CN104689106A - 一种提取游离氨基酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提取游离氨基酸的方法，该方法步骤如下：（1）将新鲜氨基酸供体用水洗净，烘干，剪成小段，用粉碎机粉碎，过滤，粉末备用；（2）称取粉碎后的氨基酸供体粉末，加入一定比例的提取溶剂，回流提取；（3）提取液过滤，加入高浓度乙醇至终浓度为75%；（4）离心，上清液沸水浴蒸干得浸膏，用乙醚脱脂和色素，沉淀加水加热溶解，趁热过滤除脂肪；（5）滤液定容，加入活性炭搅拌，过滤，即得游离氨基酸提取液，4℃保存备用，茚三酮比色法检测游离氨基酸含量。本发明通过采用回流提取的方法，操作简单、制作简单和样品用量少，不会破坏氨基酸的结构，获得了游离氨基酸，经茚三酮比色法测定，游离氨基酸含量为8.24mg/g。
Description
技术领域
本发明涉及一种提取游离氨基酸的方法，特别涉及一种应用阳离子树脂提取氨基酸的方法，属于生物技术领域。
背景技术
氨基酸是构成生物体蛋白质并同生命活动有关的最基本的物质，是在生物体内构成蛋白质分子的基本单位，与生物的生命活动有着密切的关系。它在抗体内具有特殊的生理功能，是生物体内不可缺少的营养成分之一。
氨基酸在医药上主要用来制备复方氨基酸输液，也用作治疗药物和用于合成多肽药物。目前用作药物的氨基酸有一百几十种，其中包括构成蛋白质的氨基酸有20种和构成非蛋白质的氨基酸有100多种。
由多种氨基酸组成的复方制剂在现代静脉营养输液以及“要素饮食”疗法中占有非常重要的地位，对维持危重病人的营养，抢救患者生命起积极作用，成为现代医疗中必不可少的医药品种之一。
谷氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸、L 一多巴等氨基酸单独作用治疗一些疾病，主要用于治疗肝病疾病、消化道疾病、脑病、心血管病、呼吸道疾病以及用于提高肌肉活力、儿科营养和解毒等。此外氨基酸衍生物在癌症治疗上出现了希望。
但是，目前对于从植物或蔬菜中提取游离氨基酸的研究，却存在很大的缺陷，现有的技术操作复杂，多为实验室分离提取，制备量小，很难满足市场的需求，因此，需要提供一种新的提取游离氨基酸的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种从芦根中提取游离氨基酸的方法，该方法具有操作简单、制作简单和样品用量少等特点。
本发明提供了一种提取游离氨基酸的方法，该方法步骤如下：
（1）将新鲜氨基酸供体用水冲洗干净，淋干水后，烘干，然后剪成小段，用粉碎机粉碎，过滤，过滤后的粉末备用；
（2）称取粉碎后的氨基酸供体粉末，加入一定比例的提取溶剂，水浴回流提取；
（3）提取液过滤，加入高浓度乙醇至终浓度为75%，除去水溶性多糖和蛋白质；
所述高浓度乙醇为95%乙醇；
（4）离心，上清液沸水浴蒸干得浸膏，用乙醚脱脂和色素；沉淀加水加热溶解，趁热过滤除脂肪；
（5）滤液定容至50ml，加入5g活性炭搅拌10min，过滤，即得游离氨基酸提取液，4℃保存备用，茚三酮比色法检测游离氨基酸含量。
优选的，所述步骤（1) 中所述烘干条件为60℃，恒温鼓风干燥箱内烘干6h～12h。
优选的，所述步骤（1) 中所述粉碎的氨基酸供体经40目筛子过滤，过滤后的粉末备用。
优选的，所述步骤（2) 中所述提取溶剂为水、95%乙醇溶液、75%乙醇溶液、50%乙醇溶液中的一种或多种。
优选的，所述步骤（2) 中氨基酸供体粉末与提取溶剂的比例为1:15-1:30；水浴回流提取的条件为50-90℃，水浴回流提取1-5h。
更优选的，所述步骤（2) 中提取溶剂为水。
更优选的，所述步骤（2) 中氨基酸供体粉末与水的比例为1:15，水浴回流提取的条件为60℃，水浴回流提取时间为2h。
进一步的，所述步骤（5) 中茚三酮比色法检测氨基酸供体中游离氨基酸的含量，以天冬氨酸为对照品。
本发明的有益效果是：本发明通过采用回流提取的方法，操作简单、制作简单和样品用量少，不会破坏氨基酸的结构，获得了游离氨基酸，经茚三酮比色法测定，游离氨基酸含量为8.24mg/g。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
以新鲜芦根为例进行详细说明。
实施例1
1.
芦根的前处理：
(1)将新鲜芦根用自来水冲洗干净，蒸馏水冲洗一次，淋干水后，60 ℃ 恒温鼓风干燥箱内烘干6h。
(2)然后剪成小段，用粉碎机粉碎，粉碎的芦根经40目筛子过滤，过滤后的粉末备用。
2.提取溶剂的选择：
水
95% 乙醇溶液
75% 乙醇溶液
50% 乙醇溶液
2.
提取游离氨基酸的步骤：
a)将新鲜芦根用自来水冲洗干净，蒸馏水冲洗一次，淋干水后，60 ℃ 恒温鼓风干燥箱内烘干6h～12h，然后剪成小段，用粉碎机粉碎；b）称取一定量的芦根粉末，加入一定比例的提取溶剂，水浴回流提取；c)提取液过滤，加入95%乙醇至终浓度为75%，除去水溶性多糖和蛋白质；d）离心，上清液沸水浴蒸干得浸膏，用乙醚脱脂和色素，沉淀加水加热溶解，趁热过滤除脂肪；e）滤液定容至50ml，加入5g活性炭搅拌10min，过滤，即得游离氨基酸提取液。4 ℃ 保存备用。
4.检测：
茚三酮比色法检测游离氨基酸含量。
标准曲线制备：准确吸取1mg/mL的天冬氨酸标准溶液0.0、0.05、0 .1、0 .2、0 .3、0.4、0.5mL (相当于0、50、100、200、300、400、500 ug氨基酸)，分别置于5mL刻度试管中，各加水补充至体积为800 ul，然后加入2%茚三酮乙醇溶液和磷酸盐缓冲溶液（pH为 8.04)各200 ul，混合均匀，于沸水浴上加热15min，冷却至室温，静置15min，加水定容至 5ml，摇匀。在570nm波长下，以试剂空白为对照测定其余各溶液的吸光度A。得回归方程
Y=0.2669X+0.0041 (R2=0.9974)，结果表明在100〜500ug范围内呈良好的线性关系。
5.正交试验设计：
表1因素与水平表
| 水平 | 料液比（g：ml） | 回流温度（℃） | 回流时间（h） |
| 1 | 1：15 | 60 | 1 |
| 2 | 1：20 | 70 | 2 |
| 3 | 1：25 | 80 | 3 |
表2 正交试验设计及结果
| 实验号 | 料液比（g：ml） | 回流温度（℃） | 回流时间（h） | 游离氨基酸含量（mg/g） |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 7.26 |
| 2 | 1 | 2 | 2 | 7.67 |
| 3 | 1 | 3 | 3 | 7.34 |
| 4 | 2 | 1 | 2 | 8.01 |
| 5 | 2 | 2 | 3 | 7.88 |
| 6 | 2 | 3 | 1 | 6.45 |
| 7 | 3 | 1 | 3 | 7.18 |
| 8 | 3 | 2 | 1 | 6.30 |
| 9 | 3 | 3 | 2 | 7.40 |
| K1 | 7.480 | 7.498 | 6.831 | |
| K2 | 7.478 | 7.340 | 7.734 | |
| K3 | 7.083 | 7.131 | 7.503 | |
| R | 0.407 | 0.364 | 0.930 |
由表2可以看出，影响游离氨基酸含量的因素主次顺序为:回流时间>料液比> 回流温度。最佳提取工艺为A1B1C2，即料液比为1:15，回流温度为60C，回流时间为2h。
6.验证实验：
按照优化后所得最佳工艺即加入15倍水，回流温度为60C，回流时间为2h进行提取，三次重复实验测得芦根游离氨基酸的平均含量为8.24mg/g，结果与正交表中的最优水平一致，说明本发明所确定的工艺合理。
实施例2-4
采用实施例1的提取方法，不同的只是改变了提取溶剂，提取溶剂的组成见表3。
表3不同提取溶剂提取效果的比较
| 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | ||
| 提取溶剂 | 水 | 95%乙醇溶液 | 75%乙醇溶液 | 50%乙醇溶液 |
| 吸光值 | 0.491 | 0.240 | 0.335 | 0.406 |
提取游离氨基酸，关键在于提取溶剂，从表3可见，提取溶剂水提取效果较好，因此提取溶剂优选为水。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种提取游离氨基酸的方法，其特征在于，该方法包括的步骤如下：
（1）将新鲜氨基酸供体用水冲洗干净，淋干水后，烘干，然后剪成小段，用粉碎机粉碎，过滤，过滤后的粉末备用；
（2）称取粉碎后的氨基酸供体粉末，加入一定比例的提取溶剂，水浴回流提取；
（3）提取液过滤，加入高浓度乙醇至终浓度为75%，除去水溶性多糖和蛋白质；
所述高浓度乙醇为95%乙醇；
（4）离心，上清液沸水浴蒸干得浸膏，用乙醚脱脂和色素，沉淀加水加热溶解，趁热过滤除脂肪；
（5）滤液定容至50ml，加入5g活性炭搅拌10min，过滤，即得游离氨基酸提取液，4℃保存备用，茚三酮比色法检测游离氨基酸含量。
2.根据权利要求1所述的一种提取游离氨基酸的方法，其特征在于，所述步骤（1) 中所述烘干条件为60℃，恒温鼓风干燥箱内烘干6h～12h。
3.根据权利要求1或2所述的一种提取游离氨基酸的方法，其特征在于，所述步骤（1) 中所述粉碎的氨基酸供体经40目筛子过滤，过滤后的粉末备用。
4.根据权利要求1所述的一种提取游离氨基酸的方法，其特征在于，所述步骤（2) 中所述提取溶剂为水、95%乙醇溶液、75%乙醇溶液、50%乙醇溶液中的一种或多种。
5.根据权利要求1或3所述的一种提取游离氨基酸的方法，其特征在于，所述步骤（2) 中氨基酸供体粉末与提取溶剂的比例为1:15-1:30；水浴回流提取的条件为50-90℃，水浴回流提取1-5h。
6.根据权利要求3所述的一种提取游离氨基酸的方法，其特征在于，所述步骤（2) 中提取溶剂为水。
7.根据权利要求4所述的一种提取游离氨基酸的方法，其特征在于，所述步骤（2) 中氨基酸供体粉末与水的比例为1:15，水浴回流提取的条件为60℃，水浴回流提取时间为2h。
8.根据权利要求1所述的一种提取游离氨基酸的方法，其特征在于，所述步骤（5) 中茚三酮比色法检测氨基酸供体中游离氨基酸的含量，以天冬氨酸为对照品。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105541528A (zh) * | 2015-12-04 | 2016-05-04 | 宜宾学院 | 一种利用白酒酒糟制备氨基酸的方法 |
| CN107596725A (zh) * | 2017-09-05 | 2018-01-19 | 安徽华健生物科技有限公司 | 一种鲜油橄榄果渣中游离氨基酸的提取方法 |
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- 2015-02-11 CN CN201510071401.0A patent/CN104689106A/zh active Pending
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| CN107596725A (zh) * | 2017-09-05 | 2018-01-19 | 安徽华健生物科技有限公司 | 一种鲜油橄榄果渣中游离氨基酸的提取方法 |
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