CN113616787A - 荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂及其制备方法与作为疫苗佐剂的应用 - Google Patents

荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂及其制备方法与作为疫苗佐剂的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂及其制备方法与作为疫苗佐剂的应用，所述方法包括：将锌盐加入多元醇溶剂中混匀，获得锌盐多元醇溶液；将所述锌盐多元醇溶液进行第一加热，后加入去离子水，进行第二加热至溶液出现浑浊，去除热源待自然冷却，获得反应产物；其中，所述去离子水与所述锌盐多元醇溶液的体积比为1：15～100；将所述反应产物进行固液分离，获得氧化锌纳米团簇沉淀，后清洗，获得荔枝状纳米氧化锌团簇。该荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂表面凹凸不平，有效提高抗原的吸附能力；该氧化锌纳米团簇与病毒、细菌的颗粒相似，可增加免疫细胞的识别和吞噬，提高抗原递呈效率。

Description

荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂及其制备方法与作为疫苗佐剂的 应用
技术领域
本发明涉及免疫学技术领域，特别涉及一种荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂及其制备方法与作为疫苗佐剂的应用。
背景技术
佐剂是非特异性免疫增强剂，当与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂通过改变抗原的物理形状，延缓抗原降解和排除，延长抗原在机体内保留时间；刺激单核吞噬细胞对抗原的递呈能力；刺激淋巴细胞分化，增加扩大免疫应答能力等机制来增强机体的免疫应答。佐剂的使用可降低抗原的用量或接种剂量/次数，提高疫苗的免疫效力。
目前常用佐剂主要有铝凝胶佐剂、油乳佐剂、蜂胶佐剂和脂质体佐剂，但上述佐剂仍然具有局部反应严重、不可冻干保存、稳定性差、生产技术难度大、成本高、功能性单一、免疫佐剂的装载和兼容性差等缺点。因此，研发高效、安全的新型免疫疫苗佐剂提高免疫效力是目前急需解决的问题。
纳米材料负载抗原，通过不同途径提高抗原呈递细胞(APC)的摄取率，纳米载体发挥关键作用；纳米颗粒又可以有效地保护负载的抗原/佐剂不受周围生物环境的影响，增加其半衰期，以引发适应性免疫应答，逐渐成为疫苗佐剂的研究热点。由于纳米粒子具有独特的载体结构特性，抗原物质与纳米粒子纳米颗粒不仅可以吸附并稳定疫苗抗原，同时能够延缓抗原的释放；另外，由于其尺寸与病原体相当，纳米颗粒可以使免疫原以与病原体递呈相同的方式递呈给免疫系统，诱导与自然感染相似的免疫应答。
因此，急需开发出一种提高抗原呈递效率的疫苗佐剂，成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明目的是提供一种荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂及其制备方法与作为疫苗佐剂的应用，该荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂表面凹凸不平，有效提高抗原的吸附能力；该氧化锌纳米团簇与病毒、细菌的颗粒非常相似，可增加免疫细胞的识别和吞噬，提高抗原递呈效率。
在本发明的第一方面，提供了一种荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂的制备方法，所述方法包括：
将锌盐加入多元醇溶剂中混匀，获得锌盐多元醇溶液；
将所述锌盐多元醇溶液进行第一加热，后加入去离子水，进行第二加热至溶液出现浑浊，去除热源待自然冷却，获得反应产物；其中，所述去离子水与所述锌盐多元醇溶液的体积比为1：15～100；
将所述反应产物进行固液分离，获得氧化锌纳米团簇沉淀，后清洗，获得荔枝状纳米氧化锌团簇。
进一步地，所述锌盐和所述多元醇溶剂的质量体积比为(1：20～200)g/L。
进一步地，所述锌盐包括无机锌盐和有机锌盐中的至少一种；其中，所述无机锌盐包括氯化锌、硫酸锌、硝酸锌、甲酸锌和乙酸锌中的至少一种。
进一步地，所述多元醇溶剂包括含有多羟基的醇类及其寡聚物和聚合物中的至少一种，所述含有多羟基的醇类包括乙二醇、丙二醇、二甘醇、甘油和聚乙二醇中的至少一种。
进一步地，所述第一加热包括：于120～180℃下预加热5～15min。
进一步地，所述第二加热包括：于120～180℃下预加热5～15min。
进一步地，所述第一加热、第二加热和所述去除热源待自然冷却中，全程进行磁力搅拌，所述磁力搅拌的转速为200～1000rpm。
进一步地，所述将所述反应产物进行固液分离，获得氧化锌纳米团簇沉淀，后清洗，获得荔枝状纳米氧化锌团簇，包括：
将所述反应产物用等体积有机溶剂稀释，后于6000～12000rpm离心5～10min收集氧化锌纳米团簇沉淀，采用有机溶剂清洗，获得荔枝状纳米氧化锌团簇。
在本发明的第二方面，提供了一种采用所述方法制备得到的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂，所述荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂由多个的纳米氧化锌球组装而成的直径为150～300nm荔枝状氧化锌团簇。
在本发明的第三方面，提供了所述的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂作为疫苗佐剂的应用。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
1、本发明提供的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂的制备方法，通过多元醇溶剂热法，将锌盐多元醇溶液进行第一加热以对锌盐进行溶解，向上述预热好的锌盐多元醇溶液中快速加入加入去离子水以引发锌盐的水解，进行第二加热至溶液出现浑浊，去除热源待自然冷却，获得反应产物；其中，所述去离子水与所述锌盐多元醇溶液的体积比为1：15～100目的在于使得锌盐水解速度适中获得团簇适中(直径为150～300nm)的荔枝状纳米氧化锌团簇。该方法简单有效、生产成本低、适于规模化生产；
2、本发明提供的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂，由直径5nm左右的纳米氧化锌球组装而成的荔枝状氧化锌团簇，其直径为150～300nm，表面凸凹不平，可见氧化锌纳米球；荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂表面凹凸不平，有效提高抗原的吸附能力；该氧化锌纳米团簇与病毒、细菌的颗粒相似，可增加免疫细胞的识别和吞噬，提高抗原递呈效率。纳米颗粒主要通过内吞和渗入的方式进入细胞，纳米颗粒的尺寸200nm左右、团簇状形貌、增大表面结构等直接影响其与细胞的交互作用，提高抗原呈递效率。
3、本发明提供的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂作为疫苗佐剂的应用，将荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂辅佐的猪伪狂犬病灭活疫苗(C1201株)疫苗具有接种量小，无不良反应，效率高的特点，。该佐剂不仅能够用于灭活疫苗和亚单位疫苗，还能运用于重组蛋白疫苗，有利于动物疫苗的免疫保护。且在动物安全方面上，相对于矿物油佐剂副作用明显减少。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明制备的荔枝状纳米氧化锌团簇的扫描电子显微镜照片；
图2为本发明制备的荔枝状纳米氧化锌团簇的X射线晶体衍射(XRD)图；
图3为本发明制备的荔枝状纳米氧化锌团簇的水合粒径分布图；
图4为本发明制备的荔枝状纳米氧化锌团簇的Zeta电位；
图5为荔枝状纳米氧化锌团簇为佐剂猪伪狂犬病灭活疫苗(C1201株)灭活疫苗溶液外观；
图6为免疫小鼠中和抗体对比结果；
图7为本发明实施例提供的一种荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂的制备方法的流程图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
本发明实施例提供一种荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂，总体思路如下：
根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂的制备方法，如图7所示，所述方法包括：
步骤S1、将锌盐加入多元醇溶剂中混匀，获得锌盐多元醇溶液；
所述步骤S1中：
所述锌盐包括无机锌盐和有机锌盐中的至少一种；其中，所述无机锌盐包括氯化锌、硫酸锌、硝酸锌、甲酸锌和乙酸锌中的至少一种。在其他实施方式中可选其他锌盐，本发明实施例优选乙酸锌；
所述多元醇溶剂包括含有多羟基的醇类及其寡聚物和聚合物中的至少一种，所述含有多羟基的醇类包括乙二醇、丙二醇、二甘醇、甘油和聚乙二醇中的至少一种。在其他实施方式中可选其他含有多羟基的醇类，本发明实施例优选二甘醇；
所述锌盐和所述多元醇溶剂的质量体积比为(1：20～200)g/L。优选1：50；该质量体积比有利于氧化锌的成核和组装形成团簇；多元醇溶剂添加过多不利于生成氧化锌核，多元醇溶剂添加过少不利于形成尺寸均一的团簇；
步骤S2、将所述锌盐多元醇溶液进行第一加热，后加入去离子水，进行第二加热至溶液出现浑浊，去除热源待自然冷却，获得反应产物；其中，所述去离子水与所述锌盐多元醇溶液的体积比为1：15～100；
上述技术方案中，所述去离子水与所述锌盐多元醇溶液的体积比为1：15～100目的在于使得锌盐水解速度适中获得团簇适中(直径为150～300nm)的荔枝状纳米氧化锌团簇；纳米颗粒主要通过内吞和渗入的方式进入细胞.大量的实验和理论分析表明,纳米颗粒的尺寸200nm左右、团簇状形貌、增大表面结构、等直接影响其与细胞的交互作用，提高抗原呈递效率。
所述去离子水与所述锌盐多元醇溶液的体积比若小于1:100锌盐水解速度慢，团簇尺寸变大；若大于1:15锌盐水解速度快，成核数量多，团簇尺寸小；所述去离子水与锌盐多元醇溶液的比例优选为1:50。
作为一种优选的实施方式，所述第一加热、第二加热和所述去除热源待自然冷却中，全程进行磁力搅拌，所述磁力搅拌的转速为200～1000rpm。
作为一种可选的实施方式，所述第一加热包括：于120～180℃下预加热5～15min。(最优时间10min)，加热过程中通过磁力搅拌使溶液受热均匀，磁力搅拌速度为200～1000rpm；所述第一加热起到预热的作用，预热温度若小于120℃锌盐水解较慢，若大于180℃多元醇会发生氧化变色；预热时间若小于5min溶液不能均匀受热，若大于15min会加速多元醇氧化变色；
作为一种可选的实施方式，所述第二加热包括：于120～180℃下预加热5～15min。在该条件下有利于荔枝状纳米氧化锌团簇成功合成。
作为一种具体的实施方式，在200～1000rpm(最优搅拌速度500rpm)持续磁力搅拌下，按照水：多元醇溶剂的体积比1:25、1:50、1:75、1:100(最优配比为1:50)向上述预热好的溶液中快速加入去离子水以引发锌盐的水解，继续加热5～15min(最优时间10min)溶液出现浑浊，证明此时荔枝状纳米氧化锌团簇成功合成；
步骤S3、将所述反应产物进行固液分离，获得氧化锌纳米团簇沉淀，后清洗，获得荔枝状纳米氧化锌团簇。
所述步骤S3具体包括：
将所述反应产物用等体积有机溶剂稀释，后于6000～12000rpm离心5～10min收集氧化锌纳米团簇沉淀，采用有机溶剂清洗，获得荔枝状纳米氧化锌团簇。
所述有机溶剂包括乙醇、甲醇、丙醇、异丙醇、二甲基甲酰胺中的一种，所述有机溶剂优选乙醇；
所述清洗步骤具体包括：加入适量有机溶剂并在超声协助下分散沉淀，然后通过6000～12000rpm离心5～10min收集氧化锌团簇；优选重复上述步骤1～3次得到纯化的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂。
根据本发明另一种典型的实施方式，提供了用所述方法制备得到的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂。所述荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂由许多直径5nm左右(范围可以列为4～6nm)的纳米氧化锌球组装而成的荔枝状氧化锌团簇，其直径为150～300nm，表面凸凹不平，可见氧化锌纳米球；
单个氧化锌团簇由许多更小的纳米颗粒组成，表面凹凸不平、比表面积大，有效提高抗原的吸附能力；更重要的是该纳米团簇与病毒、细菌的颗粒非常相似，可增加免疫细胞的识别和吞噬，提高抗原递呈效率；纳米颗粒主要通过内吞和渗入的方式进入细胞.大量的实验和理论分析表明,纳米颗粒的尺寸200nm左右、团簇状形貌、增大表面结构、等直接影响其与细胞的交互作用，提高抗原呈递效率。我们的材料基本符合这些描述。
根据本发明另一种典型的实施方式，提供了所述的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂作为疫苗佐剂的应用。
本发明实施例将荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂溶液稀释为浓度为1mg/mL的半成品备用；后将所述荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂溶液和已灭活的猪伪狂犬病病毒液(C1201株)(灭活前抗原含量为108.5TCID50/ml)按照灭活抗原体积比1:1吸附制备成疫苗待用。荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂辅佐的猪伪狂犬病灭活疫苗(C1201株)疫苗具有接种量小，无良反应，效率高的特点，有望在细菌、病毒、亚单位疫苗等多类疫苗制备方面得到广泛应用。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的一种荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂及其制备方法与作为疫苗佐剂的应用进行详细说明。
实施例1、荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂及其制备方法
1、将1.1g乙酸锌加入到装有50mL二甘醇的圆底烧瓶中，在300rpm的转速下磁力搅拌30min使乙酸锌充分溶解备用；
2、将装有上述溶液的圆底烧瓶放入180℃的硅油中预加热10min，加热过程中通过磁力搅拌使溶液受热均匀，磁力搅拌速度为500rpm；
3、在500rpm持续磁力搅拌下，按照水：二甘醇的体积比1:50向上述预热好的溶液中快速加入去离子水以引发锌盐的水解，继续加热10min溶液出现浑浊，证明此时荔枝状纳米氧化锌团簇成功合成；
4、移去热源，继续磁力搅拌直至溶液冷却至室温。产物用等体积乙醇稀释，10000rpm离心5min收集氧化锌纳米团簇沉淀，加入适量乙醇并在超声协助下分散沉淀，然后通过10000rpm离心5min收集氧化锌团簇，重复上述步骤3次得到纯化的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂。
5、本发明实施例制备得到的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂的SEM图如图1所述，由图1可知，本发明的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂由许多直径5nm左右的纳米氧化锌球组装而成的荔枝状氧化锌团簇，其直径为150～300nm，表面凸凹不平，可见氧化锌纳米球。
本发明实施例制备得到的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂的X射线晶体衍射(XRD)图如图2所示，可知荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂为六方纤锌矿氧化锌晶体；
本发明实施例制备得到的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂的水合粒径分布图如图3所示，表明荔枝状纳米氧化锌团簇的粒径分布在100～400nm，主要分布在200nm～300nm；
本发明实施例制备得到的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂的的Zeta电位如图4所示，表明颗粒表面带有正电荷。
实施例2、荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂及其制备方法
1、将1.1g乙酸锌加入到装有22mL二甘醇的圆底烧瓶中，在200rpm的转速下磁力搅拌30min使乙酸锌充分溶解备用；
2、将装有上述溶液的圆底烧瓶放入120℃的硅油中预加热15min，加热过程中通过磁力搅拌使溶液受热均匀，磁力搅拌速度为500rpm；
3、在500rpm持续磁力搅拌下，按照水：二甘醇的体积比1:15向上述预热好的溶液中快速加入去离子水以引发锌盐的水解，继续加热10min溶液出现浑浊，证明此时荔枝状纳米氧化锌团簇成功合成；
4、移去热源，继续磁力搅拌直至溶液冷却至室温。产物用等体积乙醇稀释，10000rpm离心5min收集氧化锌纳米团簇沉淀，加入适量乙醇并在超声协助下分散沉淀，然后通过10000rpm离心5min收集氧化锌团簇，重复上述步骤3次得到纯化的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂。本发明实施例制备得到的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂的SEM和XRD图基本同实施例1。
实施例3、荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂及其制备方法
1、将1.1g乙酸锌加入到装有220mL二甘醇的圆底烧瓶中，在1000rpm的转速下磁力搅拌30min使乙酸锌充分溶解备用；
2、将装有上述溶液的圆底烧瓶放入160℃的硅油中预加热12min，加热过程中通过磁力搅拌使溶液受热均匀，磁力搅拌速度为500rpm；
3、在500rpm持续磁力搅拌下，按照水：二甘醇的体积比1:100向上述预热好的溶液中快速加入去离子水以引发锌盐的水解，继续加热10min溶液出现浑浊，证明此时荔枝状纳米氧化锌团簇成功合成；
4、移去热源，继续磁力搅拌直至溶液冷却至室温。产物用等体积乙醇稀释，10000rpm离心5min收集氧化锌纳米团簇沉淀，加入适量乙醇并在超声协助下分散沉淀，然后通过10000rpm离心5min收集氧化锌团簇，重复上述步骤3次得到纯化的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂。本发明实施例制备得到的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂的SEM和XRD图基本同实施例1。
实施例4、猪伪狂犬病灭活疫苗(C1201株)灭活疫苗的制备
1、将实施例1制备好的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂用生理盐水稀释配置成1mg/mL，置于4℃冰箱备用；
2、将灭活后的猪伪狂犬病病毒液(C1201株)(灭活前抗原含量为108.5TCID50/ml)按照体积比1：1比例与荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂充分混合，即得实验佐剂疫苗。(分别以制备的三批纳米氧化锌团簇佐剂配制三批实验佐剂疫苗，记为实验佐剂疫苗1、实验佐剂疫苗2和实验佐剂疫苗3。
实施例5、实验佐剂疫苗对小鼠的安全性试验
每批疫苗腹腔注射小鼠20只，0.5ml/只，并设未接种对照小鼠5只。接种后连续观察14日，每日观察记录小鼠的精神、食欲及死亡情况等。对小鼠的安全性试验结果显示：试验鼠精神及食欲正常，均健活；注射部位观察疫苗吸收良好、无红肿、无结节；白油佐剂对照疫苗组小鼠注射部位疫苗为完全吸收(表1)。
表1-疫苗对小鼠接种的临床观察结果
Figure BDA0003208644080000081
由表1的数据可知，本发明的佐剂制备疫苗对昆明小鼠安全性良好。
实施例6、实验佐剂疫苗对兔的安全性试验
每批疫苗腿部肌肉注射兔5只，5.0ml/只，同时设空白对照兔5只相同条件下饲养，连续观察14日，每日观察记录兔注射部位有无肿包、精神状态、食欲及死亡情况等。
表2-疫苗对兔接种后的临床观察结果
Figure BDA0003208644080000082
试验结果显示：经过连续观察14日，试验兔精神及食欲正常；注射部位观察疫苗吸收良好、无红肿、无结节；白油佐剂对照疫苗注射部位疫苗未完全吸收(表2)。空白对照组均健活，无异常临床反应。表明实验佐剂制备疫苗对兔安全性良好，免疫无残留。
实施例7、实验佐剂疫苗对仔猪的安全性试验
将25头仔猪随机分为5组，每组5头，每种佐剂疫苗接种仔猪5头，颈部肌肉注射4ml/头，另一组为空白对照。免疫后每日测量体温，并观察猪的精神状态、食欲，记录仔猪的不良反应。14日后剖检观察注射部位局部炎症反应及各脏器病变状况。根据不同佐剂疫苗对仔猪免疫后的体温、临床表现、局部炎症反应及脏器病理变化等安全性指标的影响程度，评价纳米氧化锌团簇作为佐剂制备疫苗的安全性。仔猪体温结果见表3，临床观察结果见表4。
表3-试验佐剂配制疫苗免疫仔猪后的体温记录
Figure BDA0003208644080000091
Figure BDA0003208644080000101
表4-试验佐剂配制疫苗免疫仔猪后的临床观察结果
Figure BDA0003208644080000102
Figure BDA0003208644080000111
*注：“临床表现无异常”指仔猪精神、食欲及体温正常。
试验结果显示：疫苗接种仔猪后连续观察14日，仔猪体温、精神及食欲均正常，试验猪均未出现不良反应及死亡情况；试验结束后解剖试验猪，心、肺、肝、脾、肾、脑、扁桃体及淋巴结等脏器均无病变。白油佐剂疫苗眼观有未完全吸收疫苗。结果表明，试验佐剂疫苗安全性良好，优于白油佐剂疫苗。
实施例8、实验佐剂疫苗对小鼠的有效性
将3批实验佐剂疫苗和白油佐剂对照疫苗分别接种17～22g昆明小鼠20只，每只腹腔免疫0.3ml。同时设置攻毒对照组5只、空白对照组5只。于免疫后21日用伪狂犬病毒PRVHP-17株强毒株进行攻毒，每只腹腔注射伪狂犬病毒PRV HP-11株病毒液0.1ml(含200LD50)。连续观察10日，记录每组小鼠健活数。3批实验佐剂疫苗组16～19只小鼠健活；白油佐剂疫苗组12/20健活；攻毒对照5/5死亡；空白对照5/5健活。结果见表5，荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂辅助的猪伪狂犬病灭活疫苗能显著提高免疫小鼠的攻毒保护率。
表5-对小鼠免疫攻毒试验结果
组别 死亡数(只) 健活数/总数
实验佐剂疫苗1 2 18/20
实验佐剂疫苗2 1 19/20
实验佐剂疫苗3 4 16/20
白油佐剂对照疫苗组 8 12/20
攻毒对照组 5 0/5
空白对照组 0 5/5
实施例9、免疫小鼠产生中和抗体检测
按表6中分组(荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂，商业白油佐剂对照，商业铝胶佐剂对照，和空白对照)各免疫小鼠20只，各腹腔注射疫苗0.3ml，14日后，再次各腹腔注射疫苗0.3ml。初次免疫后4，8，16，24，28周采集小鼠尾静脉血，分离血清，将待检血清倍比稀释后，分别加入等量的含有100TCID50的伪狂犬病毒液，置37℃下作用60分钟，接种96孔ST细胞培养板，根据各孔CPE情况统计数据，计算被检血清中和抗体效价。(表6)所获得的实验数据以SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析，P﹤0.05具有统计学意义(图6)。
表6 免疫小鼠产生中和抗体
Figure BDA0003208644080000121
通过表6数据分析可以看出，从第四周开始，各个实验组都能产生中和抗体，并普遍在十二周以后达到峰值。其中荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂实验组取得了最佳免疫效果，中和抗体水平都显著高于其他对照实验组P﹤0.05，并同时在整个检测期间都维持较高的水平。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
将锌盐加入多元醇溶剂中混匀，获得锌盐多元醇溶液；
将所述锌盐多元醇溶液进行第一加热，后加入去离子水，进行第二加热至溶液出现浑浊，去除热源待自然冷却，获得反应产物；其中，所述去离子水与所述锌盐多元醇溶液的体积比为1：15～100；
将所述反应产物进行固液分离，获得氧化锌纳米团簇沉淀，后清洗，获得荔枝状纳米氧化锌团簇。
2.根据权利要求1所述的一种荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂的制备方法，其特征在于，所述锌盐和所述多元醇溶剂的质量体积比为(1：20～200)g/L。
3.根据权利要求1所述的一种荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂的制备方法，其特征在于，所述锌盐包括无机锌盐和有机锌盐中的至少一种；其中，所述无机锌盐包括氯化锌、硫酸锌、硝酸锌、甲酸锌和乙酸锌中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的一种荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂的制备方法，其特征在于，所述多元醇溶剂包括含有多羟基的醇类及其寡聚物和聚合物中的至少一种，所述含有多羟基的醇类包括乙二醇、丙二醇、二甘醇、甘油和聚乙二醇中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的一种荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂的制备方法，其特征在于，所述第一加热包括：于120～180℃下预加热5～15min。
6.根据权利要求1所述的一种荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂的制备方法，其特征在于，所述第二加热包括：于120～180℃下预加热5～15min。
7.根据权利要求1所述的一种荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂的制备方法，其特征在于，所述第一加热、第二加热和所述去除热源待自然冷却中，全程进行磁力搅拌，所述磁力搅拌的转速为200～1000rpm。
8.根据权利要求1所述的一种荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂的制备方法，其特征在于，所述将所述反应产物进行固液分离，获得氧化锌纳米团簇沉淀，后清洗，获得荔枝状纳米氧化锌团簇，包括：
将所述反应产物用等体积有机溶剂稀释，后于6000～12000rpm离心5～10min收集氧化锌纳米团簇沉淀，采用有机溶剂清洗，获得荔枝状纳米氧化锌团簇。
9.一种采用权利要求1-8任一所述方法制备得到的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂，其特征在于，所述荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂由多个的纳米氧化锌球组装而成的直径为150～300nm荔枝状氧化锌团簇。
10.权利要求9所述的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂作为疫苗佐剂的应用。
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