中的极低DNA样品进行分析;灵敏度高;检测时间短,结合高通量测序技术,可短时间内实现全编码区突变检测。
Description
技术领域
本发明属于基因突变检测技术领域,具体涉及一种检测先天性心脏形态缺陷发生相关基因突变的方法和试剂盒。
背景技术
心脏是人体胚胎发育过程中形成的第一个器官,从胚胎干细胞向心肌细胞分化的整个过程,需要骨形态发生蛋白(BMP)、WNT、NOTCH、 NODAL等多种信号通路共同参与调控,在整个心脏发育过程中呈现着复杂而精密的交互作用,这些信号通路通过调节心脏发育相关转录因子的表达水平,例如GATA家族、NKX家族、TBX家族等,进而影响心脏发育过程。从上游信号通路到下游转录因子的任意质量或数量的变化,都有可能使心脏不能正常发育,从而发生先天性心脏病(CHD)。多项基于全基因组关联性分析的研究也表明涉及BMP、WNT、NOTCH、 NODAL信号通路和GATA家族、NKX家族、TBX家族转录因子的单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism,SNP)与CHD的发生讯在相关性。针对相关SNP的研究为疾病的早期诊断提供了理论依据。 SNP由于其分布广、密度高而被认为是第三代遗传标志,已有多项涉及心脏形态发生相关基因SNP的研究为评估CHD的发病风险提供理论依据。但是由于目前与心脏形态发生相关的基因及SNP较多,单个位点的检测对CHD发病风险的评估显得十分有限。
基因PANEL是一个基因组合,在基因检测中使用基因PANEL所检测的基因比单一的位点要多,比PCR技术检测的序列要长,相对来说,在检测中不只是检测一个位点、一个基因,而是同时检测多个位点、多个基因。这些位点和基因需要按照一个标准进行选择和组合,从而构成一个检测PANEL,从而使获得的基因信息量相对要多一些。相较于单个SNP的检测,多基因的检测对于从基因层面上评估叶酸代谢水平更具有全面性。
目前,应用于心脏形态发生相关的基因突变检测谱仅限于某一单一通路或者某一转录因子家族,而忽略了其他相关基因的累加效应,对于评估CHD这种复杂遗传病的发生风险来说是有局限性的。另外,目前广泛应用的检测方法主要为限制小片段长度多态性分析法(RFLP 法)和DNA直接测序法RFLP法是将PCR与限制性酶切相结合的方法,该方法存在以下缺点:实验操作繁琐、检测周期长、成本高、存在第一轮酶切不完全导致的假阳性、非闭管操作、易于污染、难以满足临床检测要求。DNA直接测序法存在以下缺点:检测周期较长、成本高、非闭管操作、难以避免交叉污染、通量不高。另外,DNA直接测序的灵敏度较低,杂合突变、胶压缩、GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精确的数据,通常需要多次重复测序才可能避免假阳性等,因此直接测序方法也难适用于临床检测。
因此,本领域需要可用于覆盖面更广、灵敏度更高、位点靶向性更强、检测成本更低的心脏形态发生相关的基因突变的方法和试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于,针对现有基因突变检测谱仅限于某一单一通路或者某一转录因子家族,而忽略了其他相关基因的累加效应,对于评估CHD这种复杂遗传病的发生风险来说是有局限性的,从而提出一种检测先天性心脏形态缺陷发生相关基因突变的方法和试剂盒。
为了实现上述目的,本发明采用的技术方案是:
一种检测先天性心脏形态缺陷发生相关基因突变的方法和试剂盒,所述方法包括:
1)捕获:进行第一轮特异性多重PCR反应,使用168对引物对样品DNA进行扩增,所述168对PCR引物分两个试管进行反应,第一个试管引物84对SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.172,第二个试管引物84 对SEQ ID NO.173-SEQ ID NO.340,每个上游引物的5’端添加序列 SEQID NO.1,每个下游引物的5’端添加序列SEQ ID NO.2;
2)建库:进行第二轮PCR反应,使用PCR引物对:上、下游引物SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4对步骤1)获得的扩增产物进行扩增;
3)测序,对步骤2)获得的扩增产物进行测序;
4)分析,对步骤3)获得的测序结果进行分析,完成全编码区的突变检测。
2.一种心脏形态发生相关基因突变多重PCR检测试剂盒,所述试剂盒包括两套PCR引物,第一套PCR引物包括168对PCR引物,168 对PCR引物分为两组,第一组包括引物84对SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.172,第二组包括引物84对 SEQ ID NO.173-SEQ ID NO.340,第一套PCR引物的每个上游引物的5’端添加序列SEQ ID NO.1,第一套PCR引物每个下游引物的5’端添加序列SEQ ID NO.2;第二套PCR引物的上、下游引物序列分别是SEQ ID NO.3和SEQID NO.4。
所述试剂盒还包括PCR扩增预混合溶液。
所述试剂盒还包括水。
所述的试剂盒中,第一套引物的PCR反应的反应体系按如下比例配制:第一套PCR引物10份、PCR扩增预混合溶液12.5份、DNA模板3份、水4.5份。
所述的试剂盒中,第二套PCR反应的反应体系按如下比例配制: PCR引物2.5份、PCR扩增预混合溶液7.5份、第一轮PCR回收产物 5份、水4.5份。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
1)地毯式引物设计,可实现全编码区突变检测,不但能对已知突变进行分析,还能发现新的突变;对待检测样品要求量低,可对血浆和血清中的极低DNA样品进行分析;灵敏度高;检测时间短,结合高通量测序技术,可短时间内实现全编码区突变检测;成本低廉。
2)试剂盒可用于高灵敏度、高通量、低成本检测心脏形态发生相关基因突变,协助临床医生实现肿瘤病人的个体化治疗,降低治疗风险以及患者负担。
附图说明
图1为第二轮PCR C01反应毛细管电泳基因分析系统鉴定结果。
图2为第二轮PCR C02反应毛细管电泳基因分析系统鉴定结果。
图3为第二轮PCR C03反应毛细管电泳基因分析系统鉴定结果。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明,在此本发明的示意性实施例以及说明来解释本发明,但并不作为对本发明的限定。
本发明提供了一种检测心脏形态发生相关基因突变的方法,虽然在某些情况下,对这些基因的检测对于相关癌症的诊断、预防和治疗有重要的辅助意义,但这些基因的突变不是必然导致所述疾病耐药的发生,因此对这些基因的检测并不涉及疾病的诊断或治疗方法。另外,本发明的检测突变的方法还可以有许多其他用途,例如进行基因多态性分析和家族进化史研究。本发明的方法还可以用于非特定对象的样品研究,例如对混合血液制品进行检测。
实施例1
如图1-3所示,本发明所述的一种检测先天性心脏形态缺陷发生相关基因突变的方法和试剂盒,所述方法包括:
1)捕获:进行第一轮特异性多重PCR反应,使用168对引物对样品DNA进行扩增,所述168对PCR引物分两个试管进行反应,第一个试管引物84对SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.172,第二个试管引物84 对SEQ ID NO.173-SEQ ID NO.340,每个上游引物的5’端添加序列 SEQID NO.1,每个下游引物的5’端添加序列SEQ ID NO.2;
2)建库:进行第二轮PCR反应,使用PCR引物对:上、下游引物SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4对步骤1)获得的扩增产物进行扩增;
3)测序,对步骤2)获得的扩增产物进行测序;
4)分析,对步骤3)获得的测序结果进行分析,完成全编码区的突变检测。
一种心脏形态发生相关基因突变多重PCR检测试剂盒,所述试剂盒包括两套PCR引物,第一套PCR引物包括168对PCR引物,168对 PCR引物分为两组,第一组包括引物84对 SEQID NO.5-SEQ ID NO.172,第二组包括引物84对 SEQ ID NO.173-SEQ ID NO.340,第一套PCR引物的每个上游引物的5’端添加序列SEQ ID NO.1,第一套PCR引物每个下游引物的5’端添加序列SEQ ID NO.2;第二套PCR引物的上、下游引物序列分别是SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4。
所述试剂盒还包括PCR扩增预混合溶液,(即含有Taq DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液等PCR扩增必需组分(模板与引物除外)的溶液),试剂盒还包括水,试剂盒中,第一套引物的PCR反应的反应体系按如下比例配制:第一套PCR引物10份、PCR扩增预混合溶液12.5份、DNA模板3份、水4.5份,第二套PCR反应的反应体系按如下比例配制:PCR引物2.5份、PCR扩增预混合溶液7.5份、第一轮PCR回收产物5份、水4.5份。
一种心脏形态发生相关基因突变多重PCR检测试剂盒的应用方法如下:
1)提取待检测样品的DNA(例如按照常规方法)作为模板;
2)以第一套引物进行第一轮多重PCR扩增反应,第一组和第二组引物对分别在两个试管中进行;
3)将PCR扩增产物通过磁珠进行纯化回收;
4)用第一轮PCR回收的产物作为模板以第二套引物进行第二轮 PCR反应;
5)将PCR扩增产物通过磁珠进行纯化回收;
6)毛细管电泳鉴定;
7)收集产物进行上机测序(例如第二代高通量测序);
8)通过生物信息学分析鉴定心脏形态发生相关基因是否发生了突变。
其中,所述的多重PCR扩增反应条件优选如下:
第一轮PCR反应扩增体系:
名称 | 体积 |
引物 | 10ul |
DNA模板 | 3ul |
PCR扩增预混和溶液(KAPA,No:KK5801) | 12.5ul |
蒸馏水 | 4.5ul |
第一轮PCR反应扩增条件:
第一轮PCR扩增后产物纯化:
1)将PCR产物加入等体积的回收缓冲液(Tris-Hcl,称量 121.1gTris-Hcl置于1L烧杯中,加入约800mL的去离子水中,充分搅拌,加入42mL的Hcl,定容至1L。)和10ul磁珠(Beckman-B46053),震荡混匀30s;
2)将混合物放置于磁力架上30s;
3)吸出上清液,晾干30s,离开磁力架;
4)加入洗液W1(70%乙醇),震荡混匀30s;
5)将混合物放置于磁力架上30s;
6)吸出上清液,晾干30s,离开磁力架;
7)加入洗液W2(H2O),震荡混匀30s;
8)将混合物放置于磁力架上30s;
9)吸出上清液,晾干2min,离开磁力架;
10)加入20ul洗脱液(ATE,48.4gTris-Hcl溶于150mL去离子水中,加热45℃搅拌至溶解,14.61g EDTA加入上述溶液,继续搅拌。加入11.42m LAC,边搅拌边加,加完AC后变澄清,EDTA彻底溶解。测PH为8.6,加去离子水定容至200mL),震荡混匀30s;
11)将混合物放置于磁力架上30s;
12)将上清收集备用。
第二轮PCR扩增体系:
名称 | 体积 |
引物 | 1.25ul |
PCR扩增预混和溶液(KAPA,No:KK2601) | 7.5ul |
1号管第一轮PCR磁珠回收收产物 | 5ul |
第二轮PCR反应扩增条件:
第二轮PCR扩增后产物纯化步骤同上文第一轮PCR扩增后产物纯化。
实施例2
一种心脏形态发生相关基因突变本发明多重PCR试剂盒的制备和组装
1.两轮PCR引物的设计与配制
第一轮189对PCR引物,
第一轮PCR引物,分两组,第一组包括引物84对,第二组包括引物84对:每组各取1ul(单个引物浓度1uM),混匀;
第二轮PCR引物(整体引物浓度0.1uM):取1.25ul;
所有引物均经过DNA自动合成仪合成。
2.试剂盒的组装
PCR扩增预混和溶液1(KAPA,No:KK5801):12.5ul;
PCR扩增预混和溶液2(KAPA,No:KK2601):7.5ul;
第一轮PCR引物第一组:5ul,第一轮PCR引物第二组:5ul
第二轮PCR引物试管:1.25ul。
本发明多重PCR试剂盒的应用实验
1.检测样品
所检测的样品来源于某志愿者的血液。
2.检测方法
DNA提取:按照常规方法提取待检测样品的DNA作为模板。
PCR扩增:
第一轮PCR反应扩增体系同上文所述第一轮PCR反应扩增体系。
第一轮PCR反应扩增条件同上文所述第一轮PCR反应扩增条件。
第一轮PCR扩增后产物纯化步骤同上文所述第一轮PCR扩增后产物纯化。
第二轮PCR扩增体系同上文所述第二轮PCR反应扩增体系。
第二轮PCR反应扩增条件同上文所述第二轮PCR反应扩增条件。
第二轮PCR扩增后产物纯化步骤同上文所述第一轮PCR扩增后产物纯化。
测定A管260/280为1.80,对应DNA浓度9.78ng/ul。
测定B管260/280为1.81,对应DNA浓度8.34ng/ul。
毛细管电泳质检图见图1-3。
3.检测结果
将两轮PCR的结果上机测序,并进行生物信息学分析。
1)首先对测序数据进行质量评估。
2)对经过评估后的测序数据量进行统计,如下表所示。
3)参考序列比对和depth数据统计
采用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)软件将上一步生成质控后的数据(cleandata)与全基因组进行比对,BWA是一款分析准确、分析效率高的比对软件。比对完成后生成Sequence Alignment Map (SAM)文件结果。然后采用picard软件除去SAM中的重复序列(PCR 过程中产生的多余的信息),最后,我们利用samtools软件将SAM的结果文件转成BAM文件,BAM格式就是SAM格式的压缩结果,SAM文件格式说明请参见http://samtools.sourceforge.net/SAM1.pdf。
比对率:比对上人类基因组的序列-重复序列/clean data
覆盖率:实际测序结果覆盖目标区域的大小/捕获的目标区域大小
总的有效数据量:比对上人类基因组的序列-重复序列
捕获率:目标区域的有效数据量。
4)本例中发现的突变分布:
5)基因突变表:
以上基因功能主要与胚胎期心脏形态发生有关(心脏心房形态发生、心脏瓣膜形态发生、主动脉形态发生、流出道隔形态发生、中胚层形态发生、心肌细胞分化)以及参与调控的BMP信号通路和NODAL 信号通路,进而影响心脏发育,具体功能富集结果如下:
GO Biological Processes GO:0003209 cardiac atrium morphogenesis
GO Biological Processes GO:0003179 heart valve morphogenesis
GO Biological Processes GO:0035909 aorta morphogenesis
GO Biological Processes GO:0035904 aorta development
GO Biological Processes GO:0003148 outflow tract septum morphogenesis
GO Biological Processes GO:0048332 mesoderm morphogenesis
GO Biological Processes GO:0035051 cardiocyte differentiation
GO Biological Processes GO:0007507 heart development
GO Biological Processes GO:0030509 BMP signaling pathway
GO Biological Processes GO:0060395 SMAD protein signal transduction
Reactome Gene Sets R-HSA-1181150 Signaling by NODAL
GO Biological Processes GO:0038092 nodal signaling pathway
GO Biological Processes GO:0038107 nodal signaling pathway involvedin determination of left/right asymmetry
Panel包含90个位点引物(84对)信息表
虽然已经结合优选实施例对本发明进行了描述,但应当理解本发明的保护范围并不局限于这里所描述的实施例,结合这里披露的本发明的说明和实践,本发明的其他实施例对于本领域技术人员都是易于想到和理解的。说明和实施例仅被认为是示例性的,本发明的真正范围和主旨均由权利要求所限定。
Claims (6)
1.一种检测先天性心脏形态发生相关基因突变的方法,其特征在于,所述方法包括:
1)捕获:进行第一轮特异性多重PCR反应,使用168对引物对样品DNA进行扩增,所述168对PCR引物分两个试管进行反应,第一个试管引物84对SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.172,第二个试管引物84对SEQ ID NO.173-SEQ ID NO.340,每个上游引物的5’端添加序列SEQ IDNO.1,每个下游引物的5’端添加序列SEQ ID NO.2;
2)建库:进行第二轮PCR反应,使用PCR引物对:上、下游引物SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4对步骤1)获得的扩增产物进行扩增;
3)测序,对步骤2)获得的扩增产物进行测序;
4)分析,对步骤3)获得的测序结果进行分析,完成全编码区的突变检测。
2.一种心脏形态发生相关基因突变多重PCR检测试剂盒,其特征在于:所述试剂盒包括两套PCR引物,第一套PCR引物包括168对PCR引物,168对PCR引物分为两组,第一组包括引物84对SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.172,第二组包括引物84对SEQ ID NO.173-SEQ ID NO.340,第一套PCR引物的每个上游引物的5’端添加序列SEQ ID NO.1,第一套PCR引物每个下游引物的5’端添加序列SEQ ID NO.2;第二套PCR引物的上、下游引物序列分别是SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
3.根据权利要求2所述的一种检测先天性心脏形态发生相关基因突变多重PCR检测试剂盒,其特征在于:所述试剂盒还包括PCR扩增预混合溶液。
4.根据权利要求2所述的一种检测先天性心脏形态发生相关基因突变多重PCR检测试剂盒,其特征在于:所述试剂盒还包括水。
5.根据权利要求3所述的一种检测先天性心脏形态发生相关基因突变多重PCR检测试剂盒,其特征在于:所述的试剂盒中,第一套引物的PCR反应的反应体系按如下比例配制:第一套PCR引物10份、PCR扩增预混合溶液12.5份、DNA模板3份、水4.5份。
6.根据权利要求2所述的一种检测先天性心脏形态发生相关基因突变多重PCR检测试剂盒,其特征在于:所述的试剂盒中,第二套PCR反应的反应体系按如下比例配制:PCR引物2.5份、PCR扩增预混合溶液7.5份、第一轮PCR回收产物5份、水4.5份。
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