CN113633566B - 一种薯蓣皂苷元壳聚糖传递体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种薯蓣皂苷元壳聚糖传递体的制备方法，其特征在于，由以下步骤提取：先将盾叶薯蓣根茎粉碎，用酶发酵后，通过十二烷基硫酸钠、氯化镁超声提取，得超声提取液；再通过少量硫酸水解得得薯蓣皂苷元水解液，然后通过泡沫分离器分离出泡沫，通过磷酸盐缓冲盐溶液冲洗，流入到由蛋黄卵磷脂、胆固醇制备的干燥脂质膜中，形成脂质体悬液，最后超声完，微孔过滤，并经由壳聚糖包裹后，得薯蓣皂苷元壳聚糖传递体；薯蓣皂苷元得率高，酸用量少，薯蓣皂苷元壳聚糖传递体包封率高，稳定性好，对人体皮肤无刺激作用，皮肤渗透性强，抗炎能力强，对酪氨酸酶具有抑制作用，适用于化妆品中。

Description

一种薯蓣皂苷元壳聚糖传递体的制备方法
技术领域
本发明涉及植物提取领域，特别是涉及一种薯蓣皂苷元壳聚糖传递体的制备方法。
背景技术
薯蓣皂苷元，工业上称薯蓣皂素，是薯蓣皂苷的配基，在C-3位置通过苷键与糖基相连，主要以薯蓣皂苷的形式存在于薯蓣植物的根茎中，并与纤维素紧密结合于细胞壁中。薯蓣皂苷元是合成多种甾体激素和甾体避孕药的理想前体，世界各国生产的甾体激素60％以上是以它为原料生产的。同时还具有溶血、降血脂、抗肿瘤和抗菌消炎和的功效。国内外对薯蓣皂苷元的需求极大，因此开发新的提取薯蓣皂苷元的生产工艺具有重要价值和广阔的市场潜力。
目前薯蓣皂苷元的生产多以天然提取为主。从天然植物中提取的薯蓣皂苷元与化学合成的薯蓣皂苷元相比具有低毒、副作用少等优点。目前，工业上薯蓣皂苷元的制备通常酸水解法和汽油回流提取来提取薯蓣皂苷元。传统的酸水解法操作繁琐，消耗时间长，薯蓣皂苷元得率低，且由于药材体积大，酸的耗费量大，酸降解的有机质多，造成污水量大，对环境污染大，严重阻碍了薯蓣皂苷元产业的发展。利用汽油或石油醚抽提水解产物，用量较大，而且120#汽油是一级防爆溶剂，危险系数高。
脂质体是指将有效成分包封于类脂质双分子层内而形成的微型球状载体。其中水溶性成分可包裹在磷脂的内水相，脂溶性成分可包裹在磷脂双分子层间，应用在皮肤上的应用具有以下优点：长效缓释性、有效性、靶向性、营养皮肤、保健作用、保湿、抗氧化、软化皮肤、营养增补等作用。
发明内容
针对上述情况，本发明之目的在于提供一种薯蓣皂苷元壳聚糖传递体的制备方法，能够直接以盾叶薯蓣根茎为原料制备成薯蓣皂苷元壳聚糖传递体，可应用于化妆品中，加快皮肤吸收，帮助提高皮肤抗氧化能力，抗敏舒缓。
其解决的技术方案是，
一种薯蓣皂苷元壳聚糖传递体的制备方法，由以下步骤提取：
S1，将盾叶薯蓣根茎粉碎过80-100目筛，加入5-6倍体积的去离子水浸泡1-2h，用醋酸钠-醋酸缓冲液调节pH至6.5，然后加入酶在40℃下酶解45-55min，90℃酶灭活后，调节PH至中性，加入十二烷基硫酸钠水溶液、氯化镁溶液，浸泡3-4h，再经24-26KHz超声处理30-40min，然后4000-5000r/min离心15-20min，取上清液，过滤，得超声提取液；
S2，将硫酸溶液加入到超声提取液中，于105℃下搅拌水解2-3h，水解后用饱和碳酸钠溶液中和至中性，得薯蓣皂苷元水解液，然后将薯蓣皂苷元水解液置于泡沫分离器的储料桶中，通入氮气，通过环流泡沫塔气泡，向泡沫槽鼓出泡沫。
S3，将蛋黄卵磷脂、胆固醇混合溶于氯仿，然后于45℃下旋转蒸发，去除有机溶剂，得干燥脂质膜，氮气条件下保存；将泡沫槽的泡沫通过磷酸盐缓冲盐溶液冲洗，流入到到干燥脂质膜中，旋转蒸发后，形成脂质体悬液，然后于冰水浴超声10-15min，超声完成后，继续37℃旋转蒸发60min，最后用0.22um微孔滤膜过滤，得薯蓣皂苷元传递体。
S4，将壳聚糖溶液滴入薯蓣皂苷元传递体，室温下100-150rpm搅拌2-3h，得薯蓣皂苷元壳聚糖传递体。
进一步的，所述的盾叶薯蓣根茎:十二烷基硫酸钠水溶液:氯化镁溶液的质量体积比为：10-15g:5-10mL:2-3mL；所述十二烷基硫酸钠水溶液的浓度为2.58×10-2mol/L；所述的氯化镁溶液的浓度为0.2mol/L。
进一步的，所述的所述的酶添加量为盾叶薯蓣根茎的2%，所述的酶由10000U/g的中性纤维素酶和10000U/g的果胶酶以1.8:0.2的比例组成；
进一步的，所述的超声提取液:硫酸溶液的体积比为：8-10:1.6-2；所述的硫酸溶液的浓度为0.5mol/L
进一步的，所述的蛋黄卵磷脂:胆固醇:氯仿:磷酸盐缓冲盐溶液的质量体积比为：3-5g:1-2g:10-12mL:12-15mL；所述的磷酸盐缓冲盐溶液的PH为7.4。
进一步的，所述的壳聚糖溶液与薯蓣皂苷元传递体的体积比为：2-3mL:16-24mL；所述的壳聚糖溶液：取壳聚糖(分子量为150kDa)溶解于0.5%(w/v)冰醋酸溶液中，制备成浓度为0.3%的壳聚糖溶液，所制备的壳聚糖溶液PH值为6.5。
进一步的，所述的泡沫分离器包括储料桶，储料桶底部呈圆斗形，储料桶底部通过第一压力泵与环流泡沫塔的底部连通，环流泡沫塔的底部设有氮气通入导管，所述环流泡沫塔由塔体、导流筒、气体分布器和泡沫槽构成，导流筒位于塔体的内部，与塔体的内塔壁形成环隙，气体分布器位于塔体内底部和导流筒的内部的下部，气体分布器与氮气通入导管连通，所述塔体的中上部设有清液出口，所述清液出口位于导流筒与塔体的内塔壁形成的环隙的中上部；导流管的上方设有泡沫槽，塔体上部伸入泡沫槽密封连接，泡沫槽的内部上方设有喷洒器，喷洒器可水平反方向向泡沫槽的内壁喷洒，喷洒器通过第二压力泵连通容器的底部，泡沫槽的最低位置设有开口，开口与两口烧瓶密封连接，两口烧瓶的另一开口设有出气口。
进一步的，所述第一压力泵应保证通入其中的液体流速不超过10mL/s；所述气体通入速度15mL/s。
由于以上技术方案的采用，本发明与现有技术相比具有如下优点；
1．本申请巧妙地利用了表面活性剂的增溶、起泡以及参与脂质体的形成的特点，将盾叶薯蓣根茎为原料制备成薯蓣皂苷元壳聚糖传递体，并减少了酸的用量，优化了制备工艺，薯蓣皂苷元得率高；
2. 本申请所制备的薯蓣皂苷元壳聚糖传递体包封率高，稳定性好，对人体皮肤无刺激作用，抗炎能力好，对酪氨酸酶具有抑制作用，适用于化妆品中。
3.本申请所设计的泡沫分离器通过添加导流筒强化了气液固接触传质，使薯蓣皂苷元分离效率得到提高，通过在泡沫槽上添加喷洒器，能快速有效的得到的泡沫冲溶于磷酸盐缓冲盐溶液流于下一环节，缩短分离时间。
附图说明
图1为本发明一种泡沫分离器结构图。
具体实施方式
有关本发明的前述及其他技术内容、特点与功效，在以下配合参考附图1对实施例的详细说明中，将可清楚的呈现。以下实施例中所提到的结构内容，均是以说明书附图为参考。
实施例1
一种薯蓣皂苷元壳聚糖传递体的制备方法，由以下步骤提取：
S1，将盾叶薯蓣根茎10g粉碎过80目筛，加入5倍体积的去离子水浸泡1h，用醋酸钠-醋酸缓冲液调节pH至6.5，然后加入酶在40℃下酶解45min，90℃酶灭活后，调节PH至中性，加入十二烷基硫酸钠水溶液5mL、氯化镁溶液2mL，浸泡3h，再经24KHz超声处理30min，然后4000r/min离心15min，取上清液，过滤，得超声提取液；
S2，将0.2倍体积的硫酸溶液加入到超声提取液中，于105℃下搅拌水解2h，水解后用饱和碳酸钠溶液中和至中性，得薯蓣皂苷元水解液，然后将薯蓣皂苷元水解液置于泡沫分离器的储料桶中，打开第一压力泵，通入氮气，通过环流泡沫塔气泡，向泡沫槽鼓出泡沫；
S3，将蛋黄卵磷脂3g、胆固醇1g混合溶于氯仿10mL，然后于45℃下旋转蒸发，去除有机溶剂，得干燥脂质膜，氮气条件下保存；将泡沫槽的泡沫通过由泡沫槽内喷洒器喷出的磷酸盐缓冲盐溶液12mL冲洗，流入到装有干燥脂质膜的两口烧瓶中，旋转蒸发后，形成脂质体悬液，然后于冰水浴超声10min，超声完成后，继续37℃旋转蒸发60min，最后用0.22um微孔滤膜过滤，得薯蓣皂苷元传递体；
S4，将壳聚糖溶液2mL滴入薯蓣皂苷元传递体16mL，室温下100rpm搅拌2h，得薯蓣皂苷元壳聚糖传递体。测得该薯蓣皂苷元壳聚糖传递体的粒径为200.1nm，大小均匀。
所述十二烷基硫酸钠水溶液的浓度为2.58×10-2mol/L；所述的氯化镁溶液的浓度为0.2mol/L。
所述的所述的酶添加量为盾叶薯蓣根茎的2%，所述的酶由10000U/g的中性纤维素酶和10000U/g的果胶酶以1.8:0.2的比例组成。
所述的硫酸溶液的浓度为0.5mol/L。
所述的壳聚糖溶液：取壳聚糖(分子量为150kDa)溶解于0.5%(w/v)冰醋酸溶液中，制备成浓度为0.3%的壳聚糖溶液，所制备的壳聚糖溶液PH值为6.5。
如图1所示，所述的泡沫分离器包括储料桶1，储料桶1底部呈圆斗形，储料桶1底部通过第一压力泵2与环流泡沫塔的底部连通，环流泡沫塔的底部设有氮气通入导管306，所述环流泡沫塔由塔体3、导流筒302、气体分布器301和泡沫槽304构成，导流筒302位于塔体3的内部，与塔体3的内塔壁形成环隙，气体分布器301位于塔体1内底部和导流筒302的内部的下部，气体分布器301与氮气通入导管306连通，所述塔体1的中上部设有清液出口303，所述清液出口303位于导流筒302与塔体3的内塔壁形成的环隙的中上部；导流管302的上方设有泡沫槽304，塔体3上部伸入泡沫槽304密封连接，泡沫槽304的内部上方设有喷洒器305，喷洒器05可水平反方向向泡沫槽304的内壁喷洒，喷洒器305通过第二压力泵4连通容器5的底部，泡沫槽304的最低位置设有开口，开口与两口烧瓶6密封连接，两口烧瓶6的另一开口设有出气口601。
所述第一压力泵应保证通入其中的液体流速为8mL/s；所述气体通入速度为15mL/s。
实施例2
一种薯蓣皂苷元壳聚糖传递体的制备方法，由以下步骤提取：
S1，将盾叶薯蓣根茎12g粉碎过80目筛，加入5.5倍体积的去离子水浸泡1.5h，用醋酸钠-醋酸缓冲液调节pH至6.5，然后加入酶在40℃下酶解50min，90℃酶灭活后，调节PH至中性，加入十二烷基硫酸钠水溶液7mL、氯化镁溶液2.5mL，浸泡3.5h，再经25KHz超声处理35min，然后4500r/min离心18min，取上清液，过滤，得超声提取液；
S2，将0.2倍体积的硫酸溶液加入到超声提取液中，于105℃下搅拌水解2.5h，水解后用饱和碳酸钠溶液中和至中性，得薯蓣皂苷元水解液，然后将薯蓣皂苷元水解液置于泡沫分离器的储料桶中，打开第一压力泵，通入氮气，通过环流泡沫塔气泡，向泡沫槽鼓出泡沫；
S3，将蛋黄卵磷脂4g、胆固醇1.5g混合溶于氯仿11mL，然后于45℃下旋转蒸发，去除有机溶剂，得干燥脂质膜，氮气条件下保存；将泡沫槽的泡沫通过由泡沫槽内喷洒器喷出的磷酸盐缓冲盐溶液12-15mL冲洗，流入到装有干燥脂质膜的两口烧瓶中，旋转蒸发后，形成脂质体悬液，然后于冰水浴超声13min，超声完成后，继续37℃旋转蒸发60min，最后用0.22um微孔滤膜过滤，得薯蓣皂苷元传递体；
S4，将壳聚糖溶液2-3mL滴入薯蓣皂苷元传递体20mL，室温下125rpm搅拌2.5h，得薯蓣皂苷元壳聚糖传递体。测得该薯蓣皂苷元壳聚糖传递体的粒径为200.5nm，大小均匀。
所述十二烷基硫酸钠水溶液的浓度为2.58×10-2mol/L；所述的氯化镁溶液的浓度为0.2mol/L。
所述的所述的酶添加量为盾叶薯蓣根茎的2%，所述的酶由10000U/g的中性纤维素酶和10000U/g的果胶酶以1.8:0.2的比例组成。
所述的硫酸溶液的浓度为0.5mol/L。
所述的壳聚糖溶液：取壳聚糖(分子量为150kDa)溶解于0.5%(w/v)冰醋酸溶液中，制备成浓度为0.3%的壳聚糖溶液，所制备的壳聚糖溶液PH值为6.5。
所述第一压力泵应保证通入其中的液体流速不超过9mL/s；所述气体通入速度15mL/s。
实施例3
一种薯蓣皂苷元壳聚糖传递体的制备方法，由以下步骤提取：
S1，将盾叶薯蓣根茎15g粉碎过100目筛，加入6倍体积的去离子水浸泡2h，用醋酸钠-醋酸缓冲液调节pH至6.5，然后加入酶在40℃下酶解55min，90℃酶灭活后，调节PH至中性，加入十二烷基硫酸钠水溶液10mL、氯化镁溶液3mL，浸泡4h，再经26KHz超声处理40min，然后5000r/min离心20min，取上清液，过滤，得超声提取液；
S2，将0.2倍体积的硫酸溶液加入到超声提取液中，于105℃下搅拌水解3h，水解后用饱和碳酸钠溶液中和至中性，得薯蓣皂苷元水解液，然后将薯蓣皂苷元水解液置于泡沫分离器的储料桶中，打开第一压力泵，通入氮气，通过环流泡沫塔气泡，向泡沫槽鼓出泡沫；
S3，将蛋黄卵磷脂5g、胆固醇2g混合溶于氯仿12mL，然后于45℃下旋转蒸发，去除有机溶剂，得干燥脂质膜，氮气条件下保存；将泡沫槽的泡沫通过由泡沫槽内喷洒器喷出的磷酸盐缓冲盐溶液15mL冲洗，流入到装有干燥脂质膜的两口烧瓶中，旋转蒸发后，形成脂质体悬液，然后于冰水浴超声15min，超声完成后，继续37℃旋转蒸发60min，最后用0.22um微孔滤膜过滤，得薯蓣皂苷元传递体；
S4，将壳聚糖溶液3mL滴入薯蓣皂苷元传递体24mL，室温下1150rpm搅拌3h，得薯蓣皂苷元壳聚糖传递体。测得该薯蓣皂苷元壳聚糖传递体的粒径为200.7nm，大小均匀。
所述十二烷基硫酸钠水溶液的浓度为2.58×10-2mol/L；所述的氯化镁溶液的浓度为0.2mol/L。
所述的所述的酶添加量为盾叶薯蓣根茎的2%，所述的酶由10000U/g的中性纤维素酶和10000U/g的果胶酶以1.8:0.2的比例组成。
所述的硫酸溶液的浓度为0.5mol/L。
所述的壳聚糖溶液：取壳聚糖(分子量为150kDa)溶解于0.5%(w/v)冰醋酸溶液中，制备成浓度为0.3%的壳聚糖溶液，所制备的壳聚糖溶液PH值为6.5。
所述第一压力泵应保证通入其中的液体流速不超过10mL/s；所述气体通入速度15mL/s。
对比例1
将实施例2中S1步骤改为：将盾叶薯蓣根茎12g粉碎过80目筛，加入5.5倍体积的去离子水浸泡1.5h，加入十二烷基硫酸钠水溶液7mL、氯化镁溶液2.5mL，浸泡3.5h，再经25KHz超声处理35min，然后4500r/min离心18min，取上清液，过滤，得超声提取液。
其余操作不变，得薯蓣皂苷元壳聚糖传递体。
对比例2
将实施例2中S1步骤改为：将盾叶薯蓣根茎12g粉碎过80目筛，加入5.5倍体积的去离子水浸泡1.5h，用醋酸钠-醋酸缓冲液调节pH至6.5，然后加入酶在40℃下酶解50min，90℃酶灭活后，调节PH至中性，再经25KHz超声处理35min，然后4500r/min离心18min，取上清液，过滤，得超声提取液；其余操作不变，得薯蓣皂苷元壳聚糖传递体。
对比例3
将实施例2中所述步骤S4去掉，其余操作不变，得薯蓣皂苷元传递体。
试验例1
1．对照品溶液：取市购薯蓣皂苷元对照品置于10mL容量瓶中，甲醇定容，制备成薯蓣皂苷元含量为0.4mg/mL的溶液。
2．对照品溶液标准曲线的绘制：分别精密吸取薯蓣皂苷元对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.4、2.0mL至10mL容量瓶中，加甲醇摇匀，过0.45um的膜；依次取上述溶液的注入高效液相色谱仪，按色谱条件(ODS柱：250mm×4.6mm，5um；流动相：乙腈:水=45:54；流速：1.0mL/min;检测波长：紫外波长扫描最大吸收波长；柱温：30min)测定峰面积，以峰面积（uV·S）为纵坐标，以进样量为横坐标，绘制标准曲线。
3．薯蓣皂苷元包封率公式如下：薯蓣皂苷元壳聚糖传递体包封率=包入薯蓣皂苷元壳聚糖传递体中薯蓣皂苷元的含量/薯蓣皂苷元壳聚糖传递体中薯蓣皂苷元总量×100%；薯蓣皂苷元得率计算公式如下：薯蓣皂苷元的得率=薯蓣皂苷元水解液中薯蓣皂苷元的含量/盾叶薯蓣根茎粉末质量（g）×100%。
3.1．薯蓣皂苷元壳聚糖传递体中薯蓣皂苷元的总量测定：精密量取实施例2以及对比1-3中制备的薯蓣皂苷元壳聚糖传递体/薯蓣皂苷元壳传递体5mL，用甲醇破乳后定溶于10mL容量瓶中，按步骤2中所述的含量测定方法测定薯蓣皂苷元壳聚糖传递体/薯蓣皂苷元壳传递体中薯蓣皂苷元的总量。
3.2．包入薯蓣皂苷元壳聚糖传递体中薯蓣皂苷元含量测定：精确加入0.5mL实施例2以及对比1-3中制备的薯蓣皂苷元壳聚糖传递体/薯蓣皂苷元壳传递体，于1000r/min转速下离心3min，收集离心液A，然后加入0.5mL洗脱液洗脱，重复上述操作，收集离心液B，合并离心液A和B，用甲醇稀释定容于10mL容量瓶中，按步骤2中所述的含量测定方法进行测定，测定包封在薯蓣皂苷元壳聚糖传递体/薯蓣皂苷元壳传递体中薯蓣皂苷元的量。
3.3．薯蓣皂苷元的得率：精密量取实施例2以及对比1-2中制备的制备的薯蓣皂苷元水解液5mL，用甲醇破乳后定溶于10mL容量瓶中，按步骤2中所述的含量测定方法测定薯蓣皂苷元水解液中薯蓣皂苷元的总量。
结果如表1：
Figure 841741DEST_PATH_IMAGE001
3.4.稳定试验方法：将实施例2及对比例1-3制备的的薯蓣皂苷元壳聚糖传递体/薯蓣皂苷元壳传递体，在25℃和35℃下贮存，20天取样检测，观察测定样品外观形态，检测包封率及粒径分布，绘图，如表2：
Figure 158322DEST_PATH_IMAGE002
从表1可以看出，相比单独酶解超声和表面活性剂超声，酶解+表面活性剂+超声提取的薯蓣皂苷元的得率更高，达8.21%，这是由于盾叶薯蓣根茎中含有大量的纤维素并与薯蓣皂苷包合，难以充分释放，且薯蓣皂苷难以溶于水，使用纤维素酶和果胶酶可以将包和的薯蓣皂苷充分释放出来，并且被加入的表面活性剂裹携，增加溶解性，在超声条件下，充分释放于水中；
从表1和表2可以看出，表面活性剂和壳聚糖对于薯蓣皂苷元壳聚糖传递体的包封率和稳定性影响较大，阳离子型的壳聚糖与含有十二烷基磺酸钠的阴离子型薯蓣皂苷元传递体发生电荷相互吸引作用，而壳聚糖参与的酰基插入到薯蓣皂苷元壳传递体的磷脂膜中，使壳聚糖分子嵌在脂质体膜表面，提高了薯蓣皂苷元的包封率和稳定性。
试验例2
按照《化妆品安全技术规范》进行斑贴试验，斑贴试验入选受试者共30名，年龄介于18-50岁，其中女性15名，男性15名。分别用移液器吸取0.020mL实施例2以及对比1-3中制备的薯蓣皂苷元壳聚糖传递体/薯蓣皂苷元壳传递体和空白对照蒸馏水，分别滴加在滤纸片上。将加有受试物的斑试器贴敷于受试者前臂曲，用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，持续24h。结果表明，所有受试者均无不良反应，表明薯蓣皂苷元壳聚糖传递体对皮肤无刺激性。
实施例3
眼刺激性试验：按照标准SNT2329-2009化妆品眼刺激性/腐蚀性的鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)试验。分别取实施例2以及对比1-3中制备的薯蓣皂苷元壳聚糖传递体/薯蓣皂苷元壳传递体0.2mL直接滴加于CAM表面，观察CAM反应情况，并记录作用5min内每种毒性效应出现的时间。出血、凝血和血管融解分别进行评分。结果表明，薯蓣皂苷元壳聚糖传递体刺激性评分均为0.02分，证明薯蓣皂苷元壳聚糖传递体无眼刺激性。
实施例4
薯蓣皂苷元壳聚糖传递体对酪氨酸酶活性抑制试验：
吸取0.03mL的L-酪氨酸溶液和0.2mL磷酸盐缓冲液于96孔酶标板中，再分别加入实施例2以及对比1-3中制备的薯蓣皂苷元壳聚糖传递体/薯蓣皂苷元壳传递体0.02mL，对照组以0.02mL的纯水代替样品，摇匀。同时设置颜色清除组以扣除样品本身颜色的影响，冰水浴10min。样品孔和对照孔分别加入0.01mL的洋蘑菇酪氨酸酶溶液，空白孔加入0.01mL的纯水，37℃水浴20min。最后再冰水浴10min。以不加酪氨酸酶的孔为空白调零，用酶标仪在470nm处测定吸光度值。抑制试验结果如表3所示：
Figure 441535DEST_PATH_IMAGE003
由表3可知，实施例2以及对比1-3中制备的薯蓣皂苷元壳聚糖传递体/薯蓣皂苷元壳传递体具有抑制酪氨酸酶活性的效果，实施例2的抑制效果最好，酪氨酸酶是肌肤黑色素形成的首要限速酶，抑制酪氨酸酶可以减少皮肤黑色素的合成量。
实施例5
薯蓣皂苷元壳聚糖传递体对人角质细胞分泌炎症因子的影响：通过检测薯蓣皂苷元壳聚糖传递体对人角质细胞分泌炎症因子的影响评价其抗炎功效。在无菌操作台中将培养皿中生长至80-90％的角质细胞收集计数。根据计数结果，按照3.0-9.0×104cells/well接种至96孔细胞培养板中，每孔100μL，空白孔加入10μL的PBS，设三个平行，培养24h。测试样品对角质细胞的毒性，检测出安全浓度后用于测试对炎症因子的影响。
空白对照组：110μL的PBS溶液；细菌脂多糖组：110μL的PBS溶液，细菌脂多糖溶液200ug/mL添加10uL；地塞米松组：细菌脂多糖溶液200ug/mL添加10uL，100μg/mL地塞米松溶液（10mg地塞米松+100mLPBS溶液）添加100μL；样品组：细菌脂多糖溶液200ug/mL添加10uL，实施例2以及对比1-3中制备的薯蓣皂苷元壳聚糖传递体/薯蓣皂苷元壳传递体用PBS溶液稀释30倍分别添加100μL；薯蓣提取液抗炎试验结果，如表4：
Figure 998419DEST_PATH_IMAGE004
从表4中，可以看出，实施例2以及对比1-3中制备的薯蓣皂苷元壳聚糖传递体/薯蓣皂苷元壳传递体对细菌脂多糖诱导的角质细胞分泌1L-6和TNF-α炎症因子有一定的抑制作用，具有抗炎功效，更进一步的，相比于对比例3，实施例2制备的薯蓣皂苷元壳聚糖传递体对1L-1β含量（ng/L）具有一定的调节作用，这可能使由于薯蓣皂苷元壳聚糖传递体具有稳定性，能够缓慢释放薯蓣皂苷元有关。
以上所述是结合具体实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明具体实施仅局限于此；对于本发明所属及相关技术领域的技术人员来说，在基于本发明技术方案思路前提下，所作的拓展以及操作方法、数据的替换，都应当落在本发明保护范围之内。

Claims (7)

1.一种薯蓣皂苷元壳聚糖传递体的制备方法，其特征在于，由以下步骤提取：
S1，将盾叶薯蓣根茎粉碎过80-100目筛，加入5-6倍体积的去离子水浸泡1-2h，用醋酸钠-醋酸缓冲液调节pH至6.5，然后加入酶在40℃下酶解45-55min，90℃酶灭活后，调节PH至中性，加入十二烷基硫酸钠水溶液、氯化镁溶液，浸泡3-4h，再经24-26KHz超声处理30-40min，然后4000-5000r/min离心15-20min，取上清液，过滤，得超声提取液；
S2，将硫酸溶液加入到超声提取液中，于105℃下搅拌水解2-3h，水解后用饱和碳酸钠溶液中和至中性，得薯蓣皂苷元水解液，然后将薯蓣皂苷元水解液置于泡沫分离器的储料桶中，通入氮气，通过环流泡沫塔气泡，向泡沫槽鼓出泡沫；
S3，将蛋黄卵磷脂、胆固醇混合溶于氯仿中，然后于45℃下旋转蒸发，去除有机溶剂，得干燥脂质膜，氮气条件下保存；将泡沫槽的泡沫通过磷酸盐缓冲盐溶液冲洗，流入到到干燥脂质膜中，旋转蒸发后，形成脂质体悬液，然后于冰水浴超声10-15min，超声完成后，继续37℃旋转蒸发60min，最后用0.22um微孔滤膜过滤，得薯蓣皂苷元传递体；
S4，将壳聚糖溶液滴入薯蓣皂苷元传递体，室温下100-150rpm搅拌2-3h，得薯蓣皂苷元壳聚糖传递体；
所述十二烷基硫酸钠水溶液的浓度为2.58×10-2mol/L；所述的氯化镁溶液的浓度为0.2mol/L；
所述的酶添加量为盾叶薯蓣根茎的2%，所述的酶由10000U/g的中性纤维素酶和10000U/g的果胶酶以1.8:0.2的比例组成；
所述的硫酸溶液的浓度为0.5mol/L；
所述的壳聚糖溶液为取分子量为150kDa的壳聚糖溶解于0.5%w/v冰醋酸溶液中，制备成浓度为0.3%的壳聚糖溶液，所制备的壳聚糖溶液PH值为6.5。
2.根据权利要求1所述的一种薯蓣皂苷元壳聚糖传递体的制备方法，其特征在于，所述的盾叶薯蓣根茎:十二烷基硫酸钠水溶液:氯化镁溶液的质量体积比为10-15g:5-10mL:2-3mL；所述十二烷基硫酸钠水溶液的浓度为2.58×10-2mol/L；所述的氯化镁溶液的浓度为0.2mol/L。
3.根据权利要求1所述的一种薯蓣皂苷元壳聚糖传递体的制备方法，其特征在于，所述的超声提取液:硫酸溶液的体积比为8-10:1.6-2；所述的硫酸溶液的浓度为0.5mol/L。
4.根据权利要求1所述的一种薯蓣皂苷元壳聚糖传递体的制备方法，其特征在于，所述的蛋黄卵磷脂:胆固醇:氯仿:磷酸盐缓冲盐溶液的质量体积比为3-5g:1-2g:10-12mL:12-15mL；所述的磷酸盐缓冲盐溶液的PH为7.4。
5.根据权利要求1所述的一种薯蓣皂苷元壳聚糖传递体的制备方法，其特征在于，所述的壳聚糖溶液与薯蓣皂苷元传递体的体积比为2-3mL:16-24mL；所述的壳聚糖溶液为取分子量为150kDa的壳聚糖溶解于0.5%w/v冰醋酸溶液中，制备成浓度为0.3%的壳聚糖溶液，所制备的壳聚糖溶液PH值为6.5。
6.根据权利要求1所述的一种薯蓣皂苷元壳聚糖传递体的制备方法，其特征在于，所述的泡沫分离器包括储料桶，储料桶底部呈圆斗形，储料桶底部通过第一压力泵与环流泡沫塔的底部连通，环流泡沫塔的底部设有氮气通入导管，所述环流泡沫塔由塔体、导流筒、气体分布器和泡沫槽构成，导流筒位于塔体的内部，与塔体的内塔壁形成环隙，气体分布器位于塔体内底部和导流筒的内部的下部，气体分布器与氮气通入导管连通，所述塔体的中上部设有清液出口，所述清液出口位于导流筒与塔体的内塔壁形成的环隙的中上部；导流管的上方设有泡沫槽，塔体上部伸入泡沫槽密封连接，泡沫槽的内部上方设有喷洒器，喷洒器可水平反方向向泡沫槽的内壁喷洒，喷洒器通过第二压力泵连通容器的底部，泡沫槽的最低位置设有开口，开口与两口烧瓶密封连接，两口烧瓶的另一开口设有出气口。
7.根据权利要求6所述的一种薯蓣皂苷元壳聚糖传递体的制备方法，其特征在于，所述第一压力泵应保证通入其中的液体流速不超过10mL/s；所述气体通入速度15mL/s。
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