CN113527379B - 一种从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法,该方法采用50%低浓度乙醇,进行闪提‑‑超声提取,过滤分离,得到大极性组分提取液,再用D101大孔吸附树脂反复吸附解吸3次,经水及不同浓度的乙醇洗脱,收集七叶皂苷流分,将第三次纯化的浓缩液放入器皿中,冷冻干燥后,白絮状物黏在器皿上,糖类等黄色物杂质黏在器皿底部,收集白絮状物,得到的七叶皂苷纯度到达96.5%以上。该方法简化了提取纯化步骤,节约了生产成本;操作简单、易于重复,适于实现标准工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法,属于医药技术领域。
背景技术
娑罗子(Aesculi)是《中国药典》收载的传统中药之一,中药娑罗子系指七叶树(Aesculus chinensis Bge.)、浙江七叶树(A esculus chinensis var.chekiangensisFang)和天师栗(A escul us wilsoniiRehd.)等的干燥成熟种子,此3种药用植物为我国特产。娑罗子性温、味甘,归肝、胃经,具有理气宽中和胃止痛之功效,主治胸腹胀闷、胃肮疼痛。
七叶皂苷是娑罗子提出物中重要的有效成分,七叶皂苷在抗炎、抗渗出、消肿胀等方面作用显著,能恢复毛细血管的正常通透性,增加静脉张力,改善微循环,对脑外伤和外周血管疾病有很高的治疗价值。目前,从娑罗子中提取七叶皂苷的技术还有待改进。
目前国内外七叶皂昔的现有提纯方法主要有:
(1)刘东锋等“一种超声波一微波协同萃取七叶皂苷的方法”,该方法通过脱脂、超声波一微波同时萃取、硅胶柱层析、丙酮洗涤、干燥等步骤获得七叶皂苷。该方法的较为复杂,提取物纯度较低,只有88%左右,同时需要用到用石油醚、正丁醇、丙酮等有毒溶剂。
(2)刘东锋等“一种从婆罗子中提取纯化七叶皂苷的方法“该方法通过脱脂、超声波萃取、膜分离、大孔树脂吸附、重结晶、干燥等步骤获得七叶皂苷。该方法得到七叶皂苷的纯度95%左右,但方法较为复杂,需要用到微滤膜,成本高,同时需要用到用乙醚、丙酮等有毒溶剂。
(3)路强强等“一种从婆罗子浸膏中提取纯化七叶皂苷的方法”该方法通过低分子醇溶解婆罗子浸膏,丙酮沉淀脱脂;纯水溶解后,大孔树脂吸附,乙醇洗脱;丙酮洗涤再脱色,真空干燥等步骤获得七叶皂苷。该方法的较为复杂,提取物纯度较低,只有85%左右,同时需要用到丙酮等有毒溶剂。
(4)石召华等“一种基于冷冻干燥从婆罗子中超高压提取七叶皂苷的方法”该方法通过先将婆罗子药材经粉碎、浸泡后进行冷冻干燥,然后再进行超高压提取。本发明通过将要罗子进行冷冻干燥处理,从而改变药材组织的内部构造,使细胞壁更容易破裂,婆罗子的成分更容易渗出。虽然婆罗子中七叶皂苷可以得到充分的提取,但提取物成分太过复杂,需要用到超高压提取装置,反复的升压、泄压,提高了七叶皂苷的提取成本,加大了七叶皂苷的纯化的难度。
发明内容
本发明提供一种从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法,全程无需使用丙酮、乙醚等有毒溶剂,只用到乙醇和乙醇水溶液,改善了操作环境,避免了环境污染;条件温和,不会破坏皂苷的结构,通过闪提和超声的结合及三次大孔吸附树脂的吸附,显著提高了七叶皂苷得率和纯度。
为解决上述技术问题,本发明所采用的技术方案如下:
一种从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法,包括以下步骤:
1)闪提--超声提取:
1.1)闪提提取:将婆罗子粉碎至40-200目,在室温条件下,加入体积浓度为50%的乙醇水溶液,乙醇水溶液的用量为每克婆罗子8~12ml,然后室温下依次进行正转提取和反转提取,正转提取为5000~15000r/min的正转下提取8~13min,反转提取为在5000~15000r/min的反转下提取8~13min,再静沉8~12min,移出上清液,得第一沉淀物和第一清液;
1.2)超声提取:包括第一超声提取和第二超声提取,第一超声提取为:向第一沉淀物中加入体积浓度为50%的乙醇水溶液,乙醇水溶液的用量为每克婆罗子5~7ml,超声提取25~35min,静沉8~12min,移出上清液,得第二沉淀物和第二清液;第二超声提取为:再向第二沉淀物中加入体积浓度为50%的乙醇水溶液,乙醇水溶液的用量为每克婆罗子3~5ml,超声提取25~35min,静沉沉8~12min,移出上清液,得第三沉淀物和第三清液;采用抽滤方法,滤出第三沉淀物中的液体至第三清液中,再将第三沉淀物用无水乙醇洗2-3次,合并第一清液、第二清液、第三清液和洗涤液,得七叶皂苷提取液;
2)提取液浓缩:将七叶皂苷提取液,减压浓缩至发泡,得七叶皂苷浓缩液;
3)大孔吸附树脂第一次吸附:将七叶皂苷浓缩液,加入到婆罗子质量5~7倍的大孔吸附树脂柱中吸附,用积浓度为25%的乙醇水溶液洗脱至近无色,弃去,再用无水乙醇冲洗柱子,并将无水乙醇洗脱液浓缩至发泡,即得第一次纯化的浓缩液;
4)大孔吸附树脂第二次吸附:将第一次用的树脂柱用蒸馏水洗到无醇味,将上述第一次纯化的浓缩液上柱吸附,用25%乙醇水溶液洗脱至近无色,弃去,再用无水乙醇冲洗柱子,将无水乙醇洗脱液浓缩至发泡,即得第二次纯化的浓缩液;
5)大孔吸附树脂第三次吸附:将第二次用的树脂柱用蒸馏水洗到无醇味,将第二次纯化的浓缩液上柱吸附,用35%乙醇水溶液洗脱至近无色,弃去,再用无水乙醇冲洗柱子,将无水乙醇洗脱液浓缩至发泡,即得第三次纯化的浓缩液;
6)冷冻干燥除色:将第三次纯化的浓缩液放入烧杯中,冷冻干燥后,白絮状物黏在烧杯壁上,黄色物杂质黏在烧杯底部,收集白絮状物为七叶皂苷。
上述方法采用50%低浓度乙醇水溶液,进行闪提--超声提取,过滤分离,得到大极性组分提取液,再用D101大孔吸附树脂反复吸附解吸3次,经水及不同浓度的乙醇水溶液洗脱,收集七叶皂苷流分,将第三次纯化的浓缩液放入器皿中,冷冻干燥后,白絮状物黏在器皿上,糖类等黄色物杂质黏在器皿底部,收集白絮状物,得到的七叶皂苷纯度到达96%以上,提取回收率在88.00%左右。该方法简化了提取纯化步骤,节约了生产成本;操作简单、易于重复,适于实现标准工业化生产。
本申请涉及的乙醇水溶液的浓度的均为乙醇的体积浓度。
上述整个过程,只用到乙醇,无需石油醚、丙酮、乙醚等溶剂,改善了操作环境,确保了操作人员的健康安全;条件温和,不会破坏皂苷的结构,通过闪提和超声的结合及三次大孔吸附树脂的吸附,显著提高了七叶皂苷得率和纯度,提高了提取效率。
为了进一步提高七叶皂苷的得率,步骤1)中,正转提取为:依次在4500~5500r/min下提取4~6min、在9500~10500r/min下提取2~4min、在14500~15500r/min下提取2~3min;反转提取为:依次在4500~5500r/min下提取4~6min、在9500~10500r/min下提取2~4min、在14500~15500r/min下提取2~3min。
为了进一步避免对七叶皂苷的破坏,同时提高七叶皂苷的得率,步骤1.2)中,第一超声提取和第二超声提取的超声频率均为53KHz,第一超声提取温度为38-44℃,第二超声提取温度为41-45℃。
为了提高得率,同时减少物料浪费,步骤1.2)中,每次洗涤第三沉淀物的无水乙醇的用量为每克婆罗子0.8~1.2ml。
为了提高操作效率,同时兼顾产品纯度,步骤2)中,将七叶皂苷提取液减压浓缩至原体积的30%-40%,得七叶皂苷浓缩液。
为了进一步避免对七叶皂苷的破坏,,步骤2)中,减压浓缩的压力为0.05~0.09MPa,温度为65~75℃。
为了兼顾产品得率和纯度,步骤3)中,大孔树脂为D101大孔树脂,七叶皂苷浓缩液吸附时流速为1-2mL/min,冲洗时无水乙醇用量为3-6倍柱体积,流速为8-10BV/h;步骤4)中,第一次纯化的浓缩液吸附时流速为1-2mL/min,冲洗时无水乙醇用量为3-6倍柱体积,流速为8-10BV/h;步骤5)中,第二次纯化的浓缩液吸附时流速为1-2mL/min,冲洗时无水乙醇用量为3-6倍柱体积,流速为8-10BV/h。
上述步骤3)-5)中,均浓缩至原体积的30%-40%。原体积中浓缩前的体积。
优选,步骤6)中,冷冻干燥温度为-35~-45℃,压力为10-20Pa。
本发明未提及的技术均参照现有技术。
本发明从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法,全程无需使用丙酮、乙醚等有毒溶剂,只用到乙醇,改善了操作环境,避免了环境污染;条件温和,不会破坏皂苷的结构;采用大孔树脂三次吸附洗脱,低醇上柱,不同浓度的乙醇洗脱,显著提高了除杂效果,且树脂可再生,降低了生产成本;通过闪提和超声的结合及三次大孔吸附树脂的吸附和冷冻干燥纯化,显著提高了七叶皂苷得率(>4%)和纯度(>96.5%);操作简单,成本低廉,利于工业化生产。
附图说明
图1为七叶皂苷HPLC的标准曲线图;
图2为不同乙醇浓度提取七叶皂苷的HPLC图;
图3为本发明所得七叶皂苷的色谱图;
具体实施方式
为了更好地理解本发明,下面结合实施例进一步阐明本发明的内容,但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
称200g娑罗子(浙江七叶树)粉碎至40-200目加到闪提-超声仪中,然后加入体积浓度为50%的乙醇水溶液2L,闪提提取(室温25℃):正转提取:在5000r/min提取5min、10000r/min提取3min、15000r/min提取2min;反转提取:在5000r/min提取5min、10000r/min提取3min、15000r/min提取2min;静沉10min,移出上清液,得第一沉淀物和第一清液;
再向第一沉淀物中加入到体积浓度为50%的乙醇水溶液1.2L,超声提取30min(38-44℃,53KHz),静沉10min,移出上清液,得第二沉淀物和第二清液;再向第二沉淀物中加入体积浓度为50%的乙醇水溶液0.8L超声提取30min(41-45℃),静沉10min,移出上清液,得第三沉淀物和第三清液;采用抽滤方法,滤出第三沉淀物中的液体至第三清液中,再将第三沉淀物用无水乙醇洗涤2次,每次洗涤无水乙醇用量为200ml,合并第一清液、第二清液、第三清液和洗涤液,得七叶皂苷提取液;从图2可看出,50%的乙醇浓度为最佳的。
减压浓缩(负压0.07Mpa,温度70℃)七叶皂苷提取液,浓缩至原体积的34%发泡,提取率24.759%(HPLC分析);
大孔吸附树脂吸附:第一次吸附:将浓缩液,加入2400g D101大孔吸附树脂柱中吸附0.75h,吸附时流速为1.5mL/min,用25%乙醇水溶液(体积浓度)洗脱至近无色,弃去,再用无水乙醇冲洗柱子,无水乙醇用量为4倍柱体积,流速为9BV/h,并将无水乙醇洗脱液浓缩,即得第一次纯化的浓缩液;第二次吸附:将第一次用的树脂柱用蒸馏水洗到无醇味,将上述第一次纯化的浓缩液加入树脂柱中吸附0.75h,吸附时流速为1.5mL/min,用25%乙醇水溶液(体积浓度)洗脱至近无色,再用无水乙醇冲洗柱子,无水乙醇用量为4倍柱体积,流速为9BV/h,并将无水乙醇洗脱液浓缩,即得第二次纯化的浓缩液;第三次吸附:将第二次用的树脂柱用蒸馏水洗到无醇味,将上述第二次纯化的浓缩液加入树脂柱中吸附0.75h,吸附时流速为1.5mL/min,用35%乙醇水溶液(体积浓度)洗脱至近无色,弃去,再用无水乙醇冲洗柱子,无水乙醇用量为4倍柱体积,流速为9BV/h,并将无水乙醇洗脱液浓缩,即得第三次纯化的浓缩液;冷冻干燥除色:将第三次纯化的浓缩液放入烧杯中,-40℃、15Pa下冷冻干燥后,白絮状物黏在烧杯壁上,黄色物杂质黏在烧杯底部,收集白絮状物共8.2612g,色谱图如图3所示。HPLC分析,纯度为97.5%。
实施例2
称0.5Kg娑罗子(浙江七叶树)粉碎至40-200目加到闪提-超声仪中,然后加入50%乙醇5L,闪提提取(室温25℃):正转提取:在5000r/min提取5min、10000r/min提取3min、15000r/min提取2min;反转提取:在5000r/min提取5min、10000r/min提取3min、15000r/min提取2min;静沉10min,移出上清液,得第一沉淀物和第一清液;
再向第一沉淀物中加入体积浓度为50%的乙醇水溶液3L,超声提取30min(38-43℃,53KHz),静沉10min,移出上清液,得第二沉淀物和第二清液;再向第二沉淀物中加入体积浓度为50%的乙醇水溶液2L超声提取30min(40-43℃,53KHz),静沉10min,移出上清液,得第三沉淀物和第三清液;采用抽滤方法,滤出第三沉淀物中的液体至第三清液中,再将第三沉淀物用无水乙醇洗涤2次,每次洗涤无水乙醇用量为500ml,合并第一清液、第二清液、第三清液和洗涤液,得七叶皂苷提取液;
减压浓缩(负压0.07Mpa,温度70℃)七叶皂苷提取液,浓缩至原体积的36%发泡,提取率24.454%(HPLC分析);
大孔吸附树脂吸附:第一次吸附:将浓缩液,加入到5000g D101大孔吸附树脂柱中吸附0.75h,吸附时流速为1.5mL/min,用25%乙醇水溶液(体积浓度)洗脱至近无色,弃去,再用无水乙醇冲洗柱子,无水乙醇用量为4倍柱体积,流速为9BV/h,将无水乙醇洗脱液浓缩,即得第一次纯化的浓缩液;第二次吸附:将第一次用的树脂柱用蒸馏水洗到无醇味,将上述第一次纯化的浓缩液加入树脂柱中吸附0.75h,吸附时流速为1.5mL/min,用25%乙醇水溶液(体积浓度)洗脱至近无色,再用无水乙醇冲洗柱子,无水乙醇用量为4倍柱体积,流速为9BV/h,将无水乙醇洗脱液浓缩,即得第二次纯化的浓缩液;第三次吸附:将第二次用的树脂柱用蒸馏水洗到无醇味,将上述第二次纯化的浓缩液加入树脂柱中吸附0.75h,吸附时流速为1.5mL/min,用35%乙醇水溶液(体积浓度)洗脱至近无色,弃去,再用无水乙醇冲洗柱子,无水乙醇用量为4倍柱体积,流速为9BV/h,将无水乙醇洗脱液浓缩,即得第三次纯化的浓缩液;将第三次洗脱液浓缩至2080mL,放入烧杯中,-40℃、15Pa下冷冻干燥,收集白絮状物共20.4917g,取出少部分样品用HPLC分析,纯度为96.5%。
Claims (9)
1.一种从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)闪提--超声提取:
1.1)闪提提取:将婆罗子粉碎至40-200目,在室温条件下,加入体积浓度为50%的乙醇水溶液,乙醇水溶液的用量为每克婆罗子8~12ml,然后室温下依次进行正转提取和反转提取,正转提取为5000~15000r/min的正转下提取8~13min,反转提取为在5000~15000r/min的反转下提取8~13min,再静沉8~12min,移出上清液,得第一沉淀物和第一清液;
1.2)超声提取:包括第一超声提取和第二超声提取,第一超声提取为:向第一沉淀物中加入体积浓度为50%的乙醇水溶液,乙醇水溶液的用量为每克婆罗子5~7ml,超声提取25~35min,静沉8~12min,移出上清液,得第二沉淀物和第二清液;第二超声提取为:再向第二沉淀物中加入体积浓度为50%的乙醇水溶液,乙醇水溶液的用量为每克婆罗子3~5ml,超声提取25~35min,静沉沉8~12min,移出上清液,得第三沉淀物和第三清液;采用抽滤方法,滤出第三沉淀物中的液体至第三清液中,再将第三沉淀物用无水乙醇洗2-3次,合并第一清液、第二清液、第三清液和洗涤液,得七叶皂苷提取液;
2)提取液浓缩:将七叶皂苷提取液,减压浓缩至发泡,得七叶皂苷浓缩液;
3)大孔吸附树脂第一次吸附:将七叶皂苷浓缩液,加入到婆罗子质量5~7倍的大孔吸附树脂柱中吸附,用积浓度为25%的乙醇水溶液洗脱至近无色,弃去,再用无水乙醇冲洗柱子,并将无水乙醇洗脱液浓缩至发泡,即得第一次纯化的浓缩液;
4)大孔吸附树脂第二次吸附:将第一次用的树脂柱用蒸馏水洗到无醇味,将上述第一次纯化的浓缩液上柱吸附,用25%乙醇水溶液洗脱至近无色,弃去,再用无水乙醇冲洗柱子,将无水乙醇洗脱液浓缩至发泡,即得第二次纯化的浓缩液;
5)大孔吸附树脂第三次吸附:将第二次用的树脂柱用蒸馏水洗到无醇味,将第二次纯化的浓缩液上柱吸附,用35%乙醇水溶液洗脱至近无色,弃去,再用无水乙醇冲洗柱子,将无水乙醇洗脱液浓缩至发泡,即得第三次纯化的浓缩液;
6)冷冻干燥除色:将第三次纯化的浓缩液放入烧杯中,冷冻干燥后,白絮状物黏在烧杯壁上,黄色物杂质黏在烧杯底部,收集白絮状物为七叶皂苷。
2.如权利要求1所述的从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法,其特征在于:步骤1)中,正转提取为:依次在4500~5500r/min下提取4~6min、在9500~10500r/min下提取2~4min、在14500~15500r/min下提取2~3min;反转提取为:依次在4500~5500r/min下提取4~6min、在9500~10500r/min下提取2~4min、在14500~15500r/min下提取2~3min。
3.如权利要求1或2所述的从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法,其特征在于:步骤1.2)中,第一超声提取和第二超声提取的超声频率均为53KHz,第一超声提取温度为38-44℃,第二超声提取温度为41-45℃。
4.如权利要求1或2所述的从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法,其特征在于:步骤1.2)中,每次洗涤第三沉淀物的无水乙醇的用量为每克婆罗子0.8~1.2ml。
5.如权利要求1或2所述的从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法,其特征在于:步骤2)中,将七叶皂苷提取液减压浓缩至原体积的30%-40%,得七叶皂苷浓缩液。
6.如权利要求1或2所述的从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法,其特征在于:步骤2)中,减压浓缩的压力为0.05~0.09MPa,温度为65~75℃。
7.如权利要求1或2所述的从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法,其特征在于:步骤3)中,大孔树脂为D101大孔树脂,七叶皂苷浓缩液吸附时流速为1-2mL/min,冲洗时无水乙醇用量为3-6倍柱体积,流速为8-10BV/h;步骤4)中,第一次纯化的浓缩液吸附时流速为1-2mL/min,冲洗时无水乙醇用量为3-6倍柱体积,流速为8-10BV/h;步骤5)中,第二次纯化的浓缩液吸附时流速为1-2mL/min,冲洗时无水乙醇用量为3-6倍柱体积,流速为8-10BV/h。
8.如权利要求1或2所述的从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法,其特征在于:步骤3)-5)中,浓缩至原体积的30%-40%。
9.如权利要求1或2所述的从婆罗子中提取分离纯化七叶皂苷的方法,其特征在于:步骤6)中,冷冻干燥温度为-35~-45℃,压力为10-20Pa。
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2021
- 2021-08-19 CN CN202110952983.9A patent/CN113527379B/zh active Active
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Also Published As
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