CN113621558A - 一种新鲜肝组织切片的体外培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种新鲜肝组织切片的体外培养方法。本发明提供一种新鲜肝组织切片的体外培养基，所述体外培养基按体积百分比计，包括如下组分：Williams medium E、青霉素/链霉素溶液、L‑谷氨酰胺、ITS‑X、胎牛血清。本发明所提供的新鲜肝组织切片的体外培养基、以及新鲜肝组织切片的体外培养方法，可以在体外进行肝组织切片的培养，并可以很好地在体外再现肝脏组织在体内的真实生理环境和生理状态。

Description

一种新鲜肝组织切片的体外培养方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种新鲜肝组织切片的体外培养方法。
背景技术
肝脏承担着去氧化，储存肝糖，合成白蛋白等分泌性蛋白质并制造胆汁等功能，是身体内以代谢功能为主的一个重要组织器官。肝脏具有生物转化作用，会对药物、毒物以及体内某些代谢产物通过新陈代谢的方式对其进行彻底分解并排出体外，故而又被称为“体内的清道夫”。肝代谢和肝毒性检测是肝病药物筛选中的重要指标，通常需要通过细胞和动物实验两个级别进行大量验证。
肝脏常见疾病包括脂肪肝、肝硬化、乙肝等，发病率高，预后较差，常伴随各种并发症。由于城市化和生活方式的改变导致肥胖的增加，脂肪肝的患病率也在迅速增加。另外我国还有大约1亿的乙肝患者会逐渐进展为肝硬化甚至肝癌、但是目前还没有有效的治疗慢性肝脏疾病的方法。
目前，肝病及药物筛选的研究模型主要分为体内研究模型和体外研究模型两种。其中，体外研究模型为传统的平面2D培养。2D细胞培养缺乏在完整肝脏中存在的细胞间或细胞与胞外基质间的相互作用，并且在塑料上直接培养时会产生超生理水平的机械应激。体内模型为啮齿动物模型，而啮齿动物模型并不能准确地代表人类疾病，因为它们缺乏人类临床病理的一些重要特征，并且啮齿动物模型成本高，耗费时间长。因此一种能模拟肝癌的体外模型亟待开发。
新鲜组织肝切片技术是一种将组织切片器官培养系统相结合的新技术。它在亚器官的水平上研究化合物代谢、肝细胞生理结构、药物的药理毒理等，并能通过进一步诱导建立各种疾病模型，用于药物筛查和毒理病例监测。使用新鲜组织切片既可以避免其它器官或组织对肝脏代谢的影响，维持细胞间及细胞与基质间的联系，又保持了游离肝细胞的功能特点，是一种简单，经济的体外实验方法。所以利用新鲜肝组织切片为模型进行药物筛选，更能准确地反映人类疾病的情况。因此新鲜肝组织切片体外培养技术为研究肝癌发生发展机制、药物肝毒性检测和抗肝癌药物筛选提供了新的方向。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种新鲜肝组织切片的体外培养方法，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种新鲜肝组织切片的体外培养基，所述体外培养基按体积百分比计，包括如下组分：
Figure BDA0003251653860000021
所述青霉素/链霉素溶液中青霉素/链霉素的浓度为8000～12000U/ml；
所述新鲜肝组织切片的体外培养基中还包括地塞米松和丙酮酸钠，所述新鲜肝组织切片的体外培养基中，地塞米松的浓度为50～200nM，丙酮酸钠的浓度为0.8～1.2mM。
本发明另一方面提供一种新鲜肝组织切片的体外培养方法，包括：在适合肝细胞培养的条件下，将新鲜肝组织切片置于上述的体外培养基中进行培养。
在本发明一些实施方式中，在37℃±0.5℃、5％±0.2％CO2的条件下进行培养，培养时间为1～8天。
在本发明一些实施方式中，新鲜肝组织切片的厚度为100～400μm。
在本发明一些实施方式中，所述新鲜肝组织切片为经受清洗处理后的新鲜肝组织切片，清洗处理中所使用的清洗缓冲液包括胎牛血清、青霉素/链霉素溶液、Hanks缓冲液，所述青霉素/链霉素溶液中青霉素/链霉素的浓度为8000～12000U/ml。
在本发明一些实施方式中，按体积百分比计，所述清洗缓冲液包括如下组分：
Hanks缓冲液 82～99％；
青霉素/链霉素溶液 0.5～3％；
胎牛血清 0.5～15％。
在本发明一些实施方式中，还包括：在切割缓冲液存在的条件下切割新鲜肝组织，以提供新鲜肝组织切片，所述切割缓冲液包括胎牛血清、青霉素/链霉素溶液、DMEM/F12基础培养基，所述青霉素/链霉素溶液中青霉素/链霉素的浓度为8000～12000U/ml。
在本发明一些实施方式中，按体积百分比计，所述切割缓冲液包括如下组分：
DMEM/F12 85～99％；
青霉素/链霉素溶液 0.5～3％；
胎牛血清 0.5～15％。
在本发明一些实施方式中，切割新鲜肝组织的过程中，通过粘合剂对新鲜肝组织进行固定，所述粘合剂选自琼脂糖。
本发明另一方面提供一种肝组织切片样本，由上述的新鲜肝组织切片的体外培养基、或上述的新鲜肝组织切片的体外培养方法制备获得。
附图说明
图1显示为本发明实施例1中HE染色和免疫组化检测结果示意图。
图2显示为本发明实施例1中白蛋白含量检测结果示意图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容容易地了解本申请发明的其他优点及功效。
本发明发明人经过大量实践研究，意外发现一种能够充分保留新鲜肝组织切片完整性的体外培养基，将该培养基进一步配合特定的前处理步骤以后，可以很好地保留原新鲜肝组织的组织形态、特异性标记物、生理功能等，具有良好的产业化前景。
本发明第一方面提供一种新鲜肝组织切片的体外培养基，所述体外培养基按体积百分比计，包括如下组分：
Figure BDA0003251653860000031
所述青霉素/链霉素溶液中青霉素/链霉素的浓度为8000～12000U/ml；
所述新鲜肝组织切片的体外培养基中还包括地塞米松和丙酮酸钠，所述新鲜肝组织切片的体外培养基中，地塞米松的浓度为50～200nM，丙酮酸钠的浓度为0.8～1.2mM。
本发明所提供的体外培养基中，按体积百分比计，可以包括77～78％、78～79％、79～80％、80～81％、81～82％、82～83％、83～84％、84～85％、85～86％、86～87％、87～88％、88～89％、89～90％、90～91％、91～92％、92～93％、93～94％、94～95％、95～96％、96～97％、或97～97.5％的Williams medium E，该培养基的主要成分包括无机盐、氨基酸、葡萄糖等。该培养基可以通过公开的商业渠道获得。
本发明所提供的体外培养基中，按体积百分比计，可以包括0.5～3％、0.5～0.6％、0.6～0.8％、0.8％～1％、1～1.2％、1.2～1.4％、1.4～1.6％、1.6～1.8％、1.8～2％、2～2.2％、2.2～2.4％、2.4～2.6％、2.6～2.8％、或2.8～3％的青霉素(Penicillin，CAS登录号：61-33-6)/链霉素(streptomycin，CAS登录号：57-92-1)双抗溶液，该组分在体外培养基中主要起到抗菌的作用。体外培养基中，青霉素/链霉素溶液中青霉素/链霉素的浓度可以为8000～12000U/ml、8000～8500U/ml、8500～9000U/ml、9000～9500U/ml、9500～10000U/ml、10000～10500U/ml、10500～11000U/ml、11000～11500U/ml、或11500～12000U/ml。
本发明所提供的体外培养基中，按体积百分比计，可以包括0.5～3％、0.5～0.6％、0.6～0.8％、0.8％～1％、1～1.2％、1.2～1.4％、1.4～1.6％、1.6～1.8％、1.8～2％、2～2.2％、2.2～2.4％、2.4～2.6％、2.6～2.8％、或2.8～3％的L-谷氨酰胺(L-glutamine，CAS登录号：56-85-9)，该组分是细胞代谢必要的成份在体外培养基中帮助细胞分裂和生长。
本发明所提供的体外培养基中，按体积百分比计，可以包括0.5～2％、0.5～0.6％、0.6～0.7％、0.7～0.8％、0.8～0.9％、0.9～1％、1～1.1％、1.1～1.2％、1.2～1.3％、1.3～1.4％、1.4～1.5％、1.5～1.6％、1.6～1.7％、1.7～1.8％、1.8～1.9％、或1.9～2％的ITS-X(insulin transferrin-selenium X)，该组分在体外培养基中主要起到促进细胞生长增殖的作用。
本发明所提供的体外培养基中，可以包括1～15％、1～2％、2～3％、3～4％、4～5％、5～6％、6～7％、7～8％、8～9％、9～10％、10～11％、11～12％、12～13％、13～14％、或14～15％的胎牛血清(FBS)。胎牛血清通常是一种性状、外观浅黄色澄清、无溶血、无异物稍粘稠液体，其通常可以取自剖腹产的胎牛，新牛血清通常取自出生24小时之内的新生牛，小牛血清取自出生10～30天的小牛，通常需要符合《中华人民共和国药典》第三部附录的相关要求。该组分在体外培养基中主要起到为细胞生长提供细胞因子、蛋白等各种营养物质。
本发明所提供的体外培养基中，还可以包括50～200nM、50～60nM、60～70nM、70～80nM、80～90nM、90～100nM、100～110nM、110～120nM、120～130nM、130～140nM、140～150nM、150～160nM、160～170nM、170～180nM、180～190nM、或190～200nM地塞米松(Dexamethasome，CAS登录号：50-02-2)，该组分在体外培养基中主要起到促进肝细胞聚集的作用。
本发明所提供的体外培养基中，还可以包括0.8～1.2mM、0.8～0.85mM、0.85～0.9mM、0.9～0.95mM、0.95～1.0mM、1.0～1.05mM、1.05～1.1mM、1.1～1.15mM、或1.15～1.2mM丙酮酸钠(Sodium pyruvate，CAS登录号：113-24-6)，该组分在体外培养基中主要为细胞生长提供所需的能量。
本发明第二方面提供一种新鲜肝组织切片的体外培养方法，包括：在适合肝细胞培养的条件下，将新鲜肝组织切片置于本发明第一方面所提供的体外培养基中进行培养。合适的肝细胞培养的条件对于本领域技术人员来说应该是可以被适当选择和调整的，例如，可以是在37℃±0.5℃、5％CO2±0.2％的条件下进行培养，培养时间可以为1～8天、1～2天、2～3天、3～4天、4～5天、5～6天、6～7天、或7～8天。
本发明所提供的新鲜肝组织切片的体外培养方法中，新鲜肝组织切片的厚度可以为100～400μm、100～120μm、120～140μm、140～160μm、160～180μm、180～200μm、200～220μm、220～240μm、240～260μm、260～280μm、280～300μm、300～320μm、320～340μm、340～360μm、360～380μm、或380～400μm。新鲜肝组织切片的厚度的变化通常对培养获得的肝组织切片样本有一定的影响。例如，过薄或者过厚的切片都会改变肝细胞对培养基中营养物质的吸收及代谢，从而影响细胞的生存率。
本发明所提供的新鲜肝组织切片的体外培养方法中，所述新鲜肝组织切片为经受清洗处理后的新鲜肝组织切片，清洗处理中所使用的清洗缓冲液通常可以包括Hanks缓冲液，Hanks缓冲液中还可以进一步包括FBS、青霉素、链霉素、胎牛血清等。在制备新鲜肝组织切片的过程中，通常需要用合适的清洗缓冲液对新鲜肝组织切片进行清洗，清洗缓冲液的具体选择对最终培养获得的肝组织切片样本有较大影响。例如，直接用其他种类的缓冲液(例如，PBS缓冲液等)清洗会造成肝细胞状态变差，从而影响后续生存率。再例如，按体积百分比计，所述清洗缓冲液可以包括如下组分：
Hanks缓冲液 82～99％；
青霉素/链霉素溶液 0.5～3％；
胎牛血清 0.5～15％。
上述清洗缓冲液中，按体积百分比计，可以包括82～99％、82～83％、83～84％、84～85％、85～86％、86～87％、87～88％、88～89％、89～90％、90～91％、91～92％、92～93％、93～94％、94～95％、95～96％、96～97％、97～98％、或98～99％的Hanks缓冲液，该缓冲液的主要成分包括NaCl等无机盐以及葡萄糖等。该缓冲液可以通过公开的商业渠道获得。
上述清洗缓冲液中，按体积百分比计，可以包括0.5～3％、0.5～0.6％、0.6～0.8％、0.8％～1％、1～1.2％、1.2～1.4％、1.4～1.6％、1.6～1.8％、1.8～2％、2～2.2％、2.2～2.4％、2.4～2.6％、2.6～2.8％、或2.8～3％的青霉素/链霉素双抗溶液，该组分在清洗缓冲液中主要起到杀菌的作用。清洗缓冲液中，青霉素/链霉素溶液中青霉素/链霉素的浓度为8000～12000U/ml、8000～8500U/ml、8500～9000U/ml、9000～9500U/ml、9500～10000U/ml、10000～10500U/ml、10500～11000U/ml、11000～11500U/ml、或11500～12000U/ml。
上述清洗缓冲液中，按体积百分比计，可以包括0.5～15％、0.5～1％、1～2％、2～3％、3～4％、4～5％、5～6％、6～7％、7～8％、8～9％、9～10％、10～11％、11～12％、12～13％、13～14％、或14～15％的胎牛血清，该组分在清洗缓冲液中主要为细胞生长提供细胞因子、蛋白等各种营养物质。
本发明所提供的新鲜肝组织切片的体外培养方法中，还包括：在切割缓冲液存在的条件下切割新鲜肝组织，以提供新鲜肝组织切片，所述切割缓冲液可以包括FBS、青霉素、链霉素、DMEM/F12培养基等。在制备新鲜肝组织切片的过程中，通常需要用合适的切割缓冲液对新鲜肝组织进行切割。切割缓冲液的具体选择对最终培养获得的肝组织切片样本有较大影响，例如，按体积百分比计，所述切割缓冲液包括如下组分：
DMEM/F12 85～99％；
青霉素/链霉素溶液 0.5～3％；
胎牛血清 0.5～15％。
上述切割缓冲液中，按体积百分比计，可以包括85～99％、85～86％、86～87％、87～88％、88～89％、89～90％、90～91％、91～92％、92～93％、93～94％、94～95％、95～96％、96～97％、97～98％、或98～99％的DMEM/F12缓冲液，该缓冲液的主要成分包括NaCl等无机盐、多种氨基酸以及葡萄糖等。该缓冲液可以通过公开的商业渠道获得。
上述切割缓冲液中，按体积百分比计，可以包括0.5～3％、0.5～0.6％、0.6～0.8％、0.8％～1％、1～1.2％、1.2～1.4％、1.4～1.6％、1.6～1.8％、1.8～2％、2～2.2％、2.2～2.4％、2.4～2.6％、2.6～2.8％、或2.8～3％的青霉素/链霉素双抗溶液，该组分在清洗缓冲液中主要起到杀菌的作用。切割缓冲液中，青霉素/链霉素溶液中青霉素/链霉素的浓度为8000～12000U/ml、8000～8500U/ml、8500～9000U/ml、9000～9500U/ml、9500～10000U/ml、10000～10500U/ml、10500～11000U/ml、11000～11500U/ml、或11500～12000U/ml。
上述切割缓冲液中，按体积百分比计，可以包括0.5～15％、0.5～1％、1～2％、2～3％、3～4％、4～5％、5～6％、6～7％、7～8％、8～9％、9～10％、10～11％、11～12％、12～13％、13～14％、或14～15％的胎牛血清，该组分在清洗缓冲液中主要起到为细胞生长提供细胞因子、蛋白等各种营养物质。
本发明所提供的新鲜肝组织切片的体外培养方法中，切割新鲜肝组织的过程中，通常需要通过粘合剂对新鲜肝组织进行固定。合适的粘合剂对于本领域技术人员来说应该是可以被适当选择和调整的，例如，所述粘合剂可以选自琼脂糖，其使用时通常可以是水溶液的形式。
本发明第三方面提供一种肝组织切片样本，由本发明第一方面所提供的新鲜肝组织切片的体外培养基、或本发明第二方面所提供的新鲜肝组织切片的体外培养方法制备获得。通过相关实验可以证实，通过上述新鲜肝组织切片的体外培养基和新鲜肝组织切片的体外培养方法制备获得的肝组织切片样本，能够将新鲜肝组织进行完整的切片、并保留组织的完整性，HE染色标明切片并培养的肝脏组织能够很好地保存原有的的组织形态，通过IHC则可以证明培养6天的肝组织仍然能完整的表达各种肝组织特异性标记物，Elisa检测则证明了培养后的肝细胞能够和正常肝细胞一样分泌白蛋白，具有相同的肝脏生理功能。
本发明所提供的新鲜肝组织切片的体外培养基、以及新鲜肝组织切片的体外培养方法，可以在体外进行肝组织切片的培养，并可以很好地在体外再现肝脏组织在体内的真实生理环境和生理状态。组织切片中包括了肝实质细胞，肝胆管细胞、内皮细胞、基质细胞以及微循环系统。所有的细胞和组织结构交错叠加排列，相互依托，构成完整的等同于体内的组织结构和3D生存环境。它避免了普通体外2D细胞培养时由于细胞组织排列、微环境与体内真实环境差异，以及塑料上培养产生的机械应激带来的影响。另外肝组织切片培养只需要少量肝组织培养即可，无需另外建模，相对于动物实验在无论是经济还是时间都有明显优势，具有良好的产业化前景。
下面通过实施例对本申请予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987andperiodic updates；the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE ANDFUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman andA.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
本申请实施例中所涉及的肝细胞鉴定方法具体如下：
(一)组织形态学鉴定(HE染色)
(1)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ-10min，二甲苯Ⅱ-10min，无水乙醇Ⅰ-5min，无水乙醇Ⅱ-5min，95％酒精-5min，90％酒精-5min，80％酒精-5min，70％酒精5min，蒸馏水洗。
(2)苏木素染细胞核：切片入苏木素染3～8min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。
(3)伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色1～3min。蒸馏水稍洗。
(4)脱水封片：将切片依次放入80％酒精5min，95％酒精I 5min，95％酒精II5min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，二甲苯Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
(5)显微镜镜检，图像采集分析。
(二)肝细胞标记物检测(石蜡切片免疫组化)
(1)石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟。
(2)脱蜡和水化：二甲苯I(10min)→甲苯I(10min)→无水乙醇(5min 2次)→95％乙醇(5min×2)→-90％乙醇(5min)→80％乙醇(5min)。
(3)H202室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
(4)蒸馏水冲洗5min×3。
(5)抗原修复：将切片放入盛有PBS缓冲液(工作液)的容中置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92～98℃之间并持续10～15分钟。
(6)取出容器，室温冷却10～20分钟(注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型)。
(7)常规血清封闭：正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育15分钟。
(8)滴加一抗：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加一抗工作液，37℃孵育1～2h，或4℃过夜。所使用的一抗信息具体如下：1、迈新，Kit-0026 CD68抗体试剂(免疫组织化学)；2、迈新，Kit-0003 CD3抗体试剂(免疫组织化学)；3、迈新，RMA-0514CD8抗体试剂(免疫组织化学)；4、迈新，Kit-0006 SMA抗体试剂(免疫组织化学)；5、迈新，MAB-0829CK19抗体试剂(免疫组织化学)。
(9)PBS冲洗5min×3洗去抗体。
(10)加入稀释的二抗，室温孵育1～2h。所使用的二抗信息具体如下：迈新，KIT-5230，DAB染色液(MaxVisionⅢ鼠/兔)。
(11)PBS洗5min×3。
(12)DAB显色：5～20min，待自来水充分冲洗。
(13)苏木素复染：室温2～3min，自来水充分冲洗。
(14)1％盐酸酒精分化2s，自来水充分冲洗。
(15)脱水、透明：80％乙醇(5min)-95％乙醇(5min)-95％乙醇(5min)-100％乙醇(5min)→二甲苯(10min)→二甲苯(10min)。
(16)封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干。
(三)肝细胞生理功能检测(白蛋白检测)
A、试剂准备(HumanALB(Albumin)ELISAKit，D711271-0096，BBI)
(1)试剂回温：在实验前20min将试剂盒、待测样本放置于室温下。读数前15min打开酶标仪预热。
(2)配制洗涤液：预先计算好稀释后的洗涤液使用体积，然后用双蒸水或去离子水将25倍浓缩洗涤液稀释成1倍应用液。
提示：从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可用40℃水浴微加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液。当日使用。
(3)标准品梯度稀释：标准品于10000X g离心1min，加入标准品&样品稀释液1.0mL至冻干标准品中，旋紧管盖，静置10min，上下颠倒数次，待其充分溶解后，轻轻混匀，配成10ng/mL的标准品工作液。然后根据需要进行倍比稀释。建议配制成以下浓度：10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.63ng/mL、0.31ng/mL、0.16ng/mL、0ng/mL。倍比稀释方法：取7支EP管，每管中加入500μl标准品&样品稀释液，从10ng/mL的标准品工作液中吸取500μL到其中一支EP管中混匀配成10ng/mL的标准品工作液，按此步骤往后依次吸取混匀。
提示：最后一管直接作为空白孔，不需要再从倒数第二管中吸取液体。
(4)生物素标记抗体工作液：预先计算好试验所需用量(以100μl/孔计算)，用稀释液SD2将100倍生物素标记抗体浓缩液稀释成1倍工作液(稀释前充分混匀)，请在30min内加入到反应孔中。
(5)HRP标记链霉亲和素：按每次试验所需用量配制(100μl/孔计算)，用稀释液SD3将100倍浓缩HRP标记链霉亲和素稀释成1倍应用工作液(稀释前离心)，请在30min内使用。
(6)洗涤方法：
自动洗板：甩尽酶标板孔中液体，在厚迭吸水纸上拍干，注入洗涤液为350μL/孔，注入与吸出间隔为30s，洗板5次。
手工洗板：甩尽酶标板孔中液体，在厚迭吸水纸上拍干，用洗瓶加入洗涤液350μL/孔，静止1～2min后甩净酶标板孔中液体，在厚迭的吸水纸上拍干，洗板5次。
B、操作程序
(1)预先计算好所需的板条数，实验前30min，拿出试剂盒，恢复至室温。
(2)每个反应孔中加入100μL标准品工作液及检测样本(若样本浓度高于检测范围，需用标准品&样本稀释液稀释后取样)，标准品需做复孔，封板后于37℃孵箱孵育90min。
提示：加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，避免产生气泡。加样时间控制在10min内。
(3)弃去液体，甩干，每个反应孔中加入100μL生物素标记白蛋白抗体工作液至反应孔中，封板后于37℃孵箱孵育60min。
(4)洗涤：弃去液体，甩干，每个反应孔中加入350μL洗涤液，浸泡1～2min，甩干洗涤液。重复4次。
(5)每个反应孔中加入100μLHRP标记链霉亲和素工作液至反应孔中，封板后于37℃孵箱孵育30min。
(6)洗涤：每个反应孔中加入300μL洗涤液，间隔30s，甩干洗涤液。重复4次。
(7)每个反应孔中加入90μL显色剂(避光)至反应孔中，封板后于37℃避光显色15min左右。
(8)每个反应孔中加入50μL终止液，即刻用酶标仪450nm波长下测量OD值(5min内)。(9)用酶标仪450nm波长测定OD值。
(10)计算标准品、样品的平均OD值：每个标准品和样本的OD值应减去零孔的OD值。
(11)以标准品浓度为横坐标，吸光度OD值为纵坐标，用软件绘制标准曲线。(作图时去掉空白组的值)
(12)若样本OD值高于标准曲线上限，应做适当稀释后重新检测，计算浓度时再乘以稀释倍数。
实施例1
一、准备工作
(1)取健康的新鲜肝组织放置于加入10％双抗(青霉素/链霉素)的生理盐水中，并在冰上运输保存。
(2)安装好刀片并启动LeciaVT1200S，准备切片。
二、新鲜肝组织切片
(1)用组织取样器将新鲜肝组织样本取8mm大小并用3％琼脂糖凝胶包埋，并在冰上放置5min。
(2)待其凝固后，将样本固定在标本盘上，待其粘贴牢固。
(3)将标本盘放到缓冲液中，调节到需要的位置，标本盘通过磁性在缓冲液托盘中固定到位。
(4)调节刀架，将其旋转到需要的间隙角度标记。
(5)设置参数，样品的切片厚度参见表1。
(6)设置所需要的窗口，进行自动切割。
(7)将切好的样品取出，用清洗液充分清洗。
(8)用74μm孔径大小的transwell小室的12孔板(或贴壁培养的方式)进行培养，每孔加2mL的培养基，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每天更换新鲜培养液。连续培养6天。
表1
Figure BDA0003251653860000111
Figure BDA0003251653860000121
由表1的结果可知，通过本发明所提供的新鲜肝组织切片的体外培养方法，可以在体外进行肝组织切片的培养，培养获得的肝组织切片中细胞存活率可以接近90％，且能够正常表达各种肝组织标志物(例如，CK19、SMA、CD68、CD3、CD8等)，并且能够正常分泌白蛋白，具有正常肝细胞生理功能。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种新鲜肝组织切片的体外培养基，所述体外培养基按体积百分比计，包括如下组分：
Figure FDA0003251653850000011
所述青霉素/链霉素溶液中青霉素/链霉素的浓度为8000～12000U/ml；
所述新鲜肝组织切片的体外培养基中还包括地塞米松和丙酮酸钠，所述新鲜肝组织切片的体外培养基中，地塞米松的浓度为50～200nM，丙酮酸钠的浓度为0.8～1.2mM。
2.一种新鲜肝组织切片的体外培养方法，包括：在适合肝细胞培养的条件下，将新鲜肝组织切片置于如权利要求1所述的体外培养基中进行培养。
3.如权利要求2所述的一种新鲜肝组织切片的体外培养方法，其特征在于，在37℃±0.5℃、5％±0.2％CO2的条件下进行培养，培养时间为1～8天。
4.如权利要求2所述的一种新鲜肝组织切片的体外培养方法，其特征在于，新鲜肝组织切片的厚度为100～400μm。
5.如权利要求2所述的一种新鲜肝组织切片的体外培养方法，其特征在于，所述新鲜肝组织切片为经受清洗处理后的新鲜肝组织切片，清洗处理中所使用的清洗缓冲液包括胎牛血清、青霉素/链霉素溶液、Hanks缓冲液，所述青霉素/链霉素溶液中青霉素/链霉素的浓度为8000～12000U/ml。
6.如权利要求5所述的一种新鲜肝组织切片的体外培养方法，其特征在于，按体积百分比计，所述清洗缓冲液包括如下组分：
Hanks缓冲液 82～99％；
青霉素/链霉素溶液 0.5～3％；
胎牛血清 0.5～15％。
7.如权利要求2所述的一种新鲜肝组织切片的体外培养方法，其特征在于，还包括：在切割缓冲液存在的条件下切割新鲜肝组织，以提供新鲜肝组织切片，所述切割缓冲液包括胎牛血清、青霉素/链霉素溶液、DMEM/F12基础培养基，所述青霉素/链霉素溶液中青霉素/链霉素的浓度为8000～12000U/ml。
8.如权利要求7所述的一种新鲜肝组织切片的体外培养方法，其特征在于，按体积百分比计，所述切割缓冲液包括如下组分：
DMEM/F12 85～99％；
青霉素/链霉素溶液 0.5～3％；
胎牛血清 0.5～15％。
9.如权利要求7所述的一种新鲜肝组织切片的体外培养方法，其特征在于，切割新鲜肝组织的过程中，通过粘合剂对新鲜肝组织进行固定，所述粘合剂选自琼脂糖。
10.一种肝组织切片样本，由权利要求1所述的新鲜肝组织切片的体外培养基、或如权利要求2～9任一权利要求所述的新鲜肝组织切片的体外培养方法制备获得。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107530425A (zh) * 2015-04-14 2018-01-02 勃林格殷格翰国际有限公司 治疗疾病的方法
US20190002809A1 (en) * 2015-10-22 2019-01-03 University Of Newcastle Upon Tyne Cell culture
CN112680401A (zh) * 2021-01-07 2021-04-20 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 罗非鱼精密肝切片损伤模型及其构建方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107530425A (zh) * 2015-04-14 2018-01-02 勃林格殷格翰国际有限公司 治疗疾病的方法
US20190002809A1 (en) * 2015-10-22 2019-01-03 University Of Newcastle Upon Tyne Cell culture
CN112680401A (zh) * 2021-01-07 2021-04-20 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 罗非鱼精密肝切片损伤模型及其构建方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HOLGER P. BEHRSING ET AL.: "Extended rat liver slice survival and stability monitored using clinical biomarkers", 《BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS》 *
LIZA DEWYSE ET AL.: "Best Practices and Progress in Precision-Cut Liver Slice Cultures", 《INT. J. MOL. SCI. 》 *
周璐等: "精密肝切片技术在药物研究中的应用", 《中成药》 *

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