CN103505445B - 二甲双胍的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种二甲双胍的新用途。本发明提供了二甲双胍在制备预防和/或治疗肿瘤产品中的应用。所述肿瘤为子宫内膜癌。所述子宫内膜癌的癌细胞为Ishikawa细胞或HEC-1B细胞。所述产品为药物。本发明的实验证明，本发明发现了二甲双胍抑制子宫内膜癌细胞的增殖，且其的作用半数致死量（IC50值）接近于人体二甲双胍血药浓度，为子宫内膜癌的药物制备奠定了基础，可以用于预防和治疗子宫内膜癌。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种二甲双胍的新用途。
背景技术
二甲双胍作为治疗2型糖尿病经典而有效的药物，已有近50年的临床应用历史。二甲双胍是一种降血糖药，具有提高血糖耐受性、降低基础和餐后血糖的作用。二甲双胍的作用机理不同于其它类型的口服抗血糖药，它可减少肝糖的产生，降低小肠对糖的吸收，并且还可增加外周糖的摄取和利用，从而提高胰岛素的敏感性。与磺酰脲类药物不同的是，二甲双胍不会使2型糖尿病患者或正常血糖的患者产生低血糖症。二甲双胍治疗后，胰岛素总分泌量保持不变，而降低空腹胰岛素水平及每日血浆胰岛素水平。二甲双胍可以抑制TNF-α引起的慢性脂肪分解，还减弱异丙肾上腺素导致的急性脂肪分解。同时，二甲双胍能够明显抑制高浓度葡萄糖直接刺激引起的脂肪分解作用，还能够抑制高浓度葡萄糖促进TNF-α和异丙肾上腺素分泌进而刺激脂肪的分解作用。
子宫内膜癌是常见的妇科恶性肿瘤，占女性肿瘤患者的6%，且近年来其发病率有上升趋势。大约80%的子宫内膜癌患者诊断为I期并需要行子宫切除术。一些肥胖、月经不规则、长期不排卵和多囊卵巢的年轻病人易患子宫内膜癌。这部分病人面临着治疗的困境：非常关心生育功能的保留。因此保留生育功能的治疗对这些病人来说至关重要。大量证据表明肥胖、糖尿病和胰岛素抵抗是子宫内膜癌的危险因素。而二甲双胍，这个常用于治疗2型糖尿病的药物，有改善肥胖、糖尿病和胰岛素抵抗的作用。
因此，二甲双胍是否有抑制子宫内膜癌细胞生长的作用成为研究热点。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种二甲双胍的新用途。
本发明提供了二甲双胍在制备预防和/或治疗肿瘤产品中的应用。
所述肿瘤为子宫内膜癌。
所述子宫内膜癌的癌细胞为Ishikawa细胞和HEC-1B细胞。
所述产品为药物。
本发明的另一个目的是提供了二甲双胍的新用途。
本发明提供了二甲双胍在制备抑制动物肿瘤细胞增殖的产品中的应用。
所述肿瘤为子宫内膜癌。
所述子宫内膜癌的癌细胞为Ishikawa细胞和HEC-1B细胞。
所述动物为人或小鼠。
本发明的实验证明，本发明发现了二甲双胍抑制子宫内膜癌细胞增殖，且其作用的半数致死量（IC50值）接近于人体二甲双胍血药浓度，为子宫内膜癌的药物制备奠定了基础，可以用于预防和治疗子宫内膜癌。
附图说明
图1为Ishikawa细胞在IGF-II和二甲双胍作用下增殖变化图
图2为二甲双胍作用裸鼠子宫内膜癌模型30天后裸鼠照片
图3为二甲双胍作用裸鼠子宫内膜癌模型30天后剥出肿瘤组织照片
图4为两组裸鼠体内移植肿瘤体积变化
图5为两组裸鼠体重变化
图6为剥出肿瘤组织HE染色结果
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的PBS配方如下表1所示：
表1磷酸盐缓冲液(PBS)的配制
0.22μm滤膜过滤除菌，于4℃保存备用。
实施例1、细胞水平验证二甲双胍抑制子宫内膜癌细胞增殖
（1）检测IGF-II和二甲双胍对子宫内膜癌生长的作用
Ishikawa（子宫内膜癌细胞，Ishikawacelllinehuman,sigma,99040201）和HEC-1B（子宫内膜癌细胞，ATCC，HTB-113）分别以8×103/孔和1×104/孔的浓度接种于96孔板24h后（即细胞饥饿24h后,培养基为DMEM/F12,购自sigma，产品目录号为D6241），每种细胞均分为如下6组进行：
①对照组（control）：加入200μL的PBS；
②IGF-II（胰岛素样生长因子II，insulinlikegrowthfactorIIR&D,292-G2-050）5ng/ml组：加入200ul在培养体系中终浓度为5ng/ml的IGF-II；
③IGF-II（胰岛素样生长因子II，insulinlikegrowthfactorIIR&D,292-G2-050）10ng/ml组：加入200ul在培养体系中终浓度为10ng/ml的IGF-II。
④Met1E-5（二甲双胍，metformin、sigma,D150959）组：加入Met1E-5，使其在培养体系中的终浓度为0.1μM；
⑤IGF-II5ng/ml+Met1E-5组：加入IGF-II和Met1E-5，使IGF-II在培养体系中的终浓度为5ng/ml，使Met1E-5在培养体系中的终浓度为0.1μM；
⑹IGF-II10ng/ml+Met1E-5组：加入IGF-II和Met1E-5，使IGF-II在培养体系中的终浓度为10ng/ml，使Met1E-5在培养体系中的终浓度为0.1μM；
将上述每种细胞的6组进行培养（DMEM/F12+FBS,sigma,D6241;GIBCO,20℃）72h，用BrdU-ELISA试剂盒（Roche）（CellProliferationELISA,BrdU(colorimetric)Cat.No.11647229001）检测每种细胞增殖的变化（增殖率=实验组（A450nm）/对照组（A450nm）×100%）。同时用MTT方法验证BrdU技术的有效性。
实验重复3次，结果取平均值±标准差。
结果如图1所示，其中，A为Ishikawa细胞在5ng/mlIGF-II和二甲双胍作用的增殖变化图；B为HEC-1B细胞在5ng/mlIGF-II和二甲双胍作用的增殖变化图；C为Ishikawa细胞在10ng/mlIGF-II和二甲双胍作用的增殖变化图；D为HEC-1B细胞在10ng/mlIGF-II和二甲双胍作用的增殖变化图；
Ishikawa细胞中，对照组在24h、48h、72h的增殖率分别为0.526±0.0856、0.762±0.026、1.29±0.01；IGF-II5ng/ml组在24h、48h、72h的增殖率分别0.637±0.038,0.934±0.034,1.363±0.0404；Met1E-5组在24h、48h、72h的增殖率分别为0.507±0.0358、0.632±0.019、0.952±0.088；IGF-II5ng/ml+Met1E-5组在24h、48h、72h的增殖率分别为0.517±0.02、0.795±0.102、0.973±0.097；IGF-II10ng/ml组在24h、48h、72h的增殖率分别为0.7903±0.04673、1.2897±0.01、1.4823±0.1168；IGF-II10ng/ml+Met1E-5组在24h、48h、72h的增殖率分别为0.6253±0.0467、0.832±0.0981、1.37±0.04；
HEC-1B细胞中，Control在24h、48h、72h的增殖率分别为0.436±0.0186、0.647±0.02、1.182±0.0115；IGF-II5ng/ml组在24h、48h、72h的增殖率分别为0.457±0.01735、0.74±0.0104、1.272±0.01；Met1E-5组在24h、48h、72h的增殖率分别为0.407±0.022、0.512±0.1264、0.742±0.0407；IGF-II5ng/ml+Met1E-5组在24h、48h、72h的增殖率分别为0.437±0.027、0.642±0.0543、0.99±0.1036；IGF-II10ng/ml组在24h、48h、72h的增殖率分别为0.502±0.027、1.032±0.0824、1.234±0.1132；IGF-II10ng/ml+Met1E-5组在24h、48h、72h的增殖率分别为0.448±0.0399、0.667±0.013、0.952±0.079；
可以看出，IGF-II促进Ishikawa和HEC-1B细胞增殖，但这种促进作用能够被二甲双胍减弱，且这种抑制作用在72h时比较显著。
(2）二甲双胍的半数致死量（IC50值）接近于人体二甲双胍血药浓度
将用BrdU检测的细胞增殖数值输入Chou和Talalay软件中，计算得出IC50值，结果如表2所示：
表2二甲双胍在Ishikawa和HEC-1B细胞系中的IC50值
注：IC50值是基于Chou和Talalay的中间效应分析计算所得。
二甲双胍平均的IC50值分别为Ishikawa：21.4μM，HEC-1B：18.9μM。
盐酸二甲双胍的血药浓度在0.079～3.97μg/ml。盐酸二甲双胍的分子量是165.63g/mol，故血药浓度是4.77E-7～2.39E-5,本实验结果所示二甲双胍的有效浓度在人体二甲双胍的血药浓度之内，故可以用来制备药物。
实施例2、动物水平验证二甲双胍抑制子宫内膜癌细胞增殖
(1)建立裸鼠成瘤模型
①饲养条件
实验选用4-6周龄的雌性BALB/c裸鼠10只，北京维通利华实验动物技术有限公司提供（SPF级，实验动物生产许可证号，SCXK（京）2006-0008，体重为18-24g/只）。饲养由科澳协力饲养有限公司提供的SPF级标准饲料（北京市实验动物质量合格证明编号，SCXK（京）2005-0007）。实验期间所有动物置于同一室内，清洁级饲料饲养，由北京大学医学部科学部持上岗证人员负责饲养，自由进食，饮水。
子宫内膜癌细胞（Ishikawa）购自Ishikawacelllinehuman,sigma,99040201。
②动物实验药物
用PBS将水溶性药物二甲双胍配制为浓度10-1M的二甲双胍储备液，-20℃保存。
对照组给予等量的PBS做空白对照。
③实验方案：
a)6-8周裸鼠16只,接种瘤前测裸鼠体重。
接种Ishikawa细胞密度5×107/ml,接种前混匀，150μL细胞/裸鼠，接种于右侧腋下。
裸鼠接种人子宫内膜癌细胞Ishikawa细胞株后每天观察其种植部位肿瘤生长情况，进食和活动情况，称重。接种点局部皮肤接种后1-2天略有肿胀、红斑或硬结，一周内逐渐消失。接种后5-7天接种部位开始出现白色小结节，然后逐渐长大。结节周围无红肿，边界清楚，活动度好，多呈圆形或椭圆形。部分癌结节长大后出现表面破溃及少量渗血，因这种情况会影响癌瘤的测量，将这类裸鼠剔除实验。肿瘤增大后可逐步向其上肢和颈背部皮下扩大，并向身体其他部位转移。如：肝脏。本实验剔除向肝脏转移、出现腹水的裸鼠。
b)接种后第14天，选取12只肿瘤组织直径达约4mm的裸鼠，把12只裸鼠随机分成2组：1组给予二甲双胍治疗，另一组为对照。
c)给药方案：
i.二甲双胍组：加入0.5ml的10-1M二甲双胍储备液到裸鼠的饮用水中，使二甲双胍在饮用水中的终浓度为200μg/ml，每天给二甲双胍8mg。
ii.对照组：给予相同体积的PBS加于裸鼠的饮用水中，每天给PBS0.125ml。每4天测肿瘤体积，在体肿瘤体积的计算：V=π/6(长×宽2)
d)每4天测裸鼠体重。
e)每天连续给药30天后终止试验（终止给药）。
④石蜡组织包埋（动物实验结束后，肿瘤组织石蜡包埋）
由北京大学医学部分子心血管实验室包埋。
⑤统计学方法
所有的数据都用均数±标准差表示，数据分析用SPSS13.0独立样本t检验,p<0.05视为有统计学意义。
（2)检测
①测量肿瘤大小
30天后终止试验，拍照观察两组的小鼠，结果如图2所示，左图为对照组、右图为二甲双胍组，可以看出，二甲双胍组的肿瘤明显小于对照组。
然后分别取出肿瘤组织，测量肿瘤的大小：计算肿瘤体积：V=π/6(长×宽×高)，结果见图3所示，可以看出，二甲双胍组的肿瘤组织明显小于对照组。
在连续给药的30天中，每天检测小鼠的肿瘤体积，实验重复三次，结果取平均值，结果如图4（上图为12只小鼠肿瘤体积的变化，下图为对照组和二甲双胍组每组裸鼠肿瘤体积平均值的变化）所示：
对照组在第1、5、9、13、17、21、25、30天的平均肿瘤体积分别为25.51±2.664mm3、39.54±8.99mm3、77.49±23.36mm3、123.1±31.77mm3、188.11±57.64mm3、274.81±94.2mm3、400.80±154.74mm3、500.27±192.3mm3；
二甲双胍组在第1、5、9、13、17、21、25、30天的平均肿瘤体积分别为27.31±1.71mm3、31.91±2.25mm3、44.68±3.98mm3、61.33±10.01mm3、84.45±19.54mm3、112.78±34.82mm3、148.96±51.51mm3、172.36±172.36mm3；
可以看出，二甲双胍组瘤体积较对照组瘤体积明显缩小（P<0.05）。
②称量裸鼠体重
在连续给药的30天中，每天检测裸鼠体重，实验重复三次，结果取平均值，结果如图5（上图为12只裸鼠体重的变化，下图为对照组和二甲双胍组每组裸鼠体重平均值的变化）所示：
对照组在第1、5、9、13、17、21、25、30天的平均体重分别为20.25±1.25g、20.63±1.36g、21.23±1.27g、21.90±1.40g、22.38±1.62g、22.67±1.75g、23.42±1.84g、23.72±1.92g；二甲双胍组在第1、5、9、13、17、21、25、30天的平均体重分别为20.22±1.14g、20.45±1.2g、20.63±1.17g、20.98±1.04g、21.43±1.18g、21.78±1.24g、22.3±1.7g、22.78±1.82g；可以看出，二甲双胍组裸鼠体重较正常对照组有下降的趋势，但差别没有统计学意义（P>0.05）。
③HE染色
具体方法如下：
1)石蜡组织包埋
由北京大学医学部分子心血管实验室包埋
2)HE染色
脱蜡水合
①二甲苯中脱蜡8分钟，重复三次
②无水乙醇中脱二甲苯10分钟，重复三次
③乙醇梯度水合，95％、75％、50％乙醇各10分钟
④流水冲洗10分钟
染苏木精与伊红
①苏木精染色5～10分钟，流水冲10分钟，去浮色
②1％盐酸酒精溶液分色1～2秒(切片由蓝变红)，自来水洗10～30秒
③0.1%氨水返蓝5～20秒
④流水冲洗10～15分钟
⑤0.1％伊红染色1～2分钟
⑥蒸馏水冲洗5分钟
脱水封片
①75％乙醇稍洗，95％乙醇脱水10分钟
②无水乙醇10分钟，重复三次
③二甲苯透明10分钟，重复三次
④中性树胶封片
（3）免疫组化
切片
将待检病理组织石蜡块切成5mm厚的薄片，置洁净的、经多聚赖氨酸处理的载玻片。
烤片
将组织切片置37℃，干烤3天。
脱蜡水化
①将烤好的切片置二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ各10分钟；
②100%酒精液Ⅰ、Ⅱ各10分钟；
③依次通过90%、80%、70%酒精溶液，各10分钟；
④取出切片，自来水冲洗10分钟。
灭活过氧化物酶及抗原修复
①经脱蜡至水的切片标本上，滴加3%双氧水阻断内源性过氧化物酶，以覆盖全部标本为度，湿盒37℃孵育10分钟；
②蒸馏水冲洗后，pH=7.2PBS浸泡3分钟；
③将切片置于枸橼酸盐缓冲液中，112℃（0.58kgf/cm），修复1-2分钟，自然冷却至室温，冷却过程中切片应始终浸泡于枸橼酸盐缓冲液中；
④同一标本的不同切片上，分别滴加一抗工作液(PTEN)1滴，于4℃湿盒中孵育18-24h，PBS冲洗、浸泡3分钟，重复3次；
⑤按试剂盒操作程序，于切片上分别滴加各种相应的二抗工作液，37℃湿盒孵育45分钟，PBS冲洗、浸泡3分钟，重复3次；
⑥滴加新鲜配制的DAB显色液于切片上，光学显微镜下随时观察（3-15min为界）
⑦以细胞膜和或细胞浆呈棕黄色着色为显色；
⑧滴加DAB显色增强剂，作用1-2分钟；
⑨切片用自来水冲洗洗10分钟。
苏木素复染将上述切片置于苏木素染液中复染，持续10秒，取出后用自来水缓缓冲洗30分钟。
切片脱水透明
①切片依次通过70%、80%、90%酒精溶液，各8分钟；
②100%酒精液Ⅰ、Ⅱ各10分钟；
③透明用二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10分钟。
④封片于切片上滴加中性树胶，加盖玻片封片，光学显微镜下观察。
结果如图6所示，将剥出的肿瘤组织做HE染色观察肿瘤组织结构的变化，可以看出，二甲双胍组肿瘤组织中见细胞形态消失，大片坏死细胞，细胞核碎裂。而对照组肿瘤组织中肿瘤细胞核大深染，见多个核分裂相。
Claims (1)
1.二甲双胍在制备抑制动物肿瘤细胞增殖的产品中的应用，
所述肿瘤为子宫内膜癌，所述子宫内膜癌的癌细胞为HEC-1B细胞，所述动物为小鼠，所述小鼠的给药方式为在小鼠的饮用水中加入二甲双胍，使二甲双胍在饮用水中的终浓度为200μg/ml，每天每只小鼠给二甲双胍8mg。
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