CN113604604A - 半夏issr分子标记方法及鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及半夏ISSR分子标记方法及鉴定方法。该分子标记方法包括以下步骤：提取半夏的基因组DNA及进行ISSR‑PCR扩增；其中，ISSR‑PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4任一所示。该方法能简单、快速的鉴定半夏种质资源，节约成本，能够为半夏的正确开发利用、合理保护保存提供理论依据，为半夏的驯化、培育和分类研究提供更多的理论参考。

Description

半夏ISSR分子标记方法及鉴定方法

技术领域

本申请涉及半夏鉴定技术领域，尤其涉及半夏ISSR分子标记方法及鉴定方法。

背景技术

半夏为天南星科半夏属的多年生草本植物。其块茎可入药，具有降脂、降压、抗肿瘤等显著功效，其历史悠久，是具有广阔前景的药用植物。随着野生资源的过度开发和破坏，人工栽培品种同时面临种质退化、品种混杂等问题，严重制约半夏市场供应和药用稳定性。ISSR(inter-simple sequence repeat)即简单重复序列区间扩增技术，作为当代重要的一种分子生物技术，能够从分子水平揭示品种遗传信息的变异情况。半夏作为湖北省道地药材，获国家农业部农产品地理标志登记保护，是天然优异品质、历史深厚积淀而成。遗传多样性是保护生物学研究的核心之一，是正确开发利用种质资源、合理保护种质资源的理论依据，是进行新品种培育、创新种质资源的理论基础，目前针对半夏的种质资源以及遗传多态性的研究还不够深入，建立一个相对科学合理的针对半夏的分子标记方法，有利于为后续的科学研究提供可靠的技术指导和理论支持。

发明内容

有鉴于此，本申请的目的在于提供一种半夏分子标记方法，以填补现有技术的空白。

第一方面，本申请实施例公开了一种半夏ISSR-PCR扩增方法，包括以下步骤：

采集半夏嫩叶，提取植物基因组DNA；

采用ISSR-PCR引物及反应体系进行PCR扩增；

其中，所述ISSR-PCR扩增的引物为如SEQ ID NO.1～5任一所示。

在本申请实施例中，所述ISSR-PCR扩增体系为：反应总体积为20μL，其中2×TaqMaster Mix为10.5μL，引物为2μL，模板DNA为1μL，ddH₂O为5.5μL；引物浓度为2.5ng/μL，模板DNA浓度为50ng/μL。

在本申请实施例中，当所述引物如SEQ ID NO.2所示时，所述ISSR-PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸至少30s，循环35次；94℃补充延伸10min。

第二方面，一种半夏鉴定方法，包括所述的ISSR-PCR扩增方法，以及利用所述的ISSR-PCR扩增结果，进行琼脂糖凝胶电泳，获得电泳条带；

根据不同半夏品种的电泳条带绘制其对应的指纹鉴定图谱；

根据所述指纹图谱与待鉴定的品种半夏的电泳条带确定所述待鉴定的品种半夏的多态性位点和产地。

在本申请实施例中，所述半夏品种产地包括江苏、河北、山东、贵州、四川、江西、湖北天门市、湖北荆州市、湖北仙桃市、湖北潜江市。

在本申请实施例中，所述指纹图谱由32个琼脂糖凝胶电泳条带绘制得到。

与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：

本申请中涉及公开了一种鉴定半夏种质资源的方法，该方法能简单、快速的鉴定半夏种质资源，节约成本，能够为半夏的正确开发利用、合理保护保存提供理论依据，为未来半夏的驯化、培育和分类研究提供更多的理论参考。

附图说明

图1为本申请实施例提供的以UBC876引物进行ISSR-PCR均匀设计试验的扩增结果；其中M泳道为marker；泳道1-12分别表示表2的12个处理组合；

图2为本申请实施例提供的以UBC876引物进行ISSR-PCR最佳退火温度的确定结果；M泳道为marker；1-8泳道分别对应温度分别为：60℃、58.4℃、55.9℃、52.1℃、47.3℃、43.8℃、41.3℃、40℃的电泳条带；

图3为本申请实施例提供的以UBC825引物对10个半夏样本进行ISSR-PCR优化反应体系后的扩增结果；M泳道为marker；A-J泳道分别为表4中对应的10个样品的ISSR-PCR产物的电泳条带；

图4为本申请实施例提供的以UBC848引物对10个半夏样本进行ISSR-PCR优化反应体系后的扩增结果；M泳道为marker；A-J泳道分别为表4中对应的10个样品的ISSR-PCR产物的电泳条带；

图5为本申请实施例提供的以UBC849引物对10个半夏样本进行ISSR-PCR优化反应体系后的扩增结果；M泳道为marker；A-J泳道分别为表4中对应的10个样品的ISSR-PCR产物的电泳条带；

图6为本申请实施例提供的以UBC876引物对10个半夏样本进行ISSR-PCR优化反应体系后的扩增结果；M泳道为marker；A-J泳道分别为表4中对应的10个样品的ISSR-PCR产物的电泳条带；

图7为本申请实施例提供的2个待测样本ISSR-PCR鉴定结果；M泳道marker；1-1、1-2、1-3、1-4泳道分别对应为待检测样本1，引物分别对应为为UBC848、UBC825、UBC849、UBC876；2-1、2-2、2-3、2-4泳道分别对应为待检测样本2，引物分别对应为UBC848、UBC825、UBC849、UBC876。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

1、DNA提取

收集江苏省、河北省、贵州省、山东省、四川省、江西省、湖北天门市、湖北省荆州市、湖北省仙桃市、湖北省潜江市10个地区的半夏种质资源，以植株幼嫩叶片为材料。液氮速冻后进行研磨，然后使用试剂盒法提取植物基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA质量，A260/A280比值在1.6～2.0之间，稀释至50ng/μL，-20℃保存。

2、ISSR引物筛选

以半夏基因组DNA为模板，采用哥伦比亚大学公布的100条ISSR引物，进行PCR扩增。

20μL反应体系：2×Taq Master Mix为10μL，引物为1μL，模板DNA为1μL，ddH2O为8μL。

PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，每个引物在理论退火温度下退火30s，72℃延伸30s，循环30-40次；补充延伸10min，4℃保存。用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，若能够扩增出清晰度较高的条带，则该引物可筛选为本申请实施例的ISSR-PCR引物，否则，将其剔除。

最终筛选得到如下5条引物：

UBC825：ACACACACACACACACT，如SEQ ID NO.1所示。

UBC848：CACACACACACACACARG，如SEQ ID NO.2所示。

UBC849：GTGTGTGTGTGTGTGTYA，如SEQ ID NO.3所示。

UBC876：GATAGATAGACAGACA，如SEQ ID NO.4所示。

3、ISSR-PCR反应体系优化

采用U12(4³)均匀设计表，筛选ISSR-PCR引物的最优反应体系，PCR扩增体系的因素水平见表1。以半夏基因组DNA为模板，UBC876为引物，利用表2中的12个反应体系进行ISSR-PCR扩增。PCR反应体系为20μL，扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，每个引物在理论退火温度(表3)下退火30s，72℃延伸30s，循环30-40次；补充延伸10min，4℃保存。用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

结果如图1所示，除实验序号2、3、10外，其他处理均没有扩增条带。其中序号3扩增条带较为清晰，且条带数多，是较为理想的处理。筛选出实验序号3为最佳体系，所以反应体系优化结果为20μL反应体系：Mix为10.5μL，引物为2μL，模板DNA为1μL，ddH2O为5.5μL。在此基础上进行各引物梯度PCR，筛选最佳退火温度。

表1因素水平表

水平	Mix(μL)	引物(μL)	DNA模板(μL)
				1(3,2,2)	7	0.5	0.5
2(3,4,4)	8.5	1	1
				3(4,4,2)	10	1.5	1.5
4(4,1,4)	10.5	2	2

表2均匀设计实验

4、ISSR-PCR引物退火温度筛选

以半夏基因组DNA为模板，采用优化后的反应体系，在伯乐PCR仪上进行梯度PCR扩增，确定各引物的最佳退火温度，梯度的设定以理论退火温度Tm±5℃进行设定，共8个温度梯度，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，筛选出清晰度高、稳定性好的条带，筛选出引物的最佳退火温度，结果见表3。

引物UBC876的梯度PCR扩增见图2。如图所示，温度过高时无扩增条带，温度过低时，有微弱扩增条带。当温度为43.8℃时，扩增条带明亮清晰，据此确定引物UBC876的最佳退火温度为43.8℃。其余引物的退火温度根据此方法确定，结果如表3所示。

表3引物及退火温度

引物编号	引物长度	理论退火温度	最佳退火温度
				UBC825	17	52.2℃	58.0℃
UBC848	17	56.2℃	61.0℃
				UBC849	17	53.9℃	57.2℃
UBC876	17	46.4℃	43.8℃

5、ISSR-PCR优化反应体系的验证

根据上述建立的ISSR-PCR优化反应体系及最佳退火温度，分别进行10份基因组DNA的PCR扩增，结果表明，均获得清晰稳定且多态性较为丰富的扩增条带，可应用于半夏的指纹鉴定图谱及遗传多样性分析。

6、不同产地半夏ISSR指纹图谱构建

对筛选出来的SEQ ID NO.1～4的4条引物，分别采用其对应的ISSR-PCR优化反应体系及最佳退火温度，分别以10个基因组DNA为模板，进行ISSR-PCR扩增。扩增产物的凝胶电泳结果以不同产地的半夏品种编号和条带存在位点编号为横、纵坐标，不同产地半夏品种的编号如表4所示。在每一横、纵坐标交结处记录半夏品种条带的检测结果，有条带标记为“1”，无条带则标记为“0”，即获得10个产地半夏的指纹鉴定图谱，如表5所示。每个产区的半夏在条带编号R1-32中的位点均具有特异性，可以作为10个产地半夏的指纹鉴定图谱。

表4半夏种质资源表

编号

A

B

C

D

E

F

G

H

I

J

地方

天门

江苏

河北

山东

贵州

四川

荆州

江西

仙桃

潜江

表5半夏的指纹鉴定图谱

7、进行待鉴定半夏的品种鉴定

利用上述ISSR-PCR反应体系，引物以及指纹图谱对不同的半夏品种进行鉴定，以证明本申请公开的方法鉴定准确性。

取两个待测样品按照上述方法构建的ISSR-PCR反应体系，将待测样品的ISSR指纹图谱与上述10个产地半夏的ISSR指纹图谱比较。待测样品的ISSR指纹图谱见表6。从表中可以看出，待测样品1与潜江地区的半夏ISSR指纹图谱一致，鉴定为潜江地区的半夏品种，而待测样品2与已构建的10个产地半夏的ISSR指纹图谱比较后，没有找到与之匹配的指纹图谱，证明不属于10个产区的半夏。

表6

以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北省农业科学院中药材研究所

<120> 半夏ISSR分子标记方法及鉴定方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

acacacacac acacact 17

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

cacacacaca cacacarg 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gtgtgtgtgt gtgtgtya 18

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gatagataga cagaca 16

Claims (6)

1.一种半夏ISSR分子标记方法，包括以下步骤：

采集半夏嫩叶，提取其基因组DNA；

采用ISSR-PCR引物及反应体系进行PCR扩增；

其中，所述ISSR-PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4任一所示。

2.根据权利要求1所述的分子标记方法，其特征在于，所述ISSR-PCR扩增体系为：反应总体积为20μL，其中2×Taq Master Mix为10.5μL，引物为2μL，模板DNA为1μL，ddH₂O为5.5μL；引物浓度为2.5ng/μL，模板DNA浓度为50ng/μL。

3.根据权利要求1所述的分子标记方法，其特征在于，当所述引物如SEQ ID NO.2所示时，所述ISSR-PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸至少30s，循环35次；94℃补充延伸10min。

4.一种半夏鉴定方法，包括权利要求1-3任一项所述的分子标记方法，以及利用所述ISSR-PCR的扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳，获得电泳条带；

根据所述电泳条带绘制其对应的指纹鉴定图谱；

根据所述指纹图谱与待鉴定的品种半夏的电泳条带确定所述待鉴定的品种半夏的多态性位点和产地。

5.根据权利要求4所述的半夏鉴定方法，其特征在于，所述半夏品种产地包括江苏、河北、山东、贵州、四川、江西、湖北天门市、湖北荆州市、湖北仙桃市、湖北潜江市。

6.根据权利要求4所述的半夏鉴定方法，其特征在于，所述指纹图谱由32个琼脂糖凝胶电泳条带绘制得到。

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