CN113512034A - 多信号荧光探针的合成及其同时区分Cys、SO2、GSH和Hcy的应用 - Google Patents

多信号荧光探针的合成及其同时区分Cys、SO2、GSH和Hcy的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过不同的激发与荧光发射信号同时区分检测半胱氨酸（Cys）、二氧化硫（SO2）、谷胱甘肽（GSH）和同型半胱氨酸（Hcy）的多信号荧光分子探针，该多信号分子探针的化学结构式如下：
Figure 306679DEST_PATH_IMAGE001
。该多信号荧光探针能在同一检测条件下利用探针与Cys、NaHSO3、GSH和Hcy发生不同的化学反应，生成不同的荧光物质，达到同时区分检测Cys、SO2、GSH和Hcy的目的。探针与Cys反应后在376 nm激发波长下发射464 nm的蓝光，与NaHSO3反应后在425 nm激发波长下发射520 nm的绿光，与GSH作用后在450 nm激发波长下发射536 nm的黄绿光，与Hcy作用后在490 nm激发波长下发射564 nm的橘光。该多信号荧光分子探针能够用于在体外环境中同时定量，在细胞中同时荧光成像Hcy、Cys、SO2和GSH。

Description

多信号荧光探针的合成及其同时区分Cys、SO2、GSH和Hcy的 应用
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种多信号荧光探针的合成，以及该探针在环境同时定量检测Cys、SO2、GSH和Hcy，在细胞内同时区分成像Cys、SO2、GSH和Hcy的应用。
背景技术
活性硫、活性氮和活性氧等生物活性分子在维持细胞内氧化还原的动态平衡中扮演着极其重要的角色。其中，作为细胞内活性分子中含量最高的活性硫组分（ReactiveSulfur Species：RSS），主要包括生物硫醇（半胱氨酸（Cys）、高半胱氨酸（Hcy）、谷胱甘肽（GSH））、二氧化硫（SO2），硫化氢（H2S）和N-乙酰半胱氨酸（NAC）等活性分子(Anal. Chem. 2018, 90, 533-555.)。哺乳动物中可以由蛋氨酸在多种酶辅助下合成Hcy，血清中Hcy的正常浓度为5-12 μM，正常细胞内Cys浓度为30-200 μM，GSH是细胞中最丰富的低分子量生物硫醇，正常浓度为0.5-10 mM，二氧化硫（SO2）作为含硫氨基酸的代谢产物，在生理条件下以亚硫酸盐（HSO3 -和SO3 2-）的形式存在于生物体中，血清中亚硫酸盐含量一般低于10 μM。生物硫醇在细胞新陈代谢中扮演着重要的角色，在癌症、阿兹海默症、帕金森病等患者中，细胞内硫醇的含量都高于正常水平，血液中生物硫醇的含量直接反映了生物体的健康状况。由于这四种活性硫物种具有相似的结构和反应活性，在细胞内存在Hcy转化为Cys，Cys转化为GSH这一生物代谢过程，其中一种含量的变化可能引起其他两者的关联变化，而且很多疾病的发生都与它们的含量变化密切相关。因此，开发高效的检测方法/技术用于同时区分检测Cys、SO2、GSH和Hcy这四种含硫化合物具有重要的意义。近年来，多信号荧光探针因其能够同时监测和可视化活细胞中的两种或多种分析物而受到广泛的关注但已报道的硫醇荧光探针还无法实现利用四通道同时区分检测Cys、SO2、GSH和Hcy这四种含硫化合物，发展同时区分Cys、SO2、GSH和Hcy的多信号荧光探针在分析检测、环境科学和生物化学等领域具有较大的应用价值。
发明内容
鉴于上述情况，克服一些现有技术的不足，本发明的目的在于提供一类利用四通道荧光信号同时区分检测Cys、SO2、GSH和Hcy的多信号荧光分子探针，用于制备在环境、食品中定量检测Cys、SO2、GSH和Hcy，在细胞内同时区分成像Cys、SO2、GSH和Hcy的器件的应用，为分析检测、环境科学等领域提供一些分析检测方法和思路。
本发明的目的还在于提供一种制备方法简单、多信号荧光分子探针的合成与应用方法。
本发明解决问题采取的具体技术方案为，一种多信号荧光探针的合成及其同时区分检测Cys、SO2、GSH和Hcy的应用，其探针的化学结构式如下：
Figure 658821DEST_PATH_IMAGE001
。
同时区分检测Cys、SO2、GSH和Hcy多信号荧光探针的合成，其特征在于，所述荧光分子探针的制备方法包括以下步骤：
步骤1. 合成4-羟基-7-（吡咯烷-1-基）-2H-色烯-2-酮
a. 将适量丙二酸二苯酯与3-（吡咯烷-1-基）苯酚加入无水甲苯中，100℃反应8-12小时，
b. 待反应冷至室温后过滤，固体用乙醚洗涤后真空干燥，得到灰绿色固体4-羟基-7-（吡咯烷-1-基）-2H-色烯-2-酮；
步骤2. 合成4-氯-2-氧代-7-（吡咯烷-1-基）-2H-亚甲基-3-甲醛
I．在氮气保护条件下，将适量干燥重蒸的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）缓慢加入等体积的三氯氧磷（POCl3）中，在20-50℃搅拌30分钟，得红色溶液，
II．将4-羟基-7-（吡咯烷-1-基）-2H-色烯-2-酮溶于适量N,N-二甲基甲酰胺中，逐滴加入到步骤I的混合溶液中，混合物继续在氮气保护下60℃搅拌反应12小时，
III．将步骤II中的反应液倒入适量冰水中，用20%的NaOH溶液调节pH至5~6，产生大量沉淀，过滤，固体用适量去离子水洗涤3次，真空干燥，得4-氯-2-氧代-7-（吡咯烷-1-基）-2H-亚甲基-3-甲醛；
步骤3.合成4-（丁硫基）-2-氧代-7-（吡咯烷-1-基）-2H-亚甲基-3-甲醛
i.将4-氯-2-氧代-7-（吡咯烷-1-基）-2H-亚甲基-3-甲醛和正丁硫醇溶于二氯甲烷中，滴加适量三乙胺，室温搅拌反应，
ii. 将步骤
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE002
中反应液柱层析纯化得4-（丁硫基）-2-氧代-7-（吡咯烷-1-基）-2H-亚甲基-3-甲醛；
步骤4. 合成多信号荧光探针（E）-2-（苯并[d]噻唑-2-基）-3-（4-（丁硫基）-2-氧代-7-（吡咯烷-1-基）-2H-吡喃-3-基）丙烯腈
A. 4-（丁硫基）-2-氧代-7-（吡咯烷-1-基）-2H-亚甲基-3-甲醛和相应的2-（苯并[d]噻唑-2-基）乙腈加入适量无水乙醇中，加入适量对甲苯磺酸，室温搅拌反应，
B. 反应完毕后，过滤，将所得固体真空干燥，得权利要求1所述的多信号荧光分子探针。
本发明的多信号荧光分子探针同时区分检测Cys、SO2、GSH和Hcy使用方法：无特殊说明，通常在室温下将探针分子溶解在有机相和水相体积比为5:5的环境下用于分析检测，有机相为二甲基亚砜(DMSO)，水相为pH = 7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)和分析物的水溶液。具体特征如下：该分子荧光探针用二甲基亚砜(DMSO)溶解，探针分子溶解在有机相和水相(5:5,v/v)溶液中，与Cys室温反应15分钟后，在376 nm激发波长下发射464 nm的强蓝色荧光；与NaHSO3室温反应15分钟后，在425 nm激发波长下发射520 nm的强绿色荧光；与GSH作用15分钟后，在450 nm激发波长下发射536 nm的黄绿色荧光；与Hcy作用15分钟后，在490nm激发波长下发射564 nm的橘色荧光。探针本身无明显荧光，而且检测Cys时用376 nm激发才会产生强蓝色荧光，用检测NaHSO3/GSH/Hcy的激发波长(425/450/490 nm)激发时无荧光或荧光很弱，其他三者也是如此。因此实现特定激发与荧光发射信号检测特定分析物，当四者均存在时，利用不同的激发和荧光发射信号也能很好地将四者区分。上述荧光分子探针实现了在同一检测条件下同时区分检测Cys、NaHSO3、GSH和Hcy，对其他常见氨基酸、活性氧和活性氮物种均无明显响应，对Cys、NaHSO3、GSH和Hcy的检测限分别为0.0132、0.0757、0.0231和0.0218 μM。因此，本发明公开的多信号荧光分子探针能够实现对四者的高灵敏区分检测。
附图说明
图1为本发明所述的多信号荧光探针检测Cys、NaHSO3、GSH和Hcy的荧光光谱图。
图2为本发明的多信号荧光探针的核磁共振氢谱图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的说明。
本发明所述的多信号荧光分子探针的合成路线如下所示：
Figure 350834DEST_PATH_IMAGE003
实施例1. 合成4-羟基-7-（吡咯烷-1-基）-2H-色烯-2-酮
a.丙二酸二苯酯（6.28 g，24.51 mmol）和3-（吡咯烷-1-基）苯酚（2 g，12.25mmol）加入无水甲苯（20 mL）中，将反应混合物加热至110℃反应8小时，
b. 反应完成后，过滤，滤饼用正己烷洗涤3次，真空干燥得到浅黄色固体4-羟基-7-（吡咯烷-1-基）-2H-色烯-2-酮（2.0 g，68％产率）。
实施例2. 合成4-氯-2-氧代-7-（吡咯烷-1-基）-2H-亚甲基-3-甲醛
Figure DEST_PATH_IMAGE004
．在氮气保护条件下，将1.8 mL干燥重蒸的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）缓慢加入等体积的三氯氧磷（POCl3）中，在20-50℃下搅拌30分钟，得红色溶液，
Figure 25529DEST_PATH_IMAGE005
．将4-羟基-7-（吡咯烷-1-基）-2H-色烯-2-酮(1.0 g, 4.32 mmol)溶于5 mL N,N-二甲基甲酰胺中，逐滴加入到步骤
Figure 985132DEST_PATH_IMAGE004
的混合溶液中，混合物继续在氮气保护下60℃搅拌反应12小时，
Figure DEST_PATH_IMAGE006
．待反应完全后，将步骤
Figure 414976DEST_PATH_IMAGE005
中的反应液缓慢倒入500 mL冰水中，用20%的NaOH溶液调节pH至6，产生大量沉淀，过滤，滤饼用适量去离子水洗涤3次，将所得固体真空干燥，得4-氯-2-氧代-7-（吡咯烷-1-基）-2H-亚甲基-3-甲醛
0.74 g，产率为62%。
实施例3. 合成4-（丁硫基）-2-氧代-7-（吡咯烷-1-基）-2H-亚甲基-3-甲醛
Figure 594285DEST_PATH_IMAGE002
. 将0.20 g（720.19 mmol）4-氯-2-氧代-7-（吡咯烷-1-基）-2H-亚甲基-3-甲醛和正丁硫醇64.95 mg（720.19 mmol）加入20 mL无水二氯甲烷中，再滴加70 μL三乙胺，室温搅拌反应，
Figure 807092DEST_PATH_IMAGE007
. 待反应完全后，将步骤
Figure 450563DEST_PATH_IMAGE002
中反应液柱层析得4-（丁硫基）-2-氧代-7-（吡咯烷-1-基）-2H-亚甲基-3-甲醛。
实施例4. 合成多信号荧光探针（E）-2-（苯并[d]噻唑-2-基）-3-（4-（丁硫基）-2-氧代-7-（吡咯烷-1-基）-2H-吡喃-3-基）丙烯腈
将4-（丁硫基）-2-氧代-7-（吡咯烷-1-基）-2H-亚甲基-3-甲醛（0.20 g，0.603mmol）和2-（苯并[d]噻唑-2-基）乙腈（137 mg，0.664 mmol）加入到20 mL无水乙醇中，加入适量对甲苯磺酸，反应混合物在室温搅拌过夜。反应完成后，过滤并用冷乙醇洗涤滤饼，固体在真空下干燥，得到红色产物（E）-2-（苯并[d]噻唑-2-基）-3-（4-（丁硫基）-2-氧代-7-（吡咯烷-1-基）-2H-吡喃-3-基）丙烯腈。
实施例5. 多信号荧光分子探针在体外环境中区分检测Cys、SO2、GSH和Hcy的应用
本发明所述的多信号荧光分子探针光谱性质实验：将探针溶解在二甲基亚砜(DMSO)中配置成浓度为1 mM的探针溶液，分别配置浓度为1 mM的Cys、NaHSO3（SO2在生理条件下主要以亚硫酸盐的形式存在）、GSH和Hcy水溶液。具体测试方式为：取20 μL的1 mM的探针溶液，980 μL的分析纯DMSO，所需量的1mM的Cys/NaHSO3/GSH/Hcy水溶液和所需量的PBS缓冲水溶液于2 mL的样品管中，所有测试均保持有机相和水相的体积比为5:5 (每一个测试样品总体积为2 mL)，例如当要求测试GSH浓度为20 μM时探针与GSH反应后的荧光强度，配制样品情况为：取20 μL的1 mM的探针溶液，980 μL的分析纯DMSO，40 μL的1 mM的GSH水溶液和960 μL的PBS缓冲溶液于2 mL的样品管中，室温下震荡摇匀15分钟后即可用450 nm的激发波长测量其荧光发射强度，其他测试操作与上述步骤类似。该多信号探针分子实现了用不同的激发波长和荧光发射信号区分检测Cys、NaHSO3、GSH和Hcy这四种活性硫物种，具有很高的灵敏度，检测限分别低至0.0132、0.0757、0.0231和0.0218 μM，非常适合活细胞内源性Cys、NaHSO3、GSH和Hcy的成像分析。
本发明的多信号荧光探针的合成及其同时区分检测Cys、NaHSO3、GSH和Hcy的应用，发展了一种高效简单的同时区分4种含硫化合物的多信号的探针，基于同一探针、同一检测条件下利用探针与Cys、NaHSO3、GSH和Hcy发生不同的化学反应，生成不同的荧光物质，从而在特定激发波长下发射蓝、绿、黄、橘四种颜色的荧光，达到同时区分检测的目的，在同时定量分析这四种含硫化合物中具有巨大的应用前景。希望为今后的多信号荧光探针的发展提供一些思路。尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细的介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，具有本文所述技术特征的多信号荧光探针的合成及其同时区分Cys、SO2、GSH和Hcy的应用，均落入本专利的保护范围。

Claims (4)

1.同时区分Cys、SO2，GSH和Hcy的多信号荧光探针，其特征在于，所述的荧光分子探针的化学结构式如下所示：
Figure 214556DEST_PATH_IMAGE001
。
2.如权利要求1所述的多信号荧光探针的合成，其特征在于，所述荧光分子探针的制备方法包括以下步骤：
步骤1. 合成4-羟基-7-（吡咯烷-1-基）-2H-色烯-2-酮
a. 将适量丙二酸二苯酯与3-（吡咯烷-1-基）苯酚加入无水甲苯中，100℃反应8-12小时，
b. 待反应冷至室温后过滤，固体用乙醚洗涤后真空干燥，得到灰绿色固体；
步骤2. 合成4-氯-2-氧代-7-（吡咯烷-1-基）-2H-亚甲基-3-甲醛
I．在氮气保护条件下，将适量干燥重蒸的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）缓慢加入等体积的三氯氧磷（POCl3）中，在20-50℃搅拌30分钟，得红色溶液，
II．将4-羟基-7-（吡咯烷-1-基）-2H-色烯-2-酮溶于适量N,N-二甲基甲酰胺中，逐滴加入到步骤I的混合溶液中，混合物继续在氮气保护下60℃搅拌反应12小时，
III．将步骤II中的反应液倒入适量冰水中，用20%的NaOH溶液调节pH至5~6，产生大量沉淀，过滤，固体用适量去离子水洗涤3次，真空干燥，得4-氯-2-氧代-7-（吡咯烷-1-基）-2H-亚甲基-3-甲醛；
步骤3.合成4-（丁硫基）-2-氧代-7-（吡咯烷-1-基）-2H-亚甲基-3-甲醛
i.将4-氯-2-氧代-7-（吡咯烷-1-基）-2H-亚甲基-3-甲醛和正丁硫醇溶于二氯甲烷中，滴加适量三乙胺，室温搅拌反应，
ii. 将步骤
Figure DEST_PATH_IMAGE002
中反应液柱层析纯化得4-（丁硫基）-2-氧代-7-（吡咯烷-1-基）-2H-亚甲基-3-甲醛；
步骤4. 合成多信号荧光探针（E）-2-（苯并[d]噻唑-2-基）-3-（4-（丁硫基）-2-氧代-7-（吡咯烷-1-基）-2H-吡喃-3-基）丙烯腈
A. 4-（丁硫基）-2-氧代-7-（吡咯烷-1-基）-2H-亚甲基-3-甲醛和相应的2-（苯并[d]噻唑-2-基）乙腈加入适量无水乙醇中，适量对甲苯苯磺酸，室温搅拌反应，
B. 反应完毕后，过滤，将所得固体真空干燥，得权利要求1所述的多信号荧光分子探针。
3.如权利要求2所述的多信号荧光探针的合成，其特征在于，所述步骤A的4-（丁硫基）-2-氧代-7-（吡咯烷-1-基）-2H-亚甲基-3-甲醛和2-（苯并[d]噻唑-2-基）乙腈的摩尔比为1:1.1-1.2。
4.如权利要求1所述的多信号荧光探针同时区分Cys、SO2和GSH和Hcy的应用，其特征在于，所述的荧光分子探针能够制备在环境中定量检测Cys、SO2、GSH和Hcy，在细胞内同时区分成像Cys、SO2、GSH和Hcy的器件的应用。
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