CN113616690B - 一种肉桂叶残渣提取物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种肉桂叶残渣提取物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于天然提取物技术领域，公开了一种肉桂叶残渣提取物及其制备方法与应用。将提取挥发油后的肉桂叶残渣粉碎后过筛得到肉桂叶残渣粉，再加入乙醇进行回流提取，乙醇体积分数为60％～90％，肉桂叶残渣粉与乙醇料液比为1:8～1:40，回流提取的温度为50～90℃，提取液减压旋蒸浓缩，减压旋蒸浓缩的温度为35～50℃，冷冻干燥后得到肉桂叶残渣提取物。本发明制备的肉桂叶残渣提取物具有较强的抗氧化活性、抗衰老活性和抗炎活性，可用于制备抗氧化、抗衰老、抗炎药物或功能性食品。

Description

一种肉桂叶残渣提取物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于天然提取物技术领域，具体涉及一种肉桂叶残渣提取物及其制备方法与应用。
背景技术
肉桂(Cinnamomum cassia)是樟科樟属的热带、亚热带常绿乔木，原产地为中国，在我国广东、广西等地有大面积栽培。肉桂树皮主要用作药材和香料，目前开发利用程度高，已有较高的应用价值。肉桂叶的用途较为单一，常用于提取挥发油。然而，肉桂精油提取率仅为0.8％-1.2％，提取后剩余大量残渣，残渣通常用作燃料或者直接废弃，造成了自然资源的浪费和环境污染。现阶段，国内外关于肉桂叶的研究主要集中在挥发油，对于肉桂叶残渣的开发及利用研究较少，现有技术采用超声波辅助提取法提取肉桂叶残渣中的多酚、黄酮类化合物，提取物中总多酚质量分数仅为10％左右，总黄酮质量分数仅为15％左右(程贤,毕良武,曾维星,等.肉桂蒸油剩余物中活性成分的提取,纯化及其抗氧化活性研究[J].林产化学与工业,2020,040(002):109-116.)。
发明内容
本发明为解决上述背景技术中提出的问题，本发明的首要目的在于提供一种肉桂叶残渣提取物的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的肉桂叶残渣提取物。
本发明的再一目的在于提供上述肉桂叶残渣提取物的活性及其应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种肉桂叶残渣提取物的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)将提取挥发油后的肉桂叶残渣粉碎后过筛，得到肉桂叶残渣粉；
(2)向步骤(1)中得到的肉桂叶残渣粉中加入乙醇进行回流提取，所述乙醇体积分数为60％～90％，所述肉桂叶残渣粉与乙醇料液比为1:8～1:40，所述回流提取的温度为50～90℃；
(3)将步骤(2)中得到的提取液减压旋蒸浓缩得到浓缩液，所述减压旋蒸浓缩的温度为35～50℃；
(4)将步骤(3)中得到的浓缩液进行冷冻干燥后得到肉桂叶残渣提取物。
优选地，步骤(2)中所述溶剂为乙醇体积分数为80％，料液比为1:16，所述回流提取温度为60℃。
优选地，步骤(3)中所述减压旋蒸浓缩的温度为40℃。
优选地，步骤(2)中所述回流提取的次数为1～3次，每次1～3小时。
一种肉桂叶残渣提取物，通过上述方法制备得到。
上述肉桂叶残渣提取物的抗氧化、抗衰老及抗炎活性。
上述肉桂叶残渣提取物在制备抗氧化、抗衰老、抗炎药物或功能性食品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
(1)本发明利用提取挥发油后的肉桂叶残渣，为肉桂叶残渣的回收利用奠定基础，推动解决肉桂叶残渣带来的资源浪费问题和环境污染问题；
(2)本发明最终测得肉桂叶残渣提取物的总酚含量为233.7mg没食子酸/g提取物，即多酚质量分数为23.37％，而相似研究的多酚质量分数仅为10％左右；最终测得肉桂叶残渣提取物的总黄酮含量为530.0mg芦丁/g提取物，即黄酮质量分数为53.00％，而相似研究的黄酮质量分数仅为15％左右，本发明方法提取效率更高。
(3)本发明制备的肉桂叶残渣提取物具有良好的DPPH自由基清除能力和总还原能力，同时可显著降低D-半乳糖诱导衰老模型小鼠血清、肝脏和脑中的丙二醛(MDA)含量，并显著提高总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力和谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)活力，表明制备的肉桂叶残渣提取物具有抗氧化活性和抗衰老活性；肉桂叶残渣提取物可显著降低小鼠血清中的肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)水平，显著升高白细胞介素10(IL-10)，显著降低小鼠肝脏组织和脑组织中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活力和一氧化氮(NO)含量，且与阳性对照抗坏血酸组无显著性差异，表明肉桂叶残渣提取物具有抗炎能力；
(4)本发明制备的肉桂叶残渣提取物可应用于制备抗氧化、抗衰老、抗炎药物或功能性食品，为肉桂叶残渣的应用提供了新的理论依据，具有潜在巨大的社会效益和经济效益。
附图说明
图1～6为实施例1的不同提取条件下肉桂叶残渣提取物的总酚、总黄酮含量测定结果图；图1、图2分别为乙醇体积分数对总酚、总黄酮含量的影响；图3、图4分别为温度对总酚、总黄酮含量的影响；图5、图6分别为料液比对总酚、总黄酮含量的影响。
图7为实施例5的肉桂叶残渣提取物DPPH自由基清除率测定结果图。
图8为实施例6的肉桂叶残渣提取物的总还原能力测定结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
实施例1
肉桂叶残渣提取条件的优化，具体步骤如下：
(1)选取不同的条件提取肉桂叶残渣
10g肉桂叶残渣粉末溶于60％、70％、80％、90％乙醇溶液中，按料液比1:16于70℃下回流提取2次，每次2h，然后通过旋转蒸发仪浓缩、冷冻干燥后得到肉桂叶残渣提取物；
10g肉桂叶残渣粉末溶于80％乙醇溶液中，于50℃、60℃、70℃、80℃提取温度下，按料液比1:16回流提取2次，每次2h，然后通过旋转蒸发仪浓缩、冷冻干燥后得到肉桂叶残渣提取物；
10g肉桂叶残渣粉末溶于80％乙醇溶液中，按料液比1:8、1:16、1:24、1:32、1:40于60℃下回流提取2次，每次2h，然后通过旋转蒸发仪浓缩、冷冻干燥后得到肉桂叶残渣提取物；
(2)测定得到的各肉桂叶残渣提取物的总酚含量，具体测试方法：
取100μL用80％乙醇配制含不同浓度肉桂叶残渣提取物(0.1mg/mL,0.5mg/mL,1mg/mL,2mg/mL)的提取液，加入0.5mL福林酚试剂和6.9mL水，混合均匀，避光反应5min，后加入1.5mL的10％Na2CO3溶液，混匀后在室温下避光反应2h，在765nm下测定其吸光度。用不同浓度的没食子酸(20,40,60,80,100μg/mL)作为标准品，以吸光度为纵坐标、质量浓度为横坐标绘制没食子酸标准曲线，其回归方程为y＝0.0015x-0.0144(R2＝0.9993)。通过没食子酸标准曲线计算得肉桂叶残渣提取物的总酚含量。
(3)测定得到的各肉桂叶残渣提取物的总黄酮含量，具体测试方法：
取1mL用80％乙醇配制含不同浓度肉桂叶残渣提取物(0.1mg/mL,0.5mg/mL,1mg/mL,2mg/mL)的提取液于10mL比色管中，加入0.3mL的5％NaNO2溶液，静止反应6min后，加0.3mL的10％Al(NO3)3溶液，静止反应6min后，加4mL的4％NaOH，用乙醇定容至刻度，混匀后在室温反应15min，在510nm波长处测定吸光值。用不同浓度的芦丁(5,10,20,30,40,50μg/mL)作为标准品，以吸光度为纵坐标、质量浓度为横坐标绘制芦丁标准曲线，其回归方程为y＝10.5010x-0.0067(R2＝0.9993)。通过芦丁标准曲线计算得肉桂叶残渣提取物的总黄酮含量。
本实施例肉桂叶残渣提取物的总酚、总黄酮含量测定结果见图1～6。由图可知，最适的提取条件为：乙醇体积分数为80％、提取温度为60℃、料液比为1:16。
实施例2
本实施例的一种肉桂叶残渣提取物的制备方法，具体步骤如下：
(1)将提取挥发油后的肉桂叶残渣粉碎后过50目筛，得到肉桂叶残渣粉；
(2)向步骤(1)中得到的肉桂叶残渣粉中加入体积分数为80％的乙醇，料液比为1:16，60℃回流提取2次，每次2小时，合并提取液；
(3)将步骤(2)中得到的提取液40℃减压旋蒸浓缩，得到浓缩液；
(4)将步骤(3)中得到的浓缩液冷冻干燥后得到肉桂叶残渣提取物。
本实施例最终所得的肉桂叶残渣提取物的得率为11.6％。
实施例3
肉桂叶残渣提取物的总酚含量测定，采用福林酚比色法，具体步骤如下：
(1)按照实施例2中的方法制备肉桂叶残渣提取物；
(2)取100μL用80％乙醇配制含不同浓度肉桂叶残渣提取物(0.1mg/mL,0.5mg/mL,1mg/mL,2mg/mL)的提取液，加入0.5mL福林酚试剂和6.9mL水，混合均匀，避光反应5min，后加入1.5mL的10％Na2CO3溶液，混匀后在室温下避光反应2h，在765nm下测定其吸光度。用不同浓度的没食子酸(20,40,60,80,100μg/mL)作为标准品，以吸光度为纵坐标、质量浓度为横坐标绘制没食子酸标准曲线，其回归方程为y＝0.0015x-0.0144(R2＝0.9993)。通过没食子酸标准曲线计算得肉桂叶残渣提取物的总酚含量。
本实施例最终测得肉桂叶残渣提取物的总酚含量为233.7mg没食子酸/g提取物。即多酚质量分数为23.37％，而相似研究的多酚质量分数仅为10％左右，表明实施例2提取效率较高。
实施例4
测定肉桂叶残渣提取物的总黄酮含量，具体步骤如下：
(1)按照实施例2中的方法制备肉桂叶残渣提取物；
(2)取1mL用80％乙醇配制含不同浓度肉桂叶残渣提取物(0.1mg/mL,0.5mg/mL,1mg/mL,2mg/mL)的提取液于10mL比色管中，加入0.3mL的5％NaNO2溶液，静止反应6min后，加0.3mL的10％Al(NO3)3溶液，静止反应6min后，加4mL的4％NaOH，用乙醇定容至刻度，混匀后在室温反应15min，在510nm波长处测定吸光值。用不同浓度的芦丁(5,10,20,30,40,50μg/mL)作为标准品，以吸光度为纵坐标、质量浓度为横坐标绘制芦丁标准曲线，其回归方程为y＝10.5010x-0.0067(R2＝0.9993)。通过芦丁标准曲线计算得肉桂叶残渣提取物的总黄酮含量。
本实施例最终测得肉桂叶残渣提取物的总黄酮含量为530.0mg芦丁/g提取物。即黄酮质量分数为53.00％，而相似研究的黄酮质量分数仅为15％左右，表明实施例2提取效率较高。
实施例5
通过测定肉桂叶残渣提取物的DPPH自由基清除率评价其体外抗氧化活性，具体步骤如下：
(1)按照实施例2中的方法制备肉桂叶残渣提取物；
(2)取2mL用80％乙醇配制含不同浓度肉桂叶残渣提取物(20～120μg/mL)的提取液与4mL 0.15mmol/L DPPH乙醇溶液混合，摇匀、静置于黑暗处，30min后在波长517nm处测定其吸光度，记录吸光值A1；以无水乙醇代替2mL提取液，同上述方法测定，作为空白对照，记录吸光值A2；抗坏血酸作为阳性对照。DPPH自由基清除率的计算如公式(1)所示：
DPPH清除率(％)＝(1-A1/A2)×100 (1)
本实施例肉桂叶残渣提取物的DPPH自由基清除率测定结果见图7。在浓度为120μg/mL时肉桂叶残渣提取物的DPPH自由基清除率已达到80.7％，且100μg的肉桂叶残渣提取物与64μg的抗坏血酸作用效果相当，表明肉桂叶残渣提取物具有较强的体外抗氧化活性。
实施例6
通过采用普鲁士蓝法测定肉桂叶残渣提取物的总还原能力评价其体外抗氧化活性，具体步骤如下：
(1)按照实施例2中的方法制备肉桂叶残渣提取物；
(2)取1mL用80％乙醇配制含不同浓度肉桂叶残渣提取物(100～600μg/mL)的提取液，加入2.5mL的0.2M磷酸盐缓冲液(pH 6.6)、2.5mL的1％铁氰化钾溶液，混匀后在50℃水浴20min。取出后，冷却至室温，加入2.5mL的10％三氯乙酸溶液后混匀，将混合液在4000rpm下离心10min。吸取2.5mL上清液于测试管中，依次加入2.5mL蒸馏水和0.5mL的0.1％氯化铁溶液，混匀，室温反应10min，在700nm下测定其吸光度。用抗坏血酸作为阳性对照。吸光度越大代表总还原能力越强。
本实施例肉桂叶残渣提取物的总还原能力测定结果见图8。在浓度为500μg/mL时肉桂叶残渣提取物测试管吸光度已达到最大值，表明肉桂叶残渣提取物具有较强的体外抗氧化活性。
实施例7
肉桂叶残渣提取物的抗氧化动物试验采用D-半乳糖诱导小鼠衰老模型，具体步骤如下：
(1)按照实施例2中的方法制备肉桂叶残渣提取物；
(2)实验动物为60只SPF级7周龄健康的雄性BALB/c小鼠，小鼠分笼喂养于在光照周期为12h、温度恒定(25±2℃)的饲养室中，自由饮水摄食，适应性饲养一周后，随机分为6组，每组10只，用3％苦味酸溶液标记并称重。分组情况为：正常组、模型组、阳性对照抗坏血酸(100mg/kg/d)组、肉桂叶残渣提取物低剂量(50mg/kg/d)组、肉桂叶残渣提取物中剂量(100mg/kg/d)组、肉桂叶残渣提取物高剂量(200mg/kg/d)组；
(2)模型组和各个给药组的小鼠每日皮下注射D-半乳糖试剂，注射剂量为150mg/kg/d，持续8周，同时正常组注射同等剂量的生理盐水。注射D-半乳糖进行造模的同时，各个给药组分别按照对应的剂量灌胃，正常组和模型组则使用等量生理盐水灌胃。实验期间，小鼠均可自由饮水和摄食。小鼠每周重新称重一次，并按照新的体重计算来注射D-半乳糖试剂和灌胃。最后一次灌胃后，所有小鼠禁食，在保持空腹24h后将各组小鼠摘眼球取血，移入2mL离心管，3000r/min离心15min分离血清，-80℃保存。取血后立即处死，取肝脏和脑，使用4℃生理盐水清洗干净后用滤纸吸干并称重。称重完毕后放入-80℃冰箱，备用；
(3)小鼠脑和肝组织中各加入9倍质量的生理盐水，充分研碎使组织匀浆化，制成10％的脑组织匀浆和肝组织匀浆，3000r/min离心10min，取上清液待测；
(4)测定小鼠血清、肝脏匀浆和脑匀浆总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力、丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力。
本实施例肉桂叶残渣提取物的抗衰老活性结果见表1、表2和表3。
与正常组相比，模型组小鼠血清、肝脏和脑组织中的T-SOD活力、GSH-Px活力显著下降(P<0.05)，MDA含量显著上升(P<0.01)；而与模型组相比，肉桂叶残渣提取物低剂量组、中剂量组、高剂量组小鼠三种组织中的T-SOD活力、GSH-Px活力显著上升(P<0.05或P<0.01)，MDA含量显著下降(P<0.01)，其中，高剂量组小鼠血清、肝脏和脑组织中的GSH-Px活力显著高于阳性对照抗坏血酸组(P<0.05)，MDA含量显著低于抗坏血酸组(P<0.05)，表明肉桂叶残渣提取物可显著增强小鼠血清、肝脏和脑组织等部位抗氧化防御能力，且高剂量(200mg/kg/d)的肉桂叶残渣提取物作用效果最佳。
表1肉桂叶残渣提取物对D-半乳糖诱导衰老模型小鼠血清T-SOD、MDA、GSH-Px水平的影响
Figure BDA0003185247800000081
注：与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01；与抗坏血酸组相比，△P<0.05。
表2肉桂叶残渣提取物对D-半乳糖诱导衰老模型小鼠肝脏T-SOD、MDA、GSH-Px水平的影响
Figure BDA0003185247800000091
注：与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01；与抗坏血酸组相比，△P<0.05。
表3肉桂叶残渣提取物对D-半乳糖诱导衰老模型小鼠脑T-SOD、MDA、GSH-Px水平的影响
Figure BDA0003185247800000092
注：与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01。
实施例8
肉桂叶残渣提取物的抗炎动物试验采用D-半乳糖诱导小鼠衰老模型，具体步骤如下：
(1)按照实施例2中的方法制备肉桂叶残渣提取物；
(2)实验动物为60只SPF级7周龄健康的雄性BALB/c小鼠，小鼠分笼喂养于在光照周期为12h、温度恒定(25±2℃)的饲养室中，自由饮水摄食，适应性饲养一周后，随机分为6组，每组10只，用3％苦味酸溶液标记并称重。分组情况为：正常组、模型组、阳性对照抗坏血酸(100mg/kg/d)组、肉桂叶残渣提取物低剂量(50mg/kg/d)组、肉桂叶残渣提取物中剂量(100mg/kg/d)组、肉桂叶残渣提取物高剂量(200mg/kg/d)组；
(2)模型组和各个给药组的小鼠每日皮下注射D-半乳糖试剂，注射剂量为150mg/kg/d，持续8周，同时正常组注射同等剂量的生理盐水。注射D-半乳糖进行造模的同时，各个给药组分别按照对应的剂量灌胃，正常组和模型组则使用等量生理盐水灌胃。实验期间，小鼠均可自由饮水和摄食。小鼠每周重新称重一次，并按照新的体重计算来注射D-半乳糖试剂和灌胃。最后一次灌胃后，所有小鼠禁食，在保持空腹24h后将各组小鼠摘眼球取血，移入2mL离心管，3000r/min离心15min分离血清，-80℃保存。取血后立即处死，取肝脏和脑，使用4℃生理盐水清洗干净后用滤纸吸干并称重。称重完毕后放入-80℃冰箱，备用；
(3)小鼠脑和肝组织中各加入9倍质量的生理盐水，充分研碎使组织匀浆化，制成10％的脑组织匀浆和肝组织匀浆，3000r/min离心10min，取上清液待测；
(4)测定小鼠血清中肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素10(IL-10)水平以及肝脏匀浆和脑匀浆中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活力、一氧化氮(NO)含量。
本实施例肉桂叶残渣提取物的抗炎活性结果见表4、表5和表6。
与正常组相比，模型组小鼠血清中TNF-α、IL-1β水平显著上升(P<0.01)，IL-10水平显著下降(P<0.05)，模型组小鼠肝脏和脑组织中iNOS活力和NO含量显著上升(P<0.05或P<0.01)；而与模型组相比，肉桂叶残渣提取物低剂量组、中剂量组、高剂量组小鼠血清中的TNF-α、IL-1β水平显著下降(P<0.05或P<0.01)，IL-10水平显著上升(P<0.05或P<0.01)，小鼠肝脏组织和脑组织中iNOS活力和NO含量显著下降(P<0.05或P<0.01)，且与阳性对照抗坏血酸组无显著性差异(P>0.05)，表明肉桂叶残渣提取物可显著增强小鼠机体抗炎能力。
表4肉桂叶残渣提取物对D-半乳糖诱导衰老模型小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-10水平的影响
Figure BDA0003185247800000111
注：与正常组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与抗坏血酸组相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。
表5肉桂叶残渣提取物对D-半乳糖诱导衰老模型小鼠肝脏iNOS活力和NO含量的影响
Figure BDA0003185247800000112
***###
注：与正常组相比，P＜0.05，P＜0.01；与模型组相比，P＜0.05，P＜0.01；与抗坏血酸组相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。
表6肉桂叶残渣提取物对D-半乳糖诱导衰老模型小鼠脑组织iNOS活力和NO含量的影响
Figure BDA0003185247800000121
注：与正常组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与抗坏血酸组相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种肉桂叶残渣提取物的制备方法，其特征在于，包括如下制备步骤：
(1)将提取挥发油后的肉桂叶残渣粉碎后过筛，得到肉桂叶残渣粉；
(2)向步骤(1)中得到的肉桂叶残渣粉中加入乙醇进行回流提取，所述乙醇体积分数为80％，所述肉桂叶残渣粉与乙醇料液比为1:16，所述回流提取的温度为60℃；
(3)将步骤(2)中得到的提取液减压旋蒸浓缩得到浓缩液，所述减压旋蒸浓缩的温度为35～50℃；
(4)将步骤(3)中得到的浓缩液进行冷冻干燥后得到肉桂叶残渣提取物。
2.根据权利要求1所述的一种肉桂叶残渣提取物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述减压旋蒸浓缩的温度为40℃。
3.根据权利要求1所述的一种肉桂叶残渣提取物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述回流提取的次数为1～3次，每次1～3小时。
4.一种肉桂叶残渣提取物，其特征在于，通过权利要求1～3任一项所述的方法制备得到。
5.权利要求4所述的一种肉桂叶残渣提取物在制备抗氧化、抗衰老、抗炎药物中的应用。
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