CN113527387A - 一种苦杏仁提取物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种苦杏仁提取物的制备方法，经S1苦杏仁预处理：将苦杏仁装入沸水中在冷却，S2脱脂处理：将冷却后的苦杏仁进行脱皮后粉碎，再和脱脂剂放置提取器中回流，S3超声提取：将脱脂苦杏仁粉末和甲醇进行超声处理，得到苦杏仁粗提物，S4正相柱层分离：苦杏仁粗提物与填料混合，得到粗提物‑填料拌样，以乙酸乙酯‑甲醇为洗脱剂，再减压蒸馏得到苦杏仁浓缩液，S5高速逆流色谱纯化：以乙酸乙酯、正丁醇、丁二醇作为纯化溶剂体系，经高速逆流色谱分离纯化得到苦杏仁提取物，使获得的苦杏仁苷转移率高达到86.41％，干膏收率高，达到11.47％，D型苦杏仁苷含量10.46mg/g及纯度98.6％。
Description
技术领域
本发明涉及植物提取领域，特别涉及一种苦杏仁提取物的制备方法。
背景技术
苦杏仁苷主要存在于苦杏、苦扁桃、桃、油桃、枇杷、李子、苹果、黑樱桃等果仁和叶子中，苦杏仁苷是一种氰苷类物质，分为D型和L型，前者有药理活性后者却没有。而D型苦杏仁苷在高温下会转变成L型从而失去药理活性，所以常规提取方式有可能会引起D型苦杏仁苷的异构化，而导致失活；目前关于苦杏仁苷的提取主要是煎煮、回流、超声等传统方法，专利“一种从苦杏仁中同时提取多种有效成分的方法”，CN102994222B，同时提取多种有效成分，而苦杏仁苷的含量较低，纯度较低，“一种苦杏仁苷的制备方法”，CN105461765B，其对D型和L型的苦杏仁苷分离方法中，得到的D型苦杏仁苷含量较低。
发明内容
鉴于此，本发明提出一种苦杏仁提取物的制备方法，解决上述问题。
本发明的技术方案是这样实现的：一种苦杏仁提取物的制备方法：包括以下步骤：
S1、苦杏仁预处理：将苦杏仁装入沸水中，煮3～8min，取出，放入冷水中冷却，得到冷却苦杏仁；在冷水中冷却有效去除苦杏仁中的氢氰酸，防止在提取时收到干扰；
S2、脱脂处理：将冷却后的苦杏仁进行脱皮后，粉碎至100～200目，得到苦杏仁粉末，按照质量体积比g/mL为1～5:28的苦杏仁粉末和脱脂剂放置提取器中于70～100℃回流2～8h，过滤，取出滤渣，于-25～-16℃下储藏，得到脱脂苦杏仁粉末；脱脂处理防止之后的超声破碎作用增大，避免细胞内大量不容物、淀粉颗粒及黏液质等混入提取液中，避免D型苦杏仁苷异构化，利于D型苦杏仁苷的提取；
S3、超声提取：取S2得到的脱脂苦杏仁粉末和甲醇进行超声处理20～60min，放冷，再加入甲醇再超声提取10～40min，经微孔滤膜过滤，得到滤液，即苦杏仁粗提物；超声时间10～40min，超声破碎作用适中，细胞内苦杏仁苷释放充分，使D型苦杏仁苷得率达到最大值；
S4、正相柱层分离：将苦杏仁粗提物与填料按质量比1～8:0.3～2.5的比例混合，得到粗提物-填料拌样，再将粗提物-填料拌样进行大孔树脂柱层析，以乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂，收集含有苦杏仁苷的洗脱溶剂，减压蒸馏得到苦杏仁浓缩液；
S5、高速逆流色谱纯化：配制纯化溶剂体系，震荡使溶液充分混合，放置2～5h，分相平衡后分出上相和下相，下相为固定相，上相为流动相，调整转速，将S4得到的苦杏仁浓缩液泵入流动相，减压回收含有苦杏仁苷的流份，干燥得到苦杏仁提取物。
进一步的，所述S1中的冷水温度为-10～-5℃。
进一步的，所述S2中脱脂剂由体积比为1～3:1～5:2～9的石油醚、甜扁桃油、香柑内酯混合制得，使用甜扁桃油和香柑内酯与石油醚混合，协同提高石油醚溶解脂肪的效率，而限定石油醚、甜扁桃油、香柑内酯的比例，使得脱脂剂达到更高效的溶脂效果。
进一步的，所述S3中超声条件为频率10～30kHz、强度0.7～0.9w/cm2。
进一步的，所述S3中苦杏仁粉末和甲醇的质量体积比g/mL为1～5:20。
进一步的，所述S4中乙酸乙酯-甲醇的体积比为40～80:10～30。
进一步的，所述S4中调节柱层析时的上样量为15.70～38.05mg/mL、流速为3～7mL/min。
进一步的，所述S5中纯化溶剂体系体积比为1～5:1～2:3～8的乙酸乙酯、正丁醇、丁二醇。
进一步的，所述S5中高速逆流色谱纯化的转速为300～400rpm，分离温度为18～23℃，流动相的流速为9～20mL/min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的苦杏仁提取物的制备方法，经苦杏仁预处理、脱脂处理、超声提取、正相柱层分离、高速逆流色谱纯化，使获得的苦杏仁苷转移率高，干膏收率高，D型苦杏仁苷含量及纯度较高；其中，经过冷水冷却，有效去除苦杏仁中的氢氰酸，防止在提取时收到干扰，脱脂处理后，防止之后的超声破碎作用增大，避免细胞内大量不容物、淀粉颗粒及黏液质等混入提取液中，避免D型苦杏仁苷异构化，利于D型苦杏仁苷的提取，超声提取中，和甲醇在一定的比例内限定超声时间、频率和强度，超声破碎作用适中，细胞内苦杏仁苷释放充分，使D型苦杏仁苷得率达到最大值；并且经高速逆流色谱纯化，得到的D型苦杏仁苷纯度更高。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种苦杏仁提取物的制备方法：包括以下步骤：
S1、苦杏仁预处理：将苦杏仁装入沸水中，煮3min，取出，放入-10℃的冷水中冷却，得到冷却苦杏仁；
S2、脱脂处理：将冷却后的苦杏仁进行脱皮后，粉碎至100目，得到苦杏仁粉末，按照质量体积比g/mL为1:28的苦杏仁粉末和脱脂剂放置提取器中于70℃回流2h，过滤，取出滤渣，于-25℃下储藏，得到脱脂苦杏仁粉末；脱脂剂由体积比为1:1:2的石油醚、甜扁桃油、香柑内酯混合制得；
S3、超声提取：取S2得到的脱脂苦杏仁粉末和甲醇进行超声处理20min，苦杏仁粉末和甲醇的质量体积比g/mL为1:20，放冷，再补入甲醇使苦杏仁粉末和甲醇的质量体积比g/mL保持在1:20，再超声提取10min，超声频率10kHz、强度0.7w/cm2，再经微孔滤膜过滤，得到滤液，即苦杏仁粗提物；
S4、正相柱层分离：将苦杏仁粗提物与填料按质量比1:0.3的比例混合，得到粗提物-填料拌样，再将粗提物-填料拌样进行大孔树脂柱层析，上样量为15.70mg/mL、流速为3mL/min，以体积比40:10的乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂，收集含有苦杏仁苷的洗脱溶剂，减压蒸馏得到苦杏仁浓缩液；
S5、高速逆流色谱纯化：配制体积比为1:1:3的乙酸乙酯、正丁醇、丁二醇作为纯化溶剂体系，震荡使溶剂体系充分混合，放置2h，分相平衡后分出上相和下相，下相为固定相，上相为流动相，转速为300rpm，分离温度为18℃，流动相的流速为9mL/min，将S4得到的苦杏仁浓缩液泵入流动相，减压回收含有苦杏仁苷的流份，干燥得到苦杏仁提取物。
实施例2
S1、苦杏仁预处理：将苦杏仁装入沸水中，煮8min，取出，放入-5℃的冷水中冷却，得到冷却苦杏仁；
S2、脱脂处理：将冷却后的苦杏仁进行脱皮后，粉碎至100～200目，得到苦杏仁粉末，按照质量体积比g/mL为5:28的苦杏仁粉末和脱脂剂放置提取器中于100℃回流8h，过滤，取出滤渣，于-16℃下储藏，得到脱脂苦杏仁粉末；脱脂剂由体积比为3:5:9的石油醚、甜扁桃油、香柑内酯混合制得；
S3、超声提取：取S2得到的脱脂苦杏仁粉末和甲醇进行超声处理60min，苦杏仁粉末和甲醇的质量体积比g/mL为5:20，放冷，再补入甲醇使苦杏仁粉末和甲醇的质量体积比g/mL保持在5:20，再超声提取40min，超声频率30kHz、强度0.9w/cm2，再经微孔滤膜过滤，得到滤液，即苦杏仁粗提物；
S4、正相柱层分离：将苦杏仁粗提物与填料按质量比8:2.5的比例混合，得到粗提物-填料拌样，再将粗提物-填料拌样进行大孔树脂柱层析，上样量为38.05mg/mL、流速为7mL/min，以体积比80:30的乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂，收集含有苦杏仁苷的洗脱溶剂，减压蒸馏得到苦杏仁浓缩液；
S5、高速逆流色谱纯化：配制体积比为5:2:8的乙酸乙酯、正丁醇、丁二醇作为纯化溶剂体系，震荡使溶剂体系充分混合，放置5h，分相平衡后分出上相和下相，下相为固定相，上相为流动相，转速为400rpm，分离温度为23℃，流动相的流速为20mL/min，将S4得到的苦杏仁浓缩液泵入流动相，减压回收含有苦杏仁苷的流份，干燥得到苦杏仁提取物。
实施例3
S1、苦杏仁预处理：将苦杏仁装入沸水中，煮5min，取出，放入-8℃的冷水中冷却，得到冷却苦杏仁；
S2、脱脂处理：将冷却后的苦杏仁进行脱皮后，粉碎至150目，得到苦杏仁粉末，按照质量体积比g/mL为3:28的苦杏仁粉末和脱脂剂放置提取器中于90℃回流6h，过滤，取出滤渣，于-20℃下储藏，得到脱脂苦杏仁粉末；脱脂剂由体积比为2:3:5的石油醚、甜扁桃油、香柑内酯混合制得；
S3、超声提取：取S2得到的脱脂苦杏仁粉末和甲醇进行超声处理40min，苦杏仁粉末和甲醇的质量体积比g/mL为3:20，放冷，再补入甲醇使苦杏仁粉末和甲醇的质量体积比g/mL保持在3:20，再超声提取25min，超声频率20kHz、强度0.8w/cm2，再经微孔滤膜过滤，得到滤液，即苦杏仁粗提物；
S4、正相柱层分离：将苦杏仁粗提物与填料按质量比5:1.5的比例混合，得到粗提物-填料拌样，再将粗提物-填料拌样进行大孔树脂柱层析，上样量为22.5mg/mL、流速为5mL/min，以体积比60:20的乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂，收集含有苦杏仁苷的洗脱溶剂，减压蒸馏得到苦杏仁浓缩液；
S5、高速逆流色谱纯化：配制体积比为3:1.5:5的乙酸乙酯、正丁醇、丁二醇作为纯化溶剂体系，震荡使溶剂体系充分混合，放置3h，分相平衡后分出上相和下相，下相为固定相，上相为流动相，转速为350rpm，分离温度为20℃，流动相的流速为15mL/min，将S4得到的苦杏仁浓缩液泵入流动相，减压回收含有苦杏仁苷的流份，干燥得到苦杏仁提取物。
实施例4
本实施例与实施例3的区别在于，所述S2中脱脂剂由体积比为2:3:5的石油醚、醋酸钠、氢氧化钠混合制得。
实施例5
本实施例与实施例3的区别在于，所述S2中脱脂剂由体积比为4:6:1的石油醚、甜扁桃油、香柑内酯混合制得。
实施例6
本实施例与实施例3的区别在于，所述S5中高速逆流色谱纯化的转速为200rpm，分离温度为25℃，流动相的流速为25mL/min。
实施例7
本实施例与实施例3的区别在于，所述S5中纯化溶剂体系体积比为6:1:1的乙酸乙酯、正丁醇、丁二醇。
对比例1
本对比例与实施例3的区别在于，所述S1步骤中未放入冷水中冷却。
对比例2
本对比例与实施例3的区别在于，未进行脱脂处理。
对比例3
本对比例预实施例3的区别在于，S3中苦杏仁粉末和甲醇的质量体积比为1:25。
一、指标测定
(一)按上述实施例1～7和对比例1～3制得的苦杏仁提取物，平均分成4份，每份150ml，分别在70℃下浓缩至相对密度在1.15-1.20，加乙醇醇沉至乙醇浓度为70％，分别在冰箱中和室温静置24h，测定苦杏仁苷转移率(即，醇沉后苦杏仁苷占浓缩前苦杏仁苷总量的百分比)及干膏收率。结果见表1。
表1：
结果表明，本发明的方法提取的苦杏仁提取物中苦杏仁苷的转移率较高，干膏收率也比较高，实施例1～7中，苦杏仁苷的转移率达到85％以上，干膏收率在10％以上，其中实施例3的转移率为93.41％，干膏收率为11.47％，与对比例1比较，将苦杏仁放入-10～-5℃的冷水中冷却，有效去除苦杏仁中的氢氰酸，防止在提取时收到干扰，与对比例2比较，先将苦杏仁脱脂处理后，利于苦杏仁苷的提取，与对比例3比较，说明提取溶剂和苦杏仁粉末之间的配比促进苦杏仁苷的提取效果；与实施例4、5比较，脱脂剂中，使用甜扁桃油和香柑内酯与石油醚混合，协同提高石油醚溶解脂肪的效率，而限定石油醚、甜扁桃油、香柑内酯的比例，使得脱脂剂达到更高效的溶脂效果。
(二)取上述实施例1～7和对比例1～3苦杏仁提取物，按照本发明的方法，选择210nm作为检测波长，测定苦杏仁提取物中的D型苦杏仁苷的含量和纯度，D型苦杏仁苷纯度＝D型苦杏仁苷含量/苦杏仁提取物总量×100％。
测定结果如下表2：
表2：
由上表2结果得知，本发明获得的D型苦杏仁苷含量较高，与对比例1比较，在冷水冷却后进行提取,有效去除苦杏仁中的氢氰酸，防止在提取时收到干扰，从而影响D型苦杏仁苷的纯度，与对比例2比较，脱脂处理后，防止D型苦杏仁苷异构化，从而获得的含量较高，与对比例3比较，苦杏仁粉末和甲醇在特定的质量体积比下，所得到的D型苦杏仁苷纯度较高，与实施例6、7比较，对高速逆流色谱纯化限定转速、温度和流速，以及对溶剂体系的配比调整，提高纯化的目标产物。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种苦杏仁提取物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、苦杏仁预处理：将苦杏仁装入沸水中，煮3～8min，取出，放入冷水中冷却，得到冷却苦杏仁；
S2、脱脂处理：将冷却后的苦杏仁进行脱皮后，粉碎至100～200目，得到苦杏仁粉末，按照质量体积比g/mL为1～5:28的苦杏仁粉末和脱脂剂放置提取器中于70～100℃回流2～8h，过滤，取出滤渣，于-25～-16℃下储藏，得到脱脂苦杏仁粉末；
S3、超声提取：取S2得到的脱脂苦杏仁粉末和甲醇进行超声处理20～60min，放冷，再补入甲醇再超声提取10～40min，经微孔滤膜过滤，得到滤液，即苦杏仁粗提物；
S4、正相柱层分离：将苦杏仁粗提物与填料按质量比1～8:0.3～2.5的比例混合，得到粗提物-填料拌样，再将粗提物-填料拌样进行大孔树脂柱层析，以乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂，收集含有苦杏仁苷的洗脱溶剂，减压蒸馏得到苦杏仁浓缩液；
S5、高速逆流色谱纯化：配制纯化溶剂体系，震荡使溶剂体系充分混合，放置2～5h，分相平衡后分出上相和下相，下相为固定相，上相为流动相，调整转速，将S4得到的苦杏仁浓缩液泵入流动相，减压回收含有苦杏仁苷的流份，干燥得到苦杏仁提取物。
2.如权利要求1所述的一种苦杏仁提取物的制备方法，其特征在于：所述S1中的冷水温度为-10～-5℃。
3.如权利要求1所述的一种苦杏仁提取物的制备方法，其特征在于：所述S2中脱脂剂由体积比为1～3:1～5:2～9的石油醚、甜扁桃油、香柑内酯混合制得。
4.如权利要求1所述的一种苦杏仁提取物的制备方法，其特征在于：所述S3中超声条件为频率10～30kHz、强度0.7～0.9w/cm2。
5.如权利要求1所述的一种苦杏仁提取物的制备方法，其特征在于：所述S3中苦杏仁粉末和甲醇的质量体积比g/mL为1～5:20。
6.如权利要求1所述的一种苦杏仁提取物的制备方法，其特征在于：所述S4中乙酸乙酯-甲醇的体积比为40～80:10～30。
7.如权利要求1所述的一种苦杏仁提取物的制备方法，其特征在于：所述S4中调节柱层析时的上样量为15.70～38.05mg/mL、流速为3～7mL/min。
8.如权利要求1所述的一种苦杏仁提取物的制备方法，其特征在于：所述S5中纯化溶剂体系体积比为1～5:1～2:3～8的乙酸乙酯、正丁醇、丁二醇。
9.如权利要求1所述的一种苦杏仁提取物的制备方法，其特征在于：所述S5中高速逆流色谱纯化的转速为300～400rpm，分离温度为18～23℃，流动相的流速为9～20mL/min。
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