CN102430062B - 一种从芦根中提取游离氨基酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从芦根中提取游离氨基酸的方法，该方法为将新鲜芦根用水冲洗干净，烘干，粉碎；称取粉碎后的芦根粉末，加入提取溶剂，水浴回流提取；提取液过滤，加入95%乙醇至终浓度为75%；离心，上清液沸水浴蒸干得浸膏，用乙醚脱脂和色素；沉淀加水加热溶解，趁热过滤除脂肪；滤液定容，加入活性炭，过滤，即得游离氨基酸提取液，4℃保存备用，茚三酮比色法检测游离氨基酸含量。该方法采用水浴回流提取的方法从芦根中获得了游离氨基酸，具有操作简单、制作简单和样品用量少等特点，为芦根游离氨基酸的研究打下了基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种从芦根中提取游离氨基酸的方法。
背景技术
芦根为禾本科多年生草本植物芦苇的地下根茎，是一种较常用的中药材。性寒、味甘，归肺、胃经，具有清热、生津、除烦、止呕、利尿之功效。临床主要用于发烧、尿路感染、肺脓疡、支气管炎等病的治疗。芦根提取物对化学性肝损伤有良好的保护和恢复作用，近来有报道，其具有疏肝解郁的作用，所以研究其提取分离方法具有现实的意义，在保健品、饮食方面的运用极具潜力。我国适宜种植芦根的地域广阔，春末夏初或秋季均可采挖，洗净，切段，鲜用或晒干用，芦根产品市场很大，但芦根深加工技术还比较薄弱。
氨基酸是构成生物体蛋白质并同生命活动有关的最基本的物质，是在生物体内构成蛋白质分子的基本单位，与生物的生命活动有着密切的关系。它在抗体内具有特殊的生理功能，是生物体内不可缺少的营养成分之一。
氨基酸在医药上主要用来制备复方氨基酸输液，也用作治疗药物和用于合成多肽药物。目前用作药物的氨基酸有一百几十种，其中包括构成蛋白质的氨基酸有20种和构成非蛋白质的氨基酸有100多种。
由多种氨基酸组成的复方制剂在现代静脉营养输液以及“要素饮食”疗法中占有非常重要的地位，对维持危重病人的营养，抢救患者生命起积极作用，成为现代医疗中不可少的医药品种之一。
谷氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸、L－多巴等氨基酸单独作用治疗一些疾病，主要用于治疗肝病疾病、消化道疾病、脑病、心血管病、呼吸道疾病以及用于提高肌肉活力、儿科营养和解毒等。此外氨基酸衍生物在癌症治疗上出现了希望。
发明内容
本发明的目的是提供一种从芦根中提取游离氨基酸的方法，该方法具有操作简单、制作简单和样品用量少等特点。
本发明提供了一种从芦根中提取游离氨基酸的方法，该方法步骤如下：
（1）将新鲜芦根用自来水冲洗干净，蒸馏水冲洗一次，淋干水后，60℃恒温鼓风干燥箱内烘干6h~12h，然后剪成小段，用粉碎机粉碎，过滤后的粉末备用；（2）称取粉碎后的芦根粉末，加入一定比例的提取溶剂，水浴回流提取；（3）提取液过滤，加入95%乙醇至终浓度为75%，除去水溶性多糖和蛋白质；（4）离心，上清液沸水浴蒸干得浸膏，用乙醚脱脂和色素；沉淀加水加热溶解，趁热过滤除脂肪；（5）滤液定容至50ml，加入5g活性炭搅拌10min，过滤，即得游离氨基酸提取液，4℃保存备用，茚三酮比色法检测游离氨基酸含量。
本发明提供的从芦根中提取游离氨基酸的方法，所述步骤（1）中粉碎的芦根经40目筛子过滤，用过滤后的较细粉末进行提取以保证所需物质有效地提取出来。
本发明提供的从芦根中提取游离氨基酸的方法，所述步骤（2）中提取溶剂为水、95%乙醇溶液、75%乙醇溶液、50%乙醇溶液中的一种或多种（提取溶剂优选为水）；芦根粉末与提取溶剂的比例（料液比）为1:15-1:30（料液比优选为水）；水浴回流提取的条件为50-90℃水浴回流提取1-5h（优选为60℃水浴回流提取2h）。
本发明提供的从芦根中提取游离氨基酸的方法，所述步骤（5）中茚三酮比色法检测芦根中游离氨基酸的含量，以天冬氨酸为对照品。
本发明的有益效果是：通过本发明，获得了芦根游离氨基酸，经茚三酮比色法测定，游离氨基酸含量为8.24mg/g。
本发明采用回流提取的方法，首次从芦根中提取出游离氨基酸。
附图说明
图1是各因素对芦根游离氨基酸含量的影响。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1
1. 芦根的前处理：
（1）将新鲜芦根用自来水冲洗干净，蒸馏水冲洗一次，淋干水后，60℃恒温鼓风干燥箱内烘干6h。
（2）然后剪成小段，用粉碎机粉碎，粉碎的芦根经40目筛子过滤，过滤后的粉末备用。
2. 提取溶剂的选择：
水
95%乙醇溶液
75%乙醇溶液
50%乙醇溶液
3. 提取游离氨基酸的步骤：
a）将新鲜芦根用自来水冲洗干净，蒸馏水冲洗一次，淋干水后，60℃恒温鼓风干燥箱内烘干6h~12h，然后剪成小段，用粉碎机粉碎；b）称取一定量的芦根粉末，加入一定比例的提取溶剂，水浴回流提取；c）提取液过滤，加入95%乙醇至终浓度为75%，除去水溶性多糖和蛋白质；d）离心，上清液沸水浴蒸干得浸膏，用乙醚脱脂和色素；沉淀加水加热溶解，趁热过滤除脂肪；e）滤液定容至50ml，加入5g活性炭搅拌10min，过滤，即得游离氨基酸提取液。4℃保存备用。
4. 检测：
茚三酮比色法检测游离氨基酸含量。
标准曲线制备：准确吸取1mg/mL 的天冬氨酸标准溶液0.0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL（相当于0、50、100、200、300、400、500μg 氨基酸），分别置于5mL 刻度试管中，各加水补充至体积为800μl，然后加入2%茚三酮乙醇溶液和磷酸盐缓冲溶液（pH为8.04）各200μl，混合均匀，于沸水浴上加热15min，冷却至室温，静置15min，加水定容至5ml，摇匀。在570nm 波长下，以试剂空白为对照测定其余各溶液的吸光度A。得回归方程Y=0.2669X+0.0041（R2=0.9974），结果表明在100~500μg范围内呈良好的线性关系。
5. 正交试验设计：
表1 因素与水平表
| 水平 | 料液比(g:ml) | 回流温度(℃) | 回流时间(h) |
| 1 | 1:15 | 60 | 1 |
| 2 | 1:20 | 70 | 2 |
| 3 | 1:25 | 80 | 3 |
表2 正交试验设计及结果
| 试验号 | 料液比(g:ml) | 回流温度(℃) | 回流时间(h) | 游离氨基酸含量(mg/g) |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 7.27 |
| 2 | 1 | 2 | 2 | 7.77 |
| 3 | 1 | 3 | 3 | 7.43 |
| 4 | 2 | 1 | 2 | 8.03 |
| 5 | 2 | 2 | 3 | 7.89 |
| 6 | 2 | 3 | 1 | 6.54 |
| 7 | 3 | 1 | 3 | 7.19 |
| 8 | 3 | 2 | 1 | 6.63 |
| 9 | 3 | 3 | 2 | 7.43 |
| K1 | 7.490 | 7.497 | 6.813 | |
| K2 | 7.487 | 7.430 | 7.743 | |
| K3 | 7.083 | 7.133 | 7.503 | |
| R | 0.407 | 0.364 | 0.930 |
由表2可以看出，影响游离氨基酸含量的因素主次顺序为：回流时间＞料液比＞回流温度。最佳提取工艺为A1B1C2，即料液比为1:15，回流温度为60℃，回流时间为2h。
6. 验证实验：
按照优化后所得最佳工艺即加入15倍水，回流温度为60℃，回流时间为2h进行提取，三次重复实验测得芦根游离氨基酸的平均含量为8.24mg/g，结果与正交表中的最优水平一致，说明本发明所确定的工艺合理。
实施例2-4
采用实施例1的提取方法，不同的只是改变了提取溶剂，提取溶剂的组成见表3。
表3 不同提取溶剂提取效果的比较
| 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | ||
| 提取溶剂 | 水 | 95%乙醇溶液 | 75%乙醇溶液 | 50%乙醇溶液 |
| 吸光值 | 0.491 | 0.240 | 0.335 | 0.405 |
提取游离氨基酸，关键在于提取溶剂，从表3可见，提取溶剂水提取效果较好，因此提取溶剂优选为水。为芦根游离氨基酸的进一步研究奠定了基础。
Claims (3)
1.一种从芦根中提取游离氨基酸的方法，其特征在于：该方法步骤如下：
（1）将新鲜芦根用水冲洗干净，淋干水后，烘干，然后剪成小段，用粉碎机粉碎，过滤，过滤后的粉末备用；
所述烘干条件为60℃恒温鼓风干燥箱内烘干6h～12h；
所述粉碎的芦根经40目筛子过滤，过滤后的粉末备用；
（2）称取粉碎后的芦根粉末，加入一定比例的提取溶剂，水浴回流提取；
所述提取溶剂为水、95%乙醇溶液、75%乙醇溶液、50%乙醇溶液中的一种或多种；芦根粉末与提取溶剂的比例为1:15-1:30；水浴回流提取的条件为50-90℃水浴回流提取1-5h；
（3）提取液过滤，加入高浓度乙醇至终浓度为75%，除去水溶性多糖和蛋白质；
所述高浓度乙醇为95%乙醇；
（4）离心，上清液沸水浴蒸干得浸膏，用乙醚脱脂和色素；沉淀加水加热溶解，趁热过滤除脂肪；
（5）滤液定容至50ml，加入5g活性炭搅拌10min，过滤，即得游离氨基酸提取液，4℃保存备用，茚三酮比色法检测游离氨基酸含量。
2.按照权利要求1所述的从芦根中提取游离氨基酸的方法，其特征在于：所述步骤（2）中提取溶剂为水；芦根粉末与水的比例为1:15；水浴回流提取的条件为60℃水浴回流提取2h。
3.按照权利要求1所述的从芦根中提取游离氨基酸的方法，其特征在于：所述步骤（5）中茚三酮比色法检测芦根中游离氨基酸的含量，以天冬氨酸为对照品。
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